Luận văn tốt nghiệp
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 TỔNG QUAN VỀ ENZYME UREASE
1.1.1 Giới thiệu chung về enzyme urease [2, 7, 77, 92]
Urease có tên hệ thống là carbamine amidohydrolase, là enzyme xúc tác quá trình
thủy phân urea thành ammonia và khí cacbonic. Nó thuộc nhóm enzyme hydrolase
(enzyme thủy phân).
Trong bảng phân loại enzyme theo quy ước quốc tế, urease mang mã số EC 3.5.1.5
trong đó: số 3 chỉ nhóm chính-hydrolase, số 5 chỉ nhóm phụ enzyme tác dụng lên liên kết C-
N, khác liên kết peptid, số 1 chỉ phân nhóm phụ cắt các amid thẳng (amidohydrolase), số 5
chỉ số thứ tự của urease trong phân nhóm phụ.
Hình 1.1: Enzyme urease
1
Luận văn tốt nghiệp
Như vậy, từ tên kí hiệu quốc tế của urease, ta có thể biết được nó là enzyme thủy
phân thuộc nhóm amidase, xúc tác phản ứng thủy phân liên kết C-N, không phải liên kết
peptid.
Urease lần đầu tiên được J.B.Sumner tách chiết và kết tinh từ đậu rựa (jack bean -
Canavalia ensiformis) vào năm 1926.
Hiện nay, urease từ đậu rựa là loại urease được sử dụng nhiều nhất.
1.1.2 Cấu tạo
Bình thường urease tồn tại ở dạng tinh thể 8 cạnh, trong suốt không màu, có đường
kính tùy phương pháp chiết tách và có khối lượng cũng như hình dạng khác nhau tùy vào
nguồn thu nhận [7].
Hình 1.2: Tinh thể urease được J.B.Sumner tách chiết và kết tinh.
Urease là một enzyme cấu trúc bậc 4. Mỗi phân tử enzyme có từ 3 – 4 tâm hoạt
động. Các nghiên cứu đã chứng minh rằng có sự hiện diện của các nhóm –SH tại trung tâm
hoạt động. Các nhóm này đóng vai trò rất quan trọng đối với khả năng xúc tác của urease:
góp phần trong việc hình thành phức chất enzyme – cơ chất, kết hợp cơ chất với các
cofactor của enzyme, duy trì cấu trúc không gian của enzyme để đảm bảo hoạt lực xúc tác.
Các nghiên cứu cho thấy rằng hoạt tính của urease giảm khá nhiều nếu như các nhóm –SH
của nước là cầu
nối giữa ion Ni
2+
- 2 với nguyên tử C trong nhóm carbonyl của urea. Ở giai đoạn sau, trong
phức hợp enzyme – cơ chất sẽ diễn ra sự chuyển dòch điện tử và kết quả là ammoniac được
giải phóng kết hợp với acid carbamic để tạo thành ammonia carbamate, kèm theo là sự tái
cấu trúc lại trung tâm hoạt động của enzyme.
Như vậy, vai trò của 2 ion kim loại Ni
2+
là rất quan trọng trong việc tạo liên kết giữa
enzyme với cơ chất ở giai đoạn tạo phức chất trung gian. Đây chính là một cofactor của
urease.
Trong thực tế, nhiều nghiên cứu đã chứng minh, trong phản ứng thủy phân urea dưới
sự xúc tác của enzyme urease, sản phẩm chính là ammonium carbamate NH
4
COONH
2
. Mặc
dù vậy, vẫn có sự phân hủy ammonium carbamate để tạo thành khí CO
2
và NH
3
và sự phân
hủy này không phụ thuộc vào việc có hay không có enzyme urease mà lại phụ thuộc vào
4
Luận văn tốt nghiệp
bản chất của dung dòch đệm sử dụng. Các loại đệm phosphate và maleate sẽ tạo thuận lợi
cho quá trình phân hủy tạo CO
2
và NH
C. Ở nhiệt độ này, hoạt tính của enzyme là lớn nhất. Khi nhiệt độ vượt quá
65
o
C, hoạt tính của urease bò giảm và có thể mất hẳn khi nhiệt độ đạt 85
o
C. Tuy nhiên,
5
Luận văn tốt nghiệp
nhiệt độ tối thích của urease không cố đònh mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: nguồn thu
nhận, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, pH, thời gian phản ứng… [2,7]
Urease ở dung dòch loãng không có cơ chất thường kém bền nhiệt nhất, còn ở dạng
bột khô và có cơ chất thì khá bền nhiệt [2,7].
Ở nhiệt độ thấp, hoạt tính của urease giảm nhưng urease không bò biến tính.
1.1.5.3 Ảnh hưởng của pH
pH ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính enzyme do pH làm thay đổi trạng thái ion hóa
của phân tử enzyme và cơ chất. Nghiên cứu của Howell và Sumner về enzyme urease kết
luận urease có pH
opt
= 6 khi nồng độ cơ chất urea 8% và bằng 7,5 khi nồng độ urea là 1%.
Điều này cho thấy giá trò pH tối ưu của urease không cố đònh và nó còn phụ thuộc vào nồng
độ cơ chất, nhiệt độ cũng như vào nguồn thu nhận. Ngoài ra, tính chất của dung dòch đệm
cũng ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme urease [2,4,7].
Theo các tài liệu nghiên cứu thì pH tối thích của urease nằm trong khoảng từ 6,4 –
7,6. Urease từ đậu rựa và hầu hết các loại vi sinh vật có pH
opt
dao động xung quanh giá trò 7,
urease từ tảo Spirulina maxima có pH
opt
khoảng 8,7, trong khi đó, các loại acid urease có giá
trò pH tối thích từ 2 trở xuống [92].
2
thấp , EDTA sẽ hấp thụ các ion kim loại, nghóa là một cách
gián tiếp cũng là một chất hoạt hóa urease.
Tuy nhiên, nếu nồng độ EDTA-Na
2
đạt đến một ngưỡng nào đó, nó sẽ hấp thụ ion
Ni
2+
tại trung tâm hoạt động của enzyme, làm ức chế urease. Điều này cũng đồng nghóa với
việc EDTA là một chất kìm hãm [92].
Chất kìm hãm
Chất kìm hãm là các chất có tác dụng chuyển enzyme từ trạng thái hoạt động sang
trạng thái không hoạt động, hoặc từ trạng thái hoạt động mạnh sang trạng thái hoạt động
yếu. Các chất này tồn tại hai loại kìm hãm: cạnh tranh và không cạnh tranh [4].
Kìm hãm cạnh tranh: xảy ra trong trường hợp chất kìm hãm có cấu trúc tương
đồng với cơ chất, vì vậy cũng có khả năng kết hợp với enzyme, giảm mối
liên kết giữa enzyme và cơ chất. Như vậy, các hợp chất như hydroxyurea,
dihydroxyurea, thiourea hay hydroxamic acid là những chất ức chế đặc hiệu
cạnh tranh của urease. Vì chúng có cấu tạo gần giống cơ chất (urea) nên
chúng cũng có khả năng kết hợp với enzyme. Do đó sự có mặt của chúng
trong dung dòch làm giảm tốc độ phản ứng thủy phân urea. Có thể làm giảm
7
Luận văn tốt nghiệp
tác dụng của những chất ức chế này bằng cách tăng nồng độ cơ chất urea
[2,4,7,92].
Kìm hãm không cạnh tranh: xảy ra trong trường hợp chất kìm hãm có khả
năng kết hợp với enzyme hoặc cơ chất, có thể là ion kim loại cùng hóa trò với
các ion kim loại là nhóm ngoại của enzyme. Các ion kim loại như như Hg
2+
,
2+
> Co
2+
> Ni
2+
> Ce
2+
> Mn
2+
.
Ví dụ: với hàm lượng AgNO
3
là 0,002 mg/ml đã làm mất hoạt tính của urease, đối
với HgCl
2
là 0,004 mg/ml và đối với Cu
2+
là 0,01 mg/ml [2,4,7,92].
Ngoài ra, các acid hay kiềm đặc cũng như các tác nhân gây kết tủa protein như acid
tricloacetic (TCA) hay tannin cũng là những chất có tác dụng kìm hãm enzyme urease.
1.1.6 Nguồn thu nhận enzyme urease [2,7,92]
Urease được các nhà khoa học tìm thấy khá sớm ở những nguồn nguyên liệu khác
nhau.
Năm 1980, Miquel tìm thấy urease ở nhiều loài vi sinh vật, nhất là các vi sinh vật
trong đất, trong thực vật và một số ít ở động vật. Ông đã tìm ra hơn 200 loài vi khuẩn, nhiều
loại nấm men và ở đa số các loại thực vật bậc cao có khả năng sinh tổng hợp urease. Các vi
khuẩn có chứa urease tham gia vào quá trình đồng hóa urea thành muối amon có nhiều loài,
chúng có tên chung là Ureabacterium, hầu hết chúng thuộc 2 họ: Cocoaceae và Bacilaceae
[2,7,92].
8
phẩm. Do đó mà các chế phẩm urease được sử dụng để phát hiện và, có thể đònh lượng
được urea trong thực phẩm.
9
Luận văn tốt nghiệp
Trong y học, urease được sử dụng để xác đònh hàm lượng urea trong máu và nước
tiểu của người. Đây là phương pháp khá chính xác, ít tốn kém và dễ tiến hành. Việc xác
đònh hàm lượng urea trong máu và nước tiểu sẽ cho biết năng lực hoạt động của các hệ cơ
quan, mà quan trong nhất là thận và hệ bài tiết. Ngoài ra, urease còn được gắn trong các
tiểu vi cầu dùng để loại urea của máu trong thận nhân tạo.
Trong công nghệ môi trường: urease dùng để phân tích hàm lượng các kim loại nặng
trong các chất thải và trong nguồn nước.
Trong lónh vực phân tích: urease được ứng dụng làm các điện cực urease để xác đònh
hàm lượng urea trên dòng liên tục.
1.2 SƠ LƯC VỀ ENZYME CỐ ĐỊNH [4]
1.2.1 Giới thiệu
1.2.1.1 Đònh nghóa
Enzyme cố đònh có thể được hiểu theo 2 nghóa:
Nghóa hẹp: enzyme không hòa tan là enzyme được đưa vào những pha riêng
rẽ, pha này được tách riêng với dung dòch tự do. Pha enzyme không hòa tan
trong nước và được gắn với các polymer ưa nước có trọng lượng phân tử lớn.
Nghóa rộng: các chất xúc tác cố đònh là các enzyme, tế bào, cơ thể sống ở
trạng thái cho phép sử dụng lại. Như vậy, theo nghóa rộng, enzyme không
hòa tan bao gồm cả enzyme được cố đònh vào một chất mang, cả enzyme có
trong tế bào sống được cố đònh trong các bình phản ứng sinh học có sự gắn
kết vào một chất mang cho phép ta sử dụng nhiều lần.
Enzyme không hòa tan hay enzyme cố đònh thường là những enzyme hòa tan được
gắn vào một chất mang bằng nhiều kỹ thuật khác nhau. Nhờ quá trình gắn này mà enzyme
từ trạng thái hòa tan chuyển sang không hòa tan.
1.2.1.2 Đặc điểm của enzyme cố đònh [4]
Enzyme cố đònh có các đặc điểm sau đây:
Enzyme cố đònh không lẫn vào trong sản phẩm cuối của phản ứng enzyme,
do đó nó không gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng sản phẩm, hay nói cách
khác chúng ta không phải tốn chi phí cho việc tách enzyme ra khỏi sản phẩm.
Có thể ngừng phản ứng khi cần thiết bằng cách tách hệ chất mang-enzyme ra
khỏi dung dòch cơ chất.
Enzyme cố đònh tương đối bền với các tác nhân vật lý và hóa học hơn
enzyme tự do.
Dễ dàng tiến hành quá trình sản xuất theo phương pháp liên tục.
Bên cạnh đó, enzyme cố đònh vẫn có một số nhược điểm như sau:
Sự có mặt của chất mang có thể làm giảm hoạt tính của enzyme.
Trong đa số trường hợp, enzyme có thể bò giảm hoặc mất hoạt tính sau quá
trình cố đònh.
Tuy nhiên, những hạn chế trên là không đáng kể so với lợi ích mà enzyme cố đònh
đem lại. Do vậy, ngày càng có nhiều nghiên cứu về cố đònh enzyme cũng như ứng dụng
enzyme cố đònh vào sản xuất công nghiệp.
1.2.2. Các phương pháp cố đònh enzyme [4]
Các phương pháp cố đònh enzyme được chia thành 2 nhóm chính:
Phương pháp hóa học:
o Gắn enzyme lên chất mang bằng liên kết cộng hóa trò.
o Gắn các phân tử enzyme lại với nhau bằng liên kết cộng hóa trò.
Phương pháp vật lý:
o Hấp phụ enzyme lên chất mang bằng liên kết vật lý như: lực mao
quản, liên kết ion, lực Van der Waals…
o Phương pháp nhốt enzyme trong khuôn gel hoặc màng bao vi thể.
12
Luận văn tốt nghiệp
Bảng 1.2: Ưu – Nhược điểm của các phương pháp cố đònh enzyme [4].
Phương pháp Ưu điểm Nhược điểm
Phương pháp hóa học
Phương pháp gắn
enzyme trong quá trình
cố đònh.
Phương pháp vật lý
Phương pháp gắn
enzyme lên chất mang
bằng tương tác vật lý.
- Thao tác thực hiện đơn
giản.
- Điều kiện tiến hành cố
đònh enzyme ôn hòa nên
không làm mất hoạït tính
của enzyme trong quá
trình cố đònh.
- Có khả năng tái sử
dụng chất mang.
- Do lực tương tác giữa
enzyme và chất mang
yếu nên dễ xảy ra hiện
tượng nhả hấp phụ trong
quá trình sử dụng
enzyme cố đònh do
khuấy trộn hay do thay
đổi nhiệt độ, pH của môi
trường.
Phương pháp nhốt
enzyme
- Thao tác đơn giản.
- Không đòi hỏi phải có
các nhóm tạo liên kết
nên phù hợp với nhiều
o
C, hoạt tính
của enzyme cố đònh hầu như không thay đổi so với enzyme tự do trong
suốt hơn 1200 giờ. Ngoài ra, pHopt của enzyme cố đònh cũng dòch chuyển
từ 7.4 lên 8, còn nhiệt độ tối thích thì thay đổi từ 65
o
C lên 75
o
C. Martins
cũng thấy khả năng bảo quản cũng như độ bền nhiệt của urease cố đònh
tăng lên rõ rệt.
Phương pháp cố đònh urease trên chất mang là polymethylglutamate
(PMG) của Minamoto và cộng sự (1980) đã giữ lại đến 95% hoạt tính ban
14
Luận văn tốt nghiệp
đầu của urease. Bên cạnh đó, độ bền nhiệt của enzyme cố đònh cũng tăng
lên đáng kể nhưng các thông số khác như KM và pHopt cho thấy không có
sự thay đổi đáng kể. Urease cố đònh trong các hạt PMG được nhồi trong
các cột của bình phản ứng có thể giữ được 80% hoạt tính ban đầu trong
vòng 1 năm.
Phương pháp cố đònh urease lên chất mang là màng chitosan bằng liên kết
cộng hóa trò qua glutaraldehyde của Krajewska và cộng sự (1990) giữ lại
được hơn 94% hoạt tính so với enzyme tự do. Bên cạnh đó, các tính chất
khác của enzyme cố đònh được cải thiện đáng kể như tính bền nhiệt, độ
bền ở pH thấp, khả năng tái sử dụng và khả năng bảo quản…[17]
Urease cố đònh trên chất mang là sợi tổng hợp từ acrylamide và poly
(ethylene terephthalate) sau khi được hoạt hóa bằng glutaraldehyde (Elcin
và Sacak, 1996) có độ bền khi sử dụng và khả năng tái sử dụng rất cao với
khoảng hơn 85% hoạt tính ban đầu được giữ lại sau 90 ngày.
15
Luận văn tốt nghiệp
Mourzina, 2003. [41]
Chitosan và alginate Kara và cộng sự, 2006. [34]
Polymer của polyacrylamide và carrageenan Kara và cộng sự, 2006. [34]
CMC và gelatin
Sungur và cộng sự, 1992. [76]
Gelatin
Teke và cộng sự, 2007. [56]
Vật liệu silica (phương pháp sol-gel)
Craith và cộng sự, 1997. [22]
Lee và cộng sự, 2002. [74]
Sahney và cộng sự, 2005. [72]
Ilangovan và cộng sự, 2006. [68]
Nhốt enzyme trong hệ sợi
Composite của cellulose acetate và TiO
2
Hatayama và cộng sự, 1995. [40]
17
Luận văn tốt nghiệp
1.3.3 Tính chất của enzyme urease cố đònh
1.3.3.1 Hoạt độ xúc tác của enzyme urease cố đònh
Các nghiên cứu về enzyme cố đònh nói chung và về enzyme urease cố đònh nói
riêng đều cho thấy hoạt tính riêng của enzyme sau cố đònh giảm đi so với enzyme tự do.
Nghiên cứu của Rao và cộng sự cố đònh enzyme urease trên chất mang là
một copolymer của gelatin và poly (HEMA) (1995) cho kết quả hoạt tính
riêng của enzyme cố đònh chỉ còn lại 75% so với hoạt tính của enzyme
urease tự do [60].
Nghiên cứu của Turmanova và cộng sự về việc cố đònh urease lên màng
trao đổi ion (2005) với màng là polymer của acid acrylic và lớp phim
polyethene mỏng cho thấy hoạt tính của urease sau cố đònh còn lại khoảng
đổi. Cũng theo kết quả của các nghiên cứu này thì đối với urease cố đònh, hằng số K
M
thường có khuynh hướng tăng còn V
max
lại có khuynh hướng giảm so với urease tự do.
Krajewska đã có nhiều công trình nghiên cứu cố đònh urease trên chất
mang là chitosan. Năm 1990, nghiên cứu cố đònh urease lên chitosan của
tác giả cùng các cộng sự cho thấy: K
m
của enzyme cố đònh là 26.4 mmol/lit
so với enzyme tự do là 5.04 mmol/lit, trong khi đó, V
max
của enzyme cố
đònh lại giảm khoảng 1.5 lần so với enzyme tự do. Một nghiên cứu khác
của tác giả vào năm 2005 cũng cho kết quả K
m
của enzyme cố đònh tăng
so với enzyme tự do [17].
Nghiên cứu của Hatayama và cộng sự (1995) cố đònh urease bằng phương
pháp nhốt trong hệ sợi tổng hợp từ cellulose acetate và TiO
2
cũng cho thấy
K
m
của urease cố đònh có giá trò là 8.10
-1
mol/lit, cao hơn nhiều so với K
m
của urease tự do (có giá trò 9,4.10
-4
do: [4]
Sự khác biệt về hiện tượng phân bố chất hòa tan trong môi trường có
enzyme cố đònh với sự phân bố chất hòa tan trong môi trường có enzyme
tự do. Hiện tượng này xảy ra khi sử dụng các chất mang có tích điện để cố
đònh enzyme. Sự có mặt của các chất mang có điện tích sẽ gây ra hiện
tượng tập trung cơ chất tại bề mặt chất mang nếu cơ chất tích điện ngược
dấu với chất mang và ngược lại. Kết quả của sự tương tác này dẫn đến sự
phân bố nồng độ chất hòa tan ở môi trường gần enzyme khác với nồng độ
chất hòa tan ở môi trường trong dung dòch. Nếu cơ chất và chất mang tích
điện trái dấu, cơ chất sẽ tập trung nhiều trên bề mặt chất mang, kết quả
dẫn đến ái lực biểu kiến của enzyme và cơ chất sẽ tăng và ngược lại.
Những thay đổi về cấu trúc không gian của enzyme khi có mặt chất mang.
Khi enzyme gắn lên chất mang sẽ gây ra những biến đổi hình thể của
enzyme cũng như sẽ tạo ra sự cản trở không gian giữa enzyme và cơ chất
do có mặt chất mang, làm giảm khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất,
K
m
sẽ tăng lên.
20
Luận văn tốt nghiệp
Những hạn chế về mặt khuếch tán khi có mặt chất mang, đặc biệt là trong
trường hợp chất mang dạng khuôn gel hoặc màng bao vi thể. Vận tốc
khuếch tán cơ chất và các chất hòa tan khác phụ thuộc vào kích thước lỗ
mao quản và kích thước phân tử của cơ chất. Tuy nhiên, để làm tăng vận
tốc khuếch tán, chúng ta có thể gia tăng sự khuấy đảo môi trường hoặc
giảm kích thước hạt gel [4].
1.3.3.3 nh hưởng của nhiệt độ đến enzyme urease cố đònh
Cũng như enzyme tự do, nhiệt độ là một yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính
cũng như các tính chất khác của enzyme urease cố đònh. Nhiều nghiên cứu về enzyme
urease cố đònh đã kết luận rằng nhờ liên kết với chất mang mà urease cố đònh có tính bền
C lên 70
o
C
[48].
22
Luận văn tốt nghiệp
Hình 1.6: Độ bền nhiệt của enzyme urease tự do và cố đònh tại nhiệt độ 70
o
C
trong đệm pH 7.
Hình 1.7: Nhiệt độ tối ưu của enzyme ureae tự do và cố đònh trong đệm pH 6.5
1.3.3.4 nh hưởng của pH đến enzyme urease cố đònh
pH tối ưu của urease cố đònh, cũng như nhiều loại enzyme cố đònh khác, có thể
thay đổi so với enzyme tự do. pH tối ưu này có thể dòch chuyển về phía kiềm hay về phía
acid sau khi cố đònh [4].
23
Luận văn tốt nghiệp
Nghiên cứu của Turmanova và cộng sự về việc cố đònh urease lên màng
trao đổi ion (2005) với màng là polymer của acid acrylic và lớp phim
polyethene mỏng cho thấy pH tối ưu của urease tự do là 5.8, trong khi đó,
pH tối ưu của enzyme cố đònh là 6 [75].
Hình 1.8: nh hưởng của pH đến enzyme cố đònh trên màng trao đổi ion
Nghiên cứu cố đònh urease đậu rựa trên các chất mang khác nhau như hỗn
hợp chitosan – alginate và hỗn hợp poly(acrylamide-co-acrylic acid)/κ-
carrageenan của Kara và cộng sự (2006) cho thấy pH tối ưu của enzyme
sau cố đònh dòch chuyển từ 7.5 lên 8. Thêm vào đó, hoạt tính của urease cố
đònh trong điều kiện pH thấp cũng cao hơn so với urease tự do [34].
Hình 1.9: nh hưởng của pH đến enzyme urease cố đònh.
24
Luận văn tốt nghiệp
25
Copyright: Tài liệu đại học ©