Kho¸ luËn tèt nghiÖp
PHẦN 1 - MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Là một nước nông nghiệp đang phát triển như nước ta, các nông sản và
các sản phẩm từ chăn nuôi đóng một vai trò rất quan trọng. Lạc và ngô là hai
nông sản, ngoài việc sử dụng làm thực phẩm, chúng chủ yếu còn được làm
thức ăn trong chăn nuôi. Với điều kiện khí hậu nóng ẩm của nước ta thì lạc và
ngô lại là nguồn cơ chất lí tưởng cho nấm mốc phát triển. Khi phát triển trên
ngô, lạc nấm mốc đã sử dụng các chất dinh dưỡng, gây ra tổn thất về lượng
cũng như về chất của hạt. Không những thế, một số loài nấm mốc khi phát
triển chúng sinh ra các loại độc tố khác nhau và được gọi chung là mycotoxin.
Nguy hiểm hơn, những độc tố này có khả năng theo thức ăn vào cơ thể, gây
độc cho con người và động vật kinh tế.
Việc sử dụng các biện phòng trừ độc tố nấm mốc đã được khuyến cáo
sử dụng. Tuy nhiên, sự nhiễm nấm mốc và các độc tố nấm mốc nói chung và
sự nhiễm aflatoxin trên ngô lạc ở mức độ cao quá giới hạn cho phép là không
thể tránh được. Chính vì vậy cần phải có những biện pháp khử nhiễm độc tố
nấm mốc, đặc biệt là aflatoxin bởi độc tính và nguy cơ gây ung thư của nó.
Trên thế giới hiện nay, việc nghiên cứu để tìm ra những pháp làm giảm
lượng độc tố aflatoxin trong lương thực nói chung và trong ngô, lạc nói riêng
đã và đang được các nhà khoa học rất quan tâm.
Ở nước ta, từ những năm 1970 Nguyễn Phùng Tiến và cộng sự [9] đã
nghiên cứu mức nhiễm nấm mốc trên thóc ở kho bảo quản lương thực miền
Bắc Việt Nam và một số lương thực như đậu, đỗ, lạc... , Đặng Hồng Miên [5]
cũng đã nghiên cứu sự nhiễm nấm mốc aflatoxin trên lạc.
NguyÔn ThÞ Minh Ch©u líp: 04-02 Khoa CNSH
1
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
Nguyễn Thùy Châu và cộng sự [1] đã nghiên cứu tình hình nhiễm độc
tố nấm mốc trên ngô gạo và các biện pháp phòng trừ.
Một số công trình của Đậu Ngọc Hào về sự nhiễm nấm mốc và

1.2.2. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập một số chủng Flavobacterium aurantiacum từ một số mẫu
đất thu thập ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam.
- Phân lập một số chủng Rhizopus delemar từ một số mẫu nông sản,
thực phẩm như quýt, xoài, gạo mốc, bánh men thuốc bắc.
- Xác định hoạt tính khử aflatoxin của các chủng Flavobacterium
aurantiacum phân lập được.
- Xác định hoạt tính khử aflatoxin của các chủng Rhizopus delemar
phân lập được.
NguyÔn ThÞ Minh Ch©u líp: 04-02 Khoa CNSH
3
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
PHẦN 2 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Đại cương về độc tố nấm mốc
Độ tố nấm mốc (hay còn gọi là mycotoxin) là nhóm hợp chất có cấu
trúc đa dạng, có khối lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi thứ cấp
của các nấm mốc và gây ngộ độc với động vật có vú, cá và gia cầm [14].
Ngoài tự nhiên có rất nhiêu loài nấm khác nhau phát triển trên các sản
phẩm ngũ cốc, hạt bông, lúa mì và nhiều loại hợp chất hữu cơ. Tuy nhiên, chỉ
có một vài loài nấm có thể sinh độc tố và ảnh hưởng đến gia súc, gia cầm và
con người. Sự sản sinh độc tố nấm mốc là kết quả của tác động qua lại giữa
kiểu gen (genotype) và điều kiện phát triển của nấm mốc. Độc tố nấm là sản
phẩm của sự chuyển hóa thứ cấp trong quá trình phát triển của nấm mốc [6].
Quá trình trao đổi thứ cấp được hiểu là quá trình tạo thành các chất mà vai trò
sinh lý của chúng chưa được rõ,chưa thật cần thiết cho sự tồn tại của chính tế
bào đó. Sự chuyển hóa thứ cấp thường xảy ra ở cuối giai đoạn phát triển của
tế bào nấm mốc.
Tính độc của những loài nấm lớn nhất định đã được biết đến từ lâu,
nhưng đến năm 1960 Bệnh độc tố nấm mốc mới được nghiên cứu sâu. Khi đó,
cả thế giới bàng hoàng bởi hơn 100 000 con gà tây ở nước Anh đã chết vì

1
, B
2
, G
1
, G
2
. Các aflatoxin thường nhiễm trên các sản phẩm
thực vật.
Các công thức cấu tạo của một số aflatoxin và các chất trao đổi liên
quan đến aflatoxin B
1
, G
1
và aflatoxin B
2
, G
2
là dẫn xuất dihydro của các hợp
chất mẹ. Các aflatoxin M
1
và M
2
là các chất trao đổi hydroxylat hóa của B
1
và
B
2
theo thứ tự, chúng có công thức cấu tạo như sau:
NguyÔn ThÞ Minh Ch©u líp: 04-02 Khoa CNSH

ở nồng độ 0,22mg/l có thể phát hiện được trong sữa lỏng.
Các aflatoxin được hòa tan trong các dung môi phân cực nhẹ như
cloroform và metanol, đặc biệt tan nhiều trong dimetylsulfoxit (dung môi thường
NguyÔn ThÞ Minh Ch©u líp: 04-02 Khoa CNSH
6
OCH
3
O O
O
O
O
Aflatoxin B
1
Aflatoxin M
2
OH
OCH
3
O O
O
O
O
Aflatoxin B
2
O
O
O
O O
OCH
3

bình thường và làm nóng khi thanh trùng. Tuy nhiên, lạc rang đã làm giảm
đặc biệt lượng các aflatoxin và các aflatoxin có thể bị phá hủy hoàn toàn với
việc xử lí mạnh bằng amoniac hay hypochlorit.
Sự có mặt của vòng lacton ở phân tử aflatoxin làm chúng cảm với việc
thủy phân trong môi trường kiềm. Đặc tính này là quan trọng trong quá trình
chế biến thực phẩm vì quá trình xử lí kiềm làm giảm sự nhiễm aflatoxin của
các sản phẩm. Tuy nhiên, nếu xử lí kiềm là nhẹ thì việc axit hóa sẽ làm phản
ứng ngược trở lại để tạo aflatoxin ban đầu.
Moreau và cộng sự khi nghiên cứu tính chất của aflatoxin đã đưa ra
những kết quả sau:
NguyÔn ThÞ Minh Ch©u líp: 04-02 Khoa CNSH
7
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
Bảng 2.1. Tính chất hóa lý của một số aflatoxin
Aflatoxin
Công
thức phân
tử
Trọng
lượng
phân tử
Nhiệt độ nóng chảy
* ** ***
Huỳnh quang
B
1
C
17
H
12

M
1
C
17
H
12
O
7
328 299 Xanh lam tím
M
2
C
17
H
14
O
7
320 293 Tím
Ghi chú: * Kết quả của Townsend
** Kết quả của Stubblefield và cộng sự.
*** Kết quả của Beljaars.
2.2.1. Sự tạo thành aflatoxin do các nấm mốc
Sự tạo thành aflatoxin chủ yếu được thấy ở hai chủng A.flavus và
A.parasiticus. Các chủng tạo aflatoxin của A.flavus là rất phổ biến và thường
được phân lập từ các nguồn khác nhau như lạc, hạt bông, hạt gạo, lúa... Theo
số liệu của Schoroder và Boller (1976), có từ 20-98% các chủng phân lập của
A.flavus có khả năng tạo aflatoxin. Ngoài hai loài A.flavus và A.parasiticus
còn có một số loài khác cũng có khả năng sinh aflatoxin nhưng yếu hơn như
A.nominus (Samson 2001, Varga etall 2003) và A.bombycis (Varga et all
2003).

giá của FAO, hiện tại ước lượng có khoảng 25% tất cả các loại ngũ cốc bị ảnh
hưởng bởi độc tố nấm mốc [10]. Mặc dù aflatoxin được tìm thấy trên nhiều
loại lương thực, thực phẩm khác nhau nhưng hầu hết sự nhiễm tập trung được
xác định trên lạc và trên ngô là chủ yếu.
* Tình hình nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc trên thế giới
Những nghiên cứu của Ablas K. và cộng sự [13] cho thấy sự nhiễm
aflatoxin trên ngô do nấm Aspergillus flavus gây nên là vấn đề nghiêm trọng ở
các vùng trồng ngô của đồng bằng Missisipi của Mỹ. Trong 3 năm nghiên cứu
từ 2000 đến 2002, các tác giả đã nghiên cứu mức nhiễm A.flavus trên ngô hạt
năm 2000 dao động từ 0 -100% (trung bình là 15% hạt ngô bị nhiễm), hàm
lượng aflatoxin trong ngô dao động từ 0 đến 1590 ppb (trung bình là 57ppb).
Mức nhiễm aflatoxin phân bố ngẫu nhiên trong ngô ngoài đồng không tương
quan với với sự nhiễm A.flavus. Tuy nhiên, 84% A.flavus phân lập từ các hạt
ngô có khả năng tạo aflatoxin. Ở Thái Lan, 35% mẫu ngô nhiễm aflatoxin B1
NguyÔn ThÞ Minh Ch©u líp: 04-02 Khoa CNSH
9
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
(mức trung bình 400μg/kg) trong khi 40% mẫu nhiễm aflatoxin B1 (mức
trung bình 133μg/kg) đã được tìm thấy ở Uganda và 97% mẫu ở đảo Cebu,
Philippin trung bình 213μg/kg [18]. Theo Goto và cộng sự [12], 80 -85% số
mẫu ngô thu thập từ các kho bảo quản trong mùa mưa 1984 – 1985 ở Thái
Lan đã nhiễm aflatoxin B1 với liều lượng 6,30 – 1310 ppb.
Còn đối với lạc, trong năm 1973, nghiên cứu về lạc bóc vỏ ở nước Mĩ
cho thấy 15% của 361 mẫu có aflatoxin giới hạn từ vết đến 50μg/kg. Stoloff,
Krof và Hald đã tìm thấy aflatoxin ở 86,5% của 52 mẫu của các sản phẩm lạc
nhập vào Đan Mạch làm thức ăn gia súc, một mẫu có 3,465μg/kg. Các
aflatoxin đã tìm thấy ở 41% số mẫu của tất cẩ các mẫu bơ lạc được kiểm tra
năm 1967-1968, có aflatoxin với giá trì 155μg/kg và giá trị trung bình 500μg/
kg.
* Tình hình nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở Việt Nam

nhưng aflatoxin đã mở đường cho các bệnh truyền nhiễm xâm nhập do nó tác
động làm suy giảm đáp ứng miễn dịch dịch thể, đáp ứng miễn dịch tế bào và
cả sức đề kháng chung của cơ thể [27]. Aflatoxin có thể tác động tương hỗ
với sự thiếu vitamin, thiếu protein, nhiệt độ không thuận lợi và các yếu tố
truyền nhiễm để gây hại.
2.2.4. Ảnh hưởng của aflatoxin đối với sức khỏe con người
Hiện nay, vấn đề thực phẩm bị nhiễm aflatoxin đang là mối quan tâm
của nhiều nhà khoa học vì nó đe dọa đến sức khỏe của con người. Aflatoxin
liên quan tới bệnh ung thư gan nguyên phát ở người. Nhiều tài liệu nghiên
cứu về ung thư tế bào gan chứng minh đó là bệnh chung của các vùng có
lương thực bị nhiễm nấm mốc A.flavus mà chất độc là nhóm aflatoxin. Bảng
2.3 dưới đây cho thấy mối tương giữa tỉ lệ người bị mắc bệnh ung thư gan với
hàm lượng aflatoxin có trên thực phẩm.
NguyÔn ThÞ Minh Ch©u líp: 04-02 Khoa CNSH
11
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
Bảng 2.2. Tỉ lệ dân số bị ung thư gan và hàm lượng aflatoxin trung bình
có trên thực phẩm (Theo Alain Reilly, 1993)
Tên nước hoặc vùng
Hàm lượng
aflatoxin trong
thực phẩm (μg/kg)
Tỉ lệ người mắc
ung thư gan
trên 10
5
người/năm
Vùng cao Kenya
Songkha (Thái Lan)
Thảo nguyên vùng cao (Thụy Sỹ)

Nước
Giới hạn aflatoxin
tối đa cho phép
Loại thức ăn
Mỹ
20 ppb
Bột ngô sử dụng làm thức ăn cho gia súc,
gia cầm ở tất cả các giai đoạn khác nhau
20 ppb
Hàm lượng tối đa cho phép trong thức ăn
cho gia súc, gia cầm hoặc trong nguyên liệu
bột ngô
Châu Âu 5 ppb Thực phẩm sử dụng cho người
Canada 15 ppb
Thực phẩm chế biến từ lạc bao gồm tổng số
tất cả các loại độc tố aflatoxin B
1
, B
2
, G
1
, G
2
Úc 15 ppb Thực phẩm chế biến từ dầu đậu tương và lạc
Nhật
10 ppb Cho tất cả các loại thực phẩm chứa B
1
100 ppb
Cho các loại nguyên liệu chế biến thức ăn
chăn nuôi

aflatoxin
Gà con từ 1 – 28 ngày tuổi < 20 <30
Nhóm gà còn lại <30 <50
Vịt con từ 1 – 28 ngày tuổi Không có <10
Nhóm vịt còn lại <10 <20
Heo con theo mẹ từ 1 – 20 ngày
tuổi
<10 <30
Nhóm heo còn lại <100 <200
Bò nuôi lấy sữa <20 <50
NguyÔn ThÞ Minh Ch©u líp: 04-02 Khoa CNSH
14
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
2.3. Vấn đề khử nhiễm aflatoxin
Vì sự nguy hiểm có thể liên quan tới sức khỏe của con người và cộng
đồng do sự nhiễm các aflatoxin trong thực phẩm và thức ăn gia súc, các nhà
khoa học đã cố gắng tìm kiếm các phương pháp để loại trừ hay phá hủy các
aflatoxin trong các sản phẩm bị nhiễm.
Vấn đề phòng ngừa sự nhiễm aflatoxin có thể là đưa những biện pháp
kiềm chế có lợi và có hiệu quả nhất. Nó có thể làm giảm số lớn những tổn thất
lương thực do nấm mốc gây ra. Song những biện pháp như vậy là rất khó thực
hiện trong thực tế vì nó phụ thuộc vào các điều kiện khí hậu và các thay đổi
cần thiết trong thực tiễn bảo quản và thực tiễn nông nghiệp. Các thực nghiệm
với lạc đã tiến hành ở Tây Phi chứng minh ảnh hưởng của thực tiễn nông
nghiệp về sự nhiễm aflatoxin. Thậm chí những phương pháp nông nghiệp tiến
bộ đã cho thấy một thực tế là sự nhiễm aflatoxin trong lạc ở mức độ thấp là
không thể tránh được.
Vì những biện pháp phòng ngừa cực kỳ khó thực hiện trong thực tế,
cho nên cần tìm những biện pháp kiềm chế khác để đạt được các thực phẩm
và thức ăn gia không có aflatoxin có thể ăn được. Các phương pháp khử

chúng cũng là vấn đề. Thêm nữa, độc tính của dung môi, dư lượng của chúng
và cuối cùng là tính an toàn của quá trình xử lý vì tính dễ cháy dễ nổ và điểm
sôi của dung môi.
Các aflatoxin có thể được chiết suất bằng các dung môi như cloroform/
nước, aceton/nước. Những hệ dung môi này chỉ loại trừ aflatoxin đơn độc mà
NguyÔn ThÞ Minh Ch©u líp: 04-02 Khoa CNSH
16
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
không loại trừ dầu. Còn các nhóm dung môi như hydrocacbon dầu hỏa/nước
loại trừ chủ yếu dầu nhưng cũng có khả năng loại trừ aflatoxin.
Những kết quả có nhiều hứa hẹn nhất đã thu được bằng việc dùng hệ
thống chiết suất bao gồm hỗn hợp hexan – metanol, hexan – etanol, hexan –
etanol - nước, và hexan –aceton - nước. Hệ thống bao gồm 54% aceton, 44%
hexan và 2% nước (tính theo trọng lượng) là hệ thống thành công nhất được
tìm thấy có thể đồng thời loại trừ dầu từ các bánh ép khô của lạc gồm 12% -
15% dầu và dư lượng lipid gần bằng 1% và mức aflatoxin thấp hơn 40μg/kg.
2.3.2. Phương pháp khử độc tố bằng hóa chất
Nhiều hóa chất có thể khử aflatoxin trong các nguyên liệu nhiễm tự
nhiên. Những hóa chất này bao gồm: chlorin, ozon, axit hydrochloric, peroxit
benzoic, amoniac, natri hydrochlorit và etanolamin. Các hóa chất dùng cho
việc khử độc tố phải thỏa mãn các tiêu chuẩn sau:
- Phải phá hủy hay khử aflatoxin;
- Nó phải không tạo ra hay giải phóng ra bất kỳ các dư lượng độc tố
hay gây ung thư ở sản phẩm cuối cùng;
- Phải phá hủy các bào tử và sợi nấm mà dưới điều kiện thuận lợi chúng
có thể tái nhiễm lại sản phẩm;
- Phải giữ được giá trị dinh dưỡng và tính ăn được của nguyên liệu ban
đầu.
Tuy nhiên, nhiều hóa chất khảo sát đã không thỏa mãn tất cả những tiêu
chuẩn trên, và mặc dầu chúng phá hủy các aflatoxin nhưng lại làm giảm đáng

quá giới hạn là không thể tránh được trong những điều kiện bảo quản bất lợi.
Vấn đề khử nhiễm aflatoxin bằng con đường sinh học nhằm thay thế cho biện
pháp khử nhiễm aflatoxin bằng các hóa chất có giá thành cao và làm biến đổi
phẩm chất lượng lương thực nên khó áp dụng vào thực tiễn bảo quản được
chứng minh là các phương pháp hứa hẹn nhất.
NguyÔn ThÞ Minh Ch©u líp: 04-02 Khoa CNSH
18
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
Khử nhiễm độc tố aflatoxin bằng phương pháp sinh học có thể được
định nghĩa như sự phân giải bằng enzym hay chuyển hóa sinh học của các độc
tố nấm mốc.
2.3.3.1. Khử nhiễm aflatoxin bằng Flavobacterium aurantiacum
Nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả như Claude Morro, Cotty
Pitter đã cho thấy vi khuẩn Flavobacterium aurantiacum có khả năng phân
hủy aflatoxin. Nó có khả năng phân hủy aflatoxin một cách không trở lại cả ở
môi trường rắn và môi trường lỏng. Khả năng loại trừ aflatoxin B
1
của vi
khuẩn này từ các thực phẩm đã được chứng minh ở các loại dầu thực vật, lạc,
ngô, bơ lạc và sữa lạc. Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng yếu tố có vai trò
quan trọng việc phân giải alflatoxaflatoxinin B
1
bằng chất chiết của
Flavobacterium aurantiacum có thể là protein với các tính chất enzym. Khả
năng sử dụng chất chiết protein thô từ Flavobacterium aurantiacum được tinh
chế trong công nghiệp thực phẩm đã được Cộng đồng Châu Âu và cơ quan
Quản lí thực phẩm và thuốc của Mĩ đề nghị như các biện pháp loại trừ
aflatoxin từ các thực phẩm bị nhiễm.
2.3.3.2. Khử nhiễm aflatoxin bằng Rhizopus delemar
Zhu C.R. và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng khử nhiễm aflatoxin của

gia súc nói chung và khử nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc nói riêng.
NguyÔn ThÞ Minh Ch©u líp: 04-02 Khoa CNSH
20
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
PHẦN 3 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng nghiên cứu
3.1.1. Vật liệu
* Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã thu thập 40 mẫu đất của các
tỉnh Thái Bình, Hà Nội, Hà Tây, Hưng Yên để phân lập vi khuẩn
Flavobacterium aurantiacum.
* Để phân lập các chủng Rhizopus delemar có khả năng khử aflatoxin,
chúng tôi đã thu thập:
- 8 mẫu bánh men thuốc bắc tại các chợ của các tỉnh Hà Nội, Hưng
Yên, Nam Định, Bắc Ninh
- 7 mẫu xoài tại các chợ của Hà Nội
- 6 mẫu quýt tại các chợ của Hà Nội
- 4 mẫu gạo mốc
3.1.2. Môi trường
* Môi trường M
1
:
5 gram pepton
2 gram cao thịt
0,2 gram cao nấm men
3 gram NaCl
20 gram aga
1000 ml nước máy
pH = 7,2-7,4
NguyÔn ThÞ Minh Ch©u líp: 04-02 Khoa CNSH
21

* Các chuẩn độc tố aflatoxin B
1
(Sigma)
* Silicagel 60 F
245
, Merck, Cộng hòa liên bang Đức cho sắc ký lớp
mỏng
3.1.4. Dụng cụ thí nghiệm
* Buồng sắc ký lớp mỏng (chromatography tank ), Thụy Sỹ
* Máy nghiền đồng thể polytron, Cộng hòa liên bang Đức
* Giấy lọc Whatman N
o
1, Chemapoli, Tiệp Khắc
* Kính hiển vi Olympus có gắn máy chụp ảnh Nhật
* Phễu chiết
* Ống hút tự động 0,2ml và 0,1ml Trung Quốc
* Bơm tiêm vi lượng Hamilton
* Máy cô chân không
* Đèn cực tím 254 nm – 366nm Camag (Thụy Sỹ)
* Máy đánh sóng siêu âm
* Các dụng cụ dùng cho nuôi cấy vi sinh
* Máy cất quay chân không (Đức)
* Tủ cấy vô trùng (Đức)
* Nồi hấp tự động (Đài Loan)
* Máy đánh vovtex
NguyÔn ThÞ Minh Ch©u líp: 04-02 Khoa CNSH
23
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
3.2. Phương pháp
3.2.1. Phương pháp lấy mẫu đất

Vovtex 200 vòng/phút trong 30 phút. Dùng pipet hút 1ml lần lượt sang các
ống nghiệm khác cũng có 9ml nước cất đã khử trùng để độ pha loãng đạt 10
-5
thì dừng lại. Lấy 200 μl ở độ pha loãng 10
-4

và 10
-5
vào các hộp petri đã đổ
môi trường PDA hoặc Sabouraud. Dùng que trang thủy tinh trang đều cho tới
khi mặt thạch khô thì dừng. Các hộp lồng được đặt vào tủ ấm 30
o
C, sau 2
ngày lấy ra quan sát và bắt các khuẩn lạc lẻ cấy sang môi trường PDA (hoặc
môi trường Saubauraud) thạch nghiêng.
NguyÔn ThÞ Minh Ch©u líp: 04-02 Khoa CNSH
24
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
- Phân lập Rhizopus delemar từ các mẫu hoa quả : vỏ hoa quả được cắt
thành những mảnh nhỏ. Cân 1g mẫu cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 9 ml
nước cất đã khử trùng. Đánh tan trên máy đánh Vovtex 200 vòng/phút trong
30 phút. Dùng pipet hút 1ml lần lượt sang các ống nghiệm khác cũng có 9ml
nước cất đã khử trùng để độ pha loãng đạt 10
-5
thì dừng lại. Lấy 200 μl ở độ
pha loãng 10
-4

và 10
-5