BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI




 TRẦN THỊ THANH BÌNH
NGHIÊN CỨU BỆNH VIRUS KHẢM LÙN NGÔ
(SUGARCANE MOSAIC VIRUS - SCMV)
TẠI VÙNG CHƯƠNG MỸ, ðAN PHƯỢNG (HÀ NỘI)
VÀ SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH CHẨN ðOÁN BỆNH
LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: BẢO VỆ THỰC VẬT
Mã số : 62.62.10.01 Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. VŨ TRIỆU MÂN Hà Nội, 2012

Trung tâm Bệnh cây nhiệt ñới - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội và các
cán bộ trong Trung tâm ñã hướng dẫn, hỗ trợ phương tiện và kỹ thuật, tạo
ñiều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện các thí nghiệm.
Tôi xin ñược gửi lời chân thành cảm ơn tới TS. Trần Nguyễn Hà,
PGS.TS. Ngô Bích Hảo và các thầy cô giáo Bộ môn Bệnh cây và Khoa Nông
học ñã ñóng góp nhiều ý kiến quý báu ñể luận án ñược hoàn thiện.
Tôi xin ñược gửi lời chân thành cảm ơn ñến các thầy cô trong Ban giám
hiệu, Viện ðào tạo Sau ñại học ñã tận tình giúp ñỡ tôi hoàn thành các thủ tục
bảo vệ luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám ñốc Viện nghiên cứu ngô, TS. Lê
Văn Hải, KS Nguyễn Văn Vượng và các cán bộ nhân viên bộ môn Hệ thống
canh tác và bộ môn Bảo vệ thực vật Viện Nghiên cứu ngô ñã tạo ñiều kiện
thuận lợi cho tôi thực hiện các thí nghiệm ñồng ruộng trong suốt thời gian
thực hiện ñề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu, NGUT.TS Phạm
Thanh Hải – Hiệu trưởng Trường Cao ñẳng Nông nghiệp và PTNT Bắc Bộ,
các ñồng nghiệp, tất cả người thân, bạn bè những người luôn bên cạnh ñộng
viên giúp ñỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện bản luận án này.
Hà Nội, ngày tháng năm 2012
Tác giả luận án Trần Thị Thanh Bình iii

MỤC LỤC
Trang


5. ðối tượng và phạm vi nghiên cứu 3

5.1. ðối tượng nghiên cứu 3

5.2. Phạm vi nghiên cứu 3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1. Cơ sở khoa học của ñề tài 4

1.2. Những nghiên cứu ngoài nước 4

1.2.1. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới 4

1.2.2. Tình hình nghiên cứu bệnh virus hại ngô trên thế giới 5

1.2.3. Giới thiệu chung về chi Potyvirus 25

1.2.4. Phương pháp chẩn ñoán virus bằng ELISA 27

1.2.5. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 31
iv

1.2.6. Phương pháp RT-PCR (Reverse Transcriptase - Polymerase
Chain Reaction) 32

1.2.7. Phương pháp hiển vi ñiện tử 32

2.4.2. Phương pháp xác ñịnh virus bằng RT-PCR 43

2.4.3. Xác ñịnh virus bằng phương pháp hiển vi ñiện tử 47

2.4.4. Phương pháp ñiều tra ngoài ñồng 47

2.4.5.

Phương pháp xác ñịnh sự lan truyền của virus khảm lùn ngô
(SCMV) bằng tiếp xúc cơ học 48

2.4.6.

Phương pháp xác ñịnh sự lan truyền của virus khảm lá ngô
(SCMV) bằng côn trùng môi giới 50

2.4.7. Phương pháp ñánh giá ảnh hưởng của virus khảm lùn cây ngô
(SCMV) ñến một số chỉ tiêu sinh trưởng phát triển của ngô 51

2.4.8. Phương pháp sản xuất và thử nghiệm kháng huyết thanh virus
SCMV 52
2.4.9. Phương pháp tính và xử lý số liệu 54
v

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 56

3.1. Xác ñịnh nguyên nhân gây bệnh khảm lùn ngô 56


3.3.3. Ảnh hưởng của bệnh virus tới hàm lượng diệp lục và thành phần
hoá sinh hạt ngô 100

3.3.4. Ảnh hưởng của bệnh virus tới các yếu tố cấu thành năng
suất ngô 102

3.4. Thử nghiệm tạo kháng huyết thanh ñặc hiệu virus SCMV 106

3.4.1. Giới thiệu 106

3.4.2. Tinh chiết virus 107

3.4.3.

Kiểm tra sự có mặt của kháng thể SCMV trong cơ thể thỏ thí
nghiệm sau các tuần tiêm 109
vi

3.4.4. Thực hiện ñiều kiện phản ứng với kháng huyết thanh virus
SCMV ñã tạo ñược 112

3.4.5. Kiểm tra sự có mặt của virus SCMV gây hại trên các bộ phận
cây ngô thu thập trong vụ xuân 2011 bằng phương pháp ELISA 120

4. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 127


3.2. Kết quả kiểm tra virus khảm lùn ngô (SCMV) bằng
phương pháp RT-PCR 62

3.3. Kết quả lây nhiễm virus SCMV lên cây chỉ thị, cây trồng và cỏ
dại bằng phương pháp tiếp xúc cơ học 67

3.4. Kết quả xác ñịnh khả năng lan truyền của virus SCMV qua rệp
cờ ngô Rhopalosiphum maydis 69

3.5. Kết quả xác ñịnh khả năng lan truyền của virus SCMV bằng
phương pháp tiếp xúc cơ học từ nguồn cây nhiễm bệnh 70

3.6. Tình hình bệnh virus SCMV hại ngô trên giống ngô LVN – 4 tại
xã Thủy Xuân Tiên – Chương Mỹ - Hà Nội vụ xuân các năm
2007 ñến 2010 75

3.7. Tỷ lệ bệnh virus SCMV hại ngô trên giống ngô LVN – 4 tại xã
ðồng Tháp – ðan Phượng - Hà Nội vụ xuân các năm 2007 ñến
2010 77

3.8. Tỷ lệ bệnh virus SCMV hại ngô trên bộ giống trung ngày
(Viện nghiên cứu ngô, vụ xuân 2007) 79

3.9. Tỷ lệ bệnh virus SCMV hại ngô trên bộ giống trung ngày
(Viện nghiên cứu ngô, vụ xuân 2008) 81
viii


3.20. Ảnh hưởng của bệnh khảm lùn ngô (SCMV) ñến khả năng sinh
trưởng của giống ngô KK 159 100

3.21. Ảnh hưởng của bệnh khảm lá ngô (SCMV) tới hàm lượng diệp
lục lá và thành phần hoá sinh của hạt ngô LVN 10 101

3.22. Ảnh hưởng của bệnh khảm lùn ngô SCMV tới các chỉ tiêu cấu
thành năng suất trên các giống ngô LVN 10 103

3.23. Ảnh hưởng của bệnh khảm lùn ngô SCMV tới các chỉ tiêu cấu
thành năng suất trên các giống ngô LVN 14 104
ix

3.24. Ảnh hưởng của bệnh khảm lùn ngô SCMV tới các chỉ tiêu cấu
thành năng suất trên các giống ngô LVN 99 105

3.25. Ảnh hưởng của bệnh khảm lùn ngô SCMV tới các chỉ tiêu cấu
thành năng suất trên các giống ngô KK 159 105

3.26. Kiểm tra ELISA hàm lượng virus SCMV trong các sản phẩm
thu ñược trong quá trình tinh chiết virus 108

3.27. Kiểm tra sự có mặt của kháng thể SCMV trong cơ thể thỏ
thí nghiệm sau các tuần tiêm 109

3.28. Kết quả xác ñịnh ngưỡng pha loãng dịch cây với kháng huyết
thanh virus SCMV 112
x

DANH MỤC CÁC HÌNH
Số TT
Tên ñề mục
Trang

1.1. Phân tích phát sinh chủng loại của các chuỗi protein axit amin ở
chủng SCMV 25

1.2. thái virion và thể vùi của potyvirus 27

1.3. Các kỹ thuật ELISA khác nhau (Hull, 2002) 31

2.1. Sơ ñồ tinh khiết virus Sugarcane mosaic virus - SCMV 46
3.1. Bệnh khảm lùn ngô do SCMV triệu chứng toàn cây 58

3.2. Bệnh khảm lùn ngô do SCMV triệu chứng trên lá 58

3.3. Bệnh khảm lùn ngô do virus SCMV trên lá ngô 59

3.4. Kết quả kiểm tra SCMV bằng phương pháp RT-PCR trên một
số mẫu ngô, mía, cỏ thu thập ngoài ñồng vụ xuân 2011 62

3.5. Sợi virus SCMV sau khi ñã ñược làm tinh khiết từ mẫu thu ñược
ở Huyện Chương Mỹ – Hà Nội 64

3.6. Thể vùi của virus nằm trong tế bào lá ngô tại Chương Mỹ - Hà Nội 64

3.18. Lây bệnh nhân tạo bằng rệp ngô Rhopalosiphum maydis
trên cây ngô 73

3.19. Lây bệnh nhân tạo bằng rệp ngô Rhopalosiphum maydis trên
cây thuốc lá N. tabacum cv. White Burley 73

3.20. Tỷ lệ cây bị nhiễm bệnh (%) tại xã Thủy Xuân Tiên - Chương
Mỹ - Hà Nội 76

3.21. Tỷ lệ cây bị nhiễm bệnh (%) tại xã ðồng Tháp - ðan Phượng -
Hà Nội 78

3.23. Tỷ lệ cây bị nhiễm bệnh trên bộ giống trung ngày
Viện nghiên cứu ngô, vụ xuân 2007 80

3.24. Tỷ lệ cây bị nhiễm bệnh trên bộ giống trung ngày
Viện nghiên cứu ngô, vụ xuân 2008 82

3.25. Tỷ lệ cây bị nhiễm bệnh trên bộ giống trung ngày Viện nghiên
cứu ngô, vụ xuân 2009 84

3.26. Tỷ lệ cây bị nhiễm bệnh trên bộ giống trung ngày Viện nghiên
cứu ngô, vụ xuân 2010 86

3.27. Tỷ lệ cây bị nhiễm bệnh trên bộ giống trung ngày Viện nghiên
cứu ngô, vụ thu 2007 88

3.28. Tỷ lệ cây bị nhiễm bệnh trên bộ giống trung ngày vụ thu 2008
tại Viện nghiên cứu ngô 90


xiii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
TT Chữ viết tắt Từ viết vắt
1 AP Alkaline phophattase
2 AI Amorphour inclusions
3 BVTV Bảo vệ thực vật
4 CPB Cây phát bệnh
5 CS Cộng sự
6 CT Công thức
7 CTV Cộng tác viên
8 ðHNN ðại học Nông nghiệp
9 KHT Kháng huyết thanh

36 SD Standard Deviation
37 SEM Scaning electron misoscope
38 SrMV Sorghum mosaic virus
39 TIP Thermal Inactivation Point
40 TAE Trisbase Aceticaxit ethylene diamine tetraacetate
41 TEM Transmission electron misoscope
42 UTR Untranslated Region 1

MỞ ðẦU
1. Tính cấp thiết của ñề tài
Ngô là một trong các cây lương thực quan trọng, góp phần nuôi sống
khoảng 1/3 dân số trên thế giới. Diện tích trồng ngô trên thế giới năm 2010
ñạt khoảng 159,32 triệu ha, năng suất 5,24 tấn/ha và sản lượng ñạt 853,03 tấn
(FAO STAS, USAD 2010) [59]. Những nước trồng ngô chính ở trên thế giới
là Hoa Kỳ, Trung Quốc và Brazil. Gần ñây bắp ngô bao tử ñược coi như một
loại thực phẩm cao cấp.
Ở Việt Nam, cây ngô ñược trồng cách ñây khoảng 300 năm (Ngô Hữu
Tình và CTV, 1997) [33]. Ngô là cây lương thực thứ hai sau cây lúa, ñược
trồng nhiều ở các tỉnh như Sơn La, Hà Giang, Tuyên Quang, Cao Bằng,
Hòa Bình, Hà Nội, Thanh Hóa, Nghệ An, Lâm ðồng, ðắc Lắc, ðắc Nông,
Ninh Thuận, Bình Thuận, ðồng Nai, An Giang, ðồng Tháp. Diện tích
trồng ngô ở Việt Nam ngày càng tăng. Năm 1990 diện tích ñạt 432.000 ha,
sản lượng 671 tấn/ha và năng suất ñạt 1,55 tấn/ha. Năm 2010 diện tích
1.126.900 ha, sản lượng 4,600,000 tấn/ha và năng suất ñạt 4,09 tấn/ha. (Bộ
Nông nghiệp và PTNT, 2011) [4].
Tuy vậy, sản lượng ngô trong nước vẫn chưa ñáp ứng ñủ nhu cầu hàng
năm nước ta còn phải nhập khẩu ngô (trị giá trên 500 triệu USD) ñể sản xuất

3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
3.1. Ý nghĩa khoa học
Virus khảm lùn ngô là virus gây hại nặng ở nhiều nước trên thế giới;
virus cũng là bệnh gây hại phổ biến trên cây ngô ở nước ta. Việc nghiên
cứu nguyên nhân gây bệnh và sản xuất kháng huyết thanh chẩn ñoán có ý
nghĩa khoa học giúp bổ sung tài liệu về danh mục bệnh virus ở Việt Nam.
Kết quả của ñề tài cũng giúp cho việc xác ñịnh biện pháp phòng trừ bệnh
có hiệu quả. 3

3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Nghiên cứu virus gây bệnh khảm lùn giúp bước ñầu phát hiện, mô tả
các dạng triệu chứng bệnh khảm lùn, ñể làm cơ sở cho phân biệt với các dạng
triệu chứng khác do virus gây ra trên cây ngô.
Sản xuất kháng huyết thanh nhằm sử dụng dùng trong chẩn ñoán, phát
hiện nhanh nguyên nhân gây bệnh và chọn lọc giống ngô nhằm tạo các giống
ngô sạch bệnh, kháng bệnh do virus khảm lùn ngô gây ra.
4. Những ñóng góp mới của ñề tài
Bổ sung thêm các kết quả nghiên cứu về nguyên nhân gây bệnh khảm
lùn ngô ở Việt Nam.
Lần ñầu tiên ñã sản xuất ñược kháng huyết thanh chẩn ñoán nhanh
bệnh virus khảm lùn ngô (Sugarcane mosaic virus - SCMV).
5. ðối tượng và phạm vi nghiên cứu
5.1. ðối tượng nghiên cứu
- Bệnh virus khảm lùn ngô

vùng Chương Mỹ và ðan Phượng (Hà Nội).
5.2. Phạm vi nghiên cứu

Cây ngô là một trong bốn loại cây lương thực chính của thế giới: Ngô
(Zea mays L.), lúa nước (Oryza sativa L.), lúa mì (Triticum sp.), sắn (Manihot
esculenta Crantz). Trong ñó, ba loại cây gồm ngô, lúa gạo và lúa mì chiếm
khoảng 87% sản lượng lương thực toàn cầu và khoảng 43% calori từ tất cả
mọi lương thực, thực phẩm. Trong ba loại cây này, ngô là cây trồng có sự
tăng trưởng mạnh cả về diện tích, năng suất, sản lượng và là cây có năng suất
cao nhất.
Vào năm 1961, năng suất ngô trung bình của thế giới chỉ xấp xỉ 2
tấn/ha, năm 2010 tăng gấp hơn 2,5 lần (ñạt 5,24 tấn/ha), sản lượng ñã tăng 5

hơn 4 lần từ 204 triệu tấn lên 853,03 triệu tấn, diện tích tăng hơn 1,5 lần từ
104 triệu lên 159,32 triệu hecta.
Bảng 1.1. Diện tích, năng suất, sản lượng ngô trên thế giớ
i
từ năm 1961 - 2010
Năm
Diện tích
(1000 ha)
Năng suất
(tấn/ha)
Sản lượng
(1000 tấn)
1961 104,80 2,00 204,20
2004 145,00 4,90 714,80
2005 145,60 4,80 696,30
2006 148,60 4,70 704,20
2007 157,85 4,97 784,65

- Maize rayado fino virus (MRFV) họ Marafiviruses
- Maize rough dwarf virus (MRDV) họ Reoviridae.
- Maize stem borer virus (MSBV) Unassignedviruses
- Maize sterile stunt virus (MSSV) họ Rhabdoviridae.
- Maize streak virus (MSV) họ Geminiviridae.
- Maize strip virus (MStpV) thuộc Bunyaviridae
- Maize white line mosaic satellite virus (MWlMV) thuộc Satelliteviruses
- Maize white line mosaic virus (MWLMV) họ Unassignedviruses
Trong ñó có nhiều bệnh phổ biến ở các vùng trồng ngô thế giới có thể kể
một số bệnh virus chính hại cây ngô sau:
1.2.2.1. Virus gây bệnh khảm lá ngô (Maize mosaic virus).
Lịch sử nghiên cứu: Bệnh ñược Kunkel phát hiện, quan sát và mô tả lần
ñầu tiên vào năm 1921 và tiếp tục nghiên cứu vào những năm tiếp theo
1921,1922,1927 tại Hawaii (Herold, Munz ,1967a) [69].
Virus còn có tên gọi khác là:
- Corn mosaic virus (Rev. appl.Mycol.1: 194) 7

- Corn yellow stripe virus (Rev. appl.Mycol.2: 33)
- Corn stripe virus (Rev. appl.Mycol.7: 159)
- Corn virus 1(Rev. appl.Mycol.17: 52)
- Maize stripe virus (Rev. appl.Mycol.15: 528)
- Mamor zeae (Rev. appl.Mycol.19: 299)
- Zea virus 1. (Rev. appl.Mycol.17: 52)
Ngoài ra bệnh ñược Muller ghi nhận vào năm 1939 ở Venezuela dưới cái
tên là: “Raya blanca” (Malaguti, 1963). Năm 1960, Herold, Bergold và Weibel
ñã quan sát thấy virus trên kính hiển vi ñiện tử, và bệnh tiếp tục ñược Herold và
Munz nghiên cứu vào năm 1967 (Herold, 1967) [69].


Virus thuộc nhóm bền vững (Persistant), côn trùng mang bệnh tiếp xúc
với cây một ngày hay ít hơn có thể truyền ñược bệnh. Trong cơ thể côn trùng
thời gian tiềm dục (thời gian ủ bệnh) biến ñộng từ 11 ngày ñến 7 tuần lễ
(Herold và Munz, 1965) [68].
Thời gian tồn tại của virus trong dịch cây dao
ñộng từ 24 - 48 giờ ở nhiệt ñộ 4
0
C ngưỡng pha loãng 1/10 trong nồng ñộ 0,01M
phosphate pH = 7,5 (Herold và Munz, 1967a) [69]

Các tác giả cũng xác ñịnh ñược phạm vi ký chủ của virus gồm toàn bộ cây
trồng thuộc họ hòa thảo (Gramineae), tuy nhiên người ta tìm thấy virus xuất hiện
trên cây ngô một cách tự nhiên và ở một số cây trồng, cây dại khác. (Van Hoof,
1960) và Setaria vulpiseta (Herold). ðược công bố qua các kết quả thí nghiệm
trên cây Euchlena mexicana (Nalaguti, 1963) và Sorghum (Herold). Virus ñược di
chuyển theo ñường dịch cây. Virus không truyền qua hạt giống, không truyền qua
tiếp xúc cơ học và không truyền qua dây tơ hồng. Thời gian cây mẫn cảm nhất khi
lây bệnh vào 4 - 6 tuần sau khi hạt nẩy mầm [68] [69].

Theo Sharon và CTV (2005) [79], ñã giải trình tự của 102 dòng vô tính từ
một thư viện cDNA xây dựng từ RNA virus ngẫu nhiên ñã ñược biên dịch
vào 12.133 nucleotide (nt) bao gồm 97 trình tự trung bình chiều dài 660 bp có
trình tự ñọc bao gồm cả hai sợi. Trình tự còn lại ñược xuất phát từ duy nhất
(5%) hay (2%) ñọc trên cùng một sợi. Ba trong sáu ORFs cho thấy ñiểm
tương ñồng ñáng kể ñể các chuỗi protein suy luận của các trình tự 9


10
không truyền qua hạt giống và cây tơ hồng mà virus truyền bằng 5 loại rầy:
Cicadulina mbila, C . storeyi, C. bipunctella, C. latens, C. parazeae. Ngoài ra
virus này có thể truyền qua trứng rầy (Dabrowski, 1987; Fennah,
1959; Nielson, 1986; Ruppel, 1965;Soto, 1978) [50].
Cũng nghiên cứu về bệnh này, Ruppel (1965), Storey, Howland và
Prosser (1966) ñã xác ñịnh ñược virus truyền từ 15 giây ñến 1 giờ, thời gian
tiềm dục trong côn trùng từ 6 - 12 giờ [50].
Theo kết quả nghiên cứu của tác giả Bock, Guthric cho biết virus gây
bệnh khảm sọc lá ngô có ngưỡng pha loãng là 1/100, nhiệt ñộ làm mất hoạt
tính là 60
0
C (Q
10
= 60
0
C) và thời gian tồn tại trong dạng dịch là 24 giờ ở nhiệt
ñộ phòng [50].

Tác hại: Nếu cây bị nhiễm từ nhỏ có khả năng gây lùn cây và những
cây này thường không cho năng suất. Những cây bị nhiễm ở giai ñoạn muộn
hơn thì cho bắp teo lép (Fajemisin và Soyinka, 1976) hoặc vẫn có thể phát
triển bình thường nhưng dáng cằn cỗi, cho bắp nhỏ, lép hoặc ít bắp. Vì vậy,
thiệt hại về mặt năng suất do bệnh gây nên là rất lớn. Theo thống kê của
Fajemisin và Soyinka 1976 bệnh này có thể làm giảm ñến 50,02% năng suất
so với ruộng hoàn toàn khỏe.
Bệnh khảm sọc lá ngô (MSV), có thể phá hủy hầu hết các cây trồng
ngô, ñặc hữu của vùng cận Sahara châu Phi và các ñảo lân cận Ấn ðộ Dương
nhưng trong những năm nhất ñịnh, toàn bộ cây trồng của người nông dân có
thể bị mất trắng (Science Dalily, 2007) [78].