BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000***
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM TOMATO SPOTTED
WILT VIRUS TRÊN CÀ CHUA TẠI TỈNH TIỀN GIANG
BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ XÂY DỰNG QUY
TRÌNH CHẨN ĐOÁN TOMATO SPOTTED
WILT VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT – PCR
Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2003 – 2007
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN HỒNG PHƢỚC
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2007
MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING
NONG LAM UNIVERSITY, HCMC
DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY EVALUATION ON THE STATUS QUO OF TOMATO SPOTTED
WILT VIRUS AFFECTING TOMATO PLANT IN TIEN GIANG
PROVINCE BY ELISA AND FORMULATING
THE RT – PCR PROCESS TO DIAGNOSE
TOMATO SPOTTED WILT VIRUS
Anh Chị đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp em hoàn thành tốt khóa luận.
TS. Lê Đình Đôn cùng quý Thầy – Cô trong và ngoài trƣờng đã truyền đạt
cho em nhiều kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập và làm khóa
luận.
Em xin cám ơn chị Dƣơng, chị Hƣng, chị Hạnh, anh Lẫm, anh Trƣờng, anh
Vũ đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Cảm ơn tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học K29 niên khóa 2003 – 2007, đã
luôn gắn bó, chia sẻ, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và
thực hiện khóa luận.
Con vô cùng biết ơn cha mẹ đã dạy bảo, nuôi dƣỡng con đƣợc nhƣ ngày hôm
nay, cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con
trong suốt thời gian học tập tại trƣờng. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2007.
Sinh viên
Nguyễn Hồng Phƣớc
v
TÓM TẮT KHÓA LUẬN
Nguyễn Hồng Phƣớc, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 9 năm
2007, “Đánh giá tình trạng nhiễm Tomato Spotted Wilt Virus trên cà chua
bằng kỹ thuật ELISA và xây dựng quy trình chẩn đoán Tomato Spotted
Wilt Virus bằng kỹ thuật RT – PCR” đƣợc thực hiện từ tháng 3 đến tháng 8
năm 2007 tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh thuộc Viện Nghiên
Cứu Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trƣờng (RIBET), Trƣờng Đại Học
Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
Nội dung thực hiện:
Thu mẫu có triệu chứng nhiễm TSWV tại xã Bình Ninh và xã Hòa Định
Collecting the samples with Tomato Spotted Wilt Virus symptoms in Binh
Ninh and Hoa Dinh villages of Cho Gao district, Binh Nhi and Thanh Nhat of
Go Cong town.
Diagnosing Tomato Spotted Wilt Virus in tomato at Binh Ninh, Hoa Dinh,
Binh Nhi anh Thanh Nhat villages of Tien Giang province by DAS – ELISA
kit.
Samples of Tomato Spotted Wilt Virus with positive reaction are selected
to conduct the RT – PCR. The RT – PCR protocol to diagnose Tomato Spotted
Wilt Virus was tested.
The results of this research are as follows:
1. DAS – ELISA result data show that:
Cho Gao district:
Hoa Dinh village: 12,0 %
Binh Ninh village: 13,16 %
Go Cong town:
Binh Nhi village: 14,29 %
Thanh Nhat village: 10,0 %
2. Finding out the one step RT – PCR process to diagnose Tomato Spotted Wilt
Virus.
vii
MỤC LỤC
NỘI DUNG TRANG
LỜI CẢM TẠ ............................................................................................................ iv
TÓM TẮT KHÓA LUẬN .......................................................................................... v
SUMMARY .............................................................................................................. vi
MỤC LỤC ................................................................................................................ vii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................ x
DANH SÁCH CÁC HÌNH ....................................................................................... xi
DANH SÁCH CÁC BẢNG ..................................................................................... xii
2.3.5. Phƣơng pháp RT – PCR .......................................................................... 19
2.3.5.1. Nguyên tắc của phƣơng pháp PCR .................................................. 19
2.3.5.2. Nested PCR ...................................................................................... 20
2.3.5.3. RT – PCR (Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction) . 20
2.4. Một số kết quả nghiên cứu về TSWV ............................................................ 23
2.4.1. Nghiên cứu nƣớc ngoài ........................................................................... 23
2.4.2. Nghiên cứu trong nƣớc ........................................................................... 23
Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 24
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .................................................................. 24
3.2. Vật liệu ........................................................................................................... 24
3.2.1. Dụng cụ và thiết bị .................................................................................. 24
3.2.1.1. Dụng cụ ............................................................................................ 24
3.2.1.2. Máy móc, thiết bị ............................................................................. 25
3.2.2. Hoá chất .................................................................................................. 25
3.2.2.1. Hoá chất dùng trong kỹ thuật ELISA............................................... 25
3.2.2.2. Hóa chất dùng trong kỹ thuật RT – PCR ......................................... 26
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................ 28
3.3.1. Nội dung nghiên cứu ............................................................................... 28
3.3.2. Phƣơng pháp lấy mẫu .............................................................................. 28
ix
3.3.3. Phƣơng pháp phát hiện TSWV ............................................................... 30
3.3.3.1. Phƣơng pháp ELISA ........................................................................ 30
3.3.3.2. Phƣơng pháp RT – PCR ................................................................... 32
3.3.3.3. Đổ gel điện di ................................................................................... 38
Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 40
4.1. Kết quả phát hiện TSWV bằng kỹ thuật ELISA ............................................ 40
4.1.1. Tỉ lệ nhiễm TSWV tại hai xã thuộc huyện Chợ Gạo .............................. 40
4.1.2. Tỉ lệ nhiễm TSWV tại hai xã thuộc thị xã Gò Công ............................... 41
4.1.3. Tỉ lệ nhiễm bệnh TSWV của huyện Chợ Gạo và thị xã Gò Công .......... 42
4.1.4. Tỉ lệ nhiễm TSWV theo triệu chứng ....................................................... 43
T
a
: Annealing temperature
T
m
: Melting temperature
UV: Ultra violet
OD: Optical density
xi
DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH TRANG
Hình 2.1. Cấu trúc virus TSWV ................................................................................ 10
Hình 2.2. Chu trình sống của bọ trĩ ........................................................................... 12
Hình 2.3. Triệu chứng TSWV trên cà chua .............................................................. 14
Hình 2.4. Quy trình RT – PCR một bƣớc ................................................................. 21
Hình 2.5. Quy trình RT – PCR hai bƣớc ................................................................... 21
Hình 4.1. Kết quả điện di RNA tổng số .................................................................... 44
Hình 4.2. Kết quả điện di sản phẩm cDNA .............................................................. 45
Hình 4.3. Kết quả điện di sản phẩm RT – PCR một bƣớc ....................................... 47 xii
DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG TRANG
Bảng 2.1. Thành phần dinh dƣỡng trong 100 g thịt trái cà chua (McGlasson, B.,
1993; PROSEA, 1994) ................................................................................ 5
Bảng 3.1. Sơ đồ bố trí lấy mẫu .................................................................................. 30
Bảng 3.2. số lƣợng mẫu và vị trí lấy mẫu ................................................................. 30
Tiền Giang với điều kiện khí hậu thích hợp, nƣớc tƣới dồi dào và đất đai
màu mỡ rất phù hợp để trồng rau màu, trong đó cà chua chiếm diện tích khá lớn, nó
nhƣ là nguồn thu nhập không thể thiếu của ngƣời dân nơi đây. Nhƣ là một quy luật
của tự nhiên, đi đôi với sự gia tăng về diện tích, tăng cƣờng thâm canh thì dịch bệnh
gia tăng không kém. Dịch bệnh là một trong những trở ngại lớn cho việc canh tác
của ngƣời dân, dịch bệnh làm thiệt hại không nhỏ cho thu nhập ngƣời dân và ngân
sách nhà nƣớc. Trong số những bệnh hại cây trồng thì bệnh do virus là nguy hiểm
nhất do chƣa có thuốc trị đặc hiệu, kèm theo là khả năng lây lan rất nhanh, khó nhận
biết ở giai đoạn sớm, và khi phát thành bệnh thì đã gây thiệt hại rất lớn không thể
kiểm soát đƣợc.
Trong số những bệnh do virus gây ra thì TSWV gây thiệt hại rất lớn cho
việc canh tác cà chua, thuốc lá và những cây trồng họ Solanaceae. Điều đó đặt ra
một nhu cầu cấp thiết làm sao để sớm phát hiện và loại bỏ cây bị nhiễm. Đây không
chỉ là vấn đề quan trọng đối với các nƣớc Trung Quốc, Mỹ, Brazil, Mehico… mà
còn đối với các nƣớc nhiệt đới khác, trong đó có Việt Nam.
Ngày nay với sự phát triển vƣợt bậc khoa học và công nghệ đặc biệt là của
công nghệ sinh học, các kỹ thuật phân tử đã giúp cho việc chẩn đoán sớm bệnh một
cách nhanh, chính xác nhiều bệnh virus.
2
Xuất phát từ thực tế trên cùng với sự chấp nhận của Bộ môn Công Nghệ
Sinh Học, Trƣờng Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh và sự hƣớng dẫn của
PGS.TS. Bùi Cách Tuyến, chúng tôi tiến hành đề tài “Đánh giá tình trạng nhiễm
Tomato Spotted Wilt Virus trên cà chua tại tỉnh Tiền Giang bằng kỹ thuật
ELISA và xây dựng quy trình chẩn đoán Tomato Spotted Wilt Virus bằng kỹ
thuật RT - PCR” nhằm góp phần kiểm soát dịch bệnh.
1.2. Mục đích
Chẩn đoán bệnh TSWV trên cà chua tại Tiền Giang bằng kỹ thuật ELISA.
Xây dựng hoàn chỉnh quy trình chẩn đoán Tomato Spotted Wilt Virus
bằng kỹ thuật RT – PCR.
4
2.1.2. Phân loại học
Lớp (Class) Magnoliopsida
Lớp phụ (Subclass) Asteridae
Bộ (Order) Solanales
Họ (Family) Solanaceae
Giống (Genus) Solanum
Loài (Species) Solanum lycopersicum
Tên tiếng Anh Tomato
Tên tiếng Việt Cà chua
2.1.3. Đặc điểm thực vật học
Cây cà chua có bộ nhiễm sắc thể lƣỡng bội 2n = 24, cây thân thảo hằng
niên hoặc lƣu niên, là cây tự thụ phấn.
Rễ cà chua thuộc loại rễ chùm, có khả năng phát triển rộng và sâu rất
nhanh. Rễ cà chua có thể ăn sâu tới 1 – 1,5 m (điều kiện tối hảo), hệ rễ phát triển
chủ yếu ở tầng đất 0 – 30 cm. Rễ cà chua phát triển rất mạnh ở giai đoạn cây con,
khi rễ chính bị đứt thì rễ phụ phát triển rất nhanh.
Thân cây cà chua thuộc loại thân bụi. Cà chua có đặc tính phân cành rất
mạnh (một nách lá có một mầm nách), thân có nhiều đốt. Lúc nhỏ toàn thân phủ
một lớp lông tơ mềm, chứa nhiều nƣớc, thân dòn dễ gãy, có dạng hình tròn hay hình
bầu dục.
Lá cà chua thuộc loại lá kép lông chim lẻ, mỗi lá kép có từ 3 – 4 đôi lá
chét, ở ngọn có một lá riêng biệt gọi là đỉnh lá. Mỗi lá chét có răng cƣa sâu nông
khác nhau tùy giống, trên mặt lá có một lớp lông tơ.
Hoa thuộc loại hoa hoàn chỉnh, hoa tự thụ phấn là chủ yếu, không có mùi
thơm và hoa tiết ra nhiều chất độc. Số lƣợng hoa trên chùm thay đổi tùy giống và
tùy thời tiết, thƣờng từ 5 – 20 hoa.
5
nhau, nhƣng có thể chia làm 2 nhóm nguyên nhân chính gây bệnh trên cà chua là
bệnh do ký sinh và bệnh không do ký sinh.
Bệnh do ký sinh gồm có: bệnh do nấm, vi khuẩn, virus, tuyến trùng…
Bệnh không do ký sinh thƣờng là do nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng không
thích hợp hay bởi sự mất cân bằng dinh dƣỡng…
Riêng đối với bệnh virus thì trên cây cà chua vùng nhiệt đới có rất nhiều
loại virus gây hại nhƣ :
Bệnh khảm vàng: TMV (Tomato Mosaic Virus)
Bệnh khảm mảng lồi lõm: CMV (Cucumber Mosaic Virus)
Bệnh đốm héo: TSWV (Tomato Spotted Wilt Virus)
Bệnh xoăn ngọn cà chua: TLCV (Tomato Leaf Curl Virus)
Bệnh xoăn vàng ngọn: TYLCV (Tomato Yellow Leaf Curl Virus)
Bệnh đốm hình nhẫn: TRSV (Tomato Black Ring Virus)
Bệnh lùn lụi cà chua: TBSV (Tomato Bushy Stunt Virus)
(Nguồn: Phạm Văn Biên, Bùi Cách Tuyến và Nguyễn Mạnh Chinh, 2003)
2.2.1. Đặc điểm chung bệnh do virus (Vũ Triệu Mân, 1999)
Virus thực vật thuộc loại ký sinh chuyên tính cao độ. Chúng thiếu hệ thống
men, hoàn toàn phụ thuộc vào tế bào sống của cây trồng để phát triển và tích lũy số
lƣợng.
Virus có thể nhiễm bệnh cho một hay nhiều loài cây và một loài cây có thể
nhiễm một hay nhiều virus.
Virus không giết chết tế bào mà dùng vật chất của tế bào chủ tạo thành
nhiều virus mới. Cơ thể thực vật kiệt quệ dẫn đến thoái hóa, suy tàn và có thể chết.
7
Virus thực vật không có cấu tạo tế bào, là những nucleoprotein kích thƣớc
rất nhỏ bé, cấu tạo rất đơn giản: là protein và acid nucleic mà chủ yếu là RNA. Tuy
nhiên, cũng có khoảng 25 loài virus chứa DNA.
Protein gồm nhiều loại acid amin tạo thành: Alanin, glycin, lizin, aginin,
ở cây bệnh và có thể lây ngay.
Nhóm virus bền vững là những virus có thể sống bền vững trong cơ thể
côn trùng một thời gian từ vài giờ tới vài tuần lễ mới có khả năng truyền
bệnh cho cây và có thể truyền bệnh đến suốt đời.
Nhóm virus bán bền vững là những virus có kiểu truyền bệnh trung gian
giữa hai nhóm trên.
Trong mối quan hệ sinh học giữa virus và côn trùng thì virus rất có lợi:
Tăng về số lƣợng, tăng cƣờng tính ký sinh gây bệnh và đƣợc đƣa vào đúng tầng mô
mẫn cảm bệnh. Nhƣng côn trùng môi giới sẽ bị giảm tuổi thọ, sức sinh sản và sức
sống giảm.
Truyền bệnh nhờ nấm: đa số các nấm sống trong đất đều có khả năng
truyền bệnh virus cho cây.
Truyền bệnh bằng dây tơ hồng: đây là thực vật thƣợng đẳng ký sinh tạo rễ
ăn sâu vào thân cây sống để hút nhựa. Do vậy, có nhiều loại virus thực vật di
chuyển theo thân dây tơ hồng đi từ cây này sang cây khác để gây bệnh.
2.2.3. Sơ lƣợc về TSWV
2.2.3.1. Nguồn gốc TSWV
TSWV có phổ ký chủ rất rộng ở cả vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên
toàn thế giới. TSWV đƣợc báo cáo đầu tiên vào năm 1915 khi gây thiệt hại rất lớn
trên cà chua ở Úc, sau đó đƣợc mô tả chính xác là bệnh gây ra bởi virus
(Brittlebank, 1919). Đến năm 1920, bệnh đã lan tràn trên khắp lãnh thổ Australia và
nhiều vùng trên thế giới. Bên cạnh ớt, cà chua và các loại hoa màu chính yếu nhạy
cảm với TSWV thì còn có cây họ cúc, khoai tây, đậu phụng, thuốc lá, rau diếp, và
một số loại hoa màu khác.
9
Vào những năm 1960, TSWV đã gây ra nhiều thiệt hại cho cà chua trồng
tại Hawaii.
Năm 1970, lần đầu tiên TSWV đƣợc xác định là gây bệnh tại Georgia.
Năm 1971, TSWV gây bệnh trên cây đậu phộng ở Texas và hủy hoại nặng
Hình 2.1. Cấu trúc virus TSWV
2.2.3.3. Phân loại TSWV
TSWV thuộc họ Bunyaviridae, họ Bunyaviridae có 5 giống là:
Bunyavirus, Hantavirus, Nairovirus, Phlebovirus và Tospovirus. Trong đó
Tospovirus là một trong mƣời virus gây bệnh cây phổ biến nhất.
TSWV đƣợc phân là đại diện duy nhất của nhóm đơn thân xuất xứ từ
nhóm “Tomato Spotted Wilt Virus” (Mathews, 1979). Năm 1989, TSWV đƣợc chia
thành TSWV dòng L và TSWV dòng I; đến giữa những năm 1989 – 1992, hai dòng
này đƣợc xác định có đặc tính huyết thanh học khác nhau và chúng đƣợc đổi tên
thành TSWV (TSWVdòng L) và INSV (TSWV dòng I).
Hiện nay, TSWV đƣợc phân loại là nhóm nguyên thủy của chi Tospovirus
mới trong họ Bunyaviridae. Ngƣời ta dựa trên đặc tính huyết thanh và trình tự
nucleotide mà chia ra làm 6 loài:
Tomato Spotted Wilt Virus (nhóm huyết thanh I).
Groundnut Ring Spot Virus GRSV (nhóm huyết thanh II).
Tomato Chlorotic Spot Virus TCSV (nhóm huyết thanh III).
Impatiens Necrotic Spot Virus INSV (nhóm huyết thanh IV).
Groundnut Bud Necrosis Virus GBNV (nhóm huyết thanh V).
Wattermelon Silver Molt Virus WMSMV.
11
2.2.3.4. Dãy ký chủ của TSWV
TSWV có phổ ký chủ rất rộng, chúng tấn công trên nhiều cây cảnh, cỏ dại
và nhiều cây trồng khác nhau trên toàn thế giới. Hiện nay danh sách ký chủ của
TSWV khoảng 1000 loài cây, thuộc 15 họ thực vật một lá mầm, 69 họ thực vật hai
lá mầm và một họ thực vật có hoa ẩn (German và cộng sự, 1992).
Ký chủ mẫn cảm với TSWV gồm các loại cây trồng quan trọng nhƣ ớt,
đậu nành, khoai tây, thuốc lá, cà chua, cần tây, rau diếp và nhiều loại cây cảnh. Ở
sơ cấp. Bốn là quá trình dịch mã của các đoạn mRNA L và S bởi các ribosome tự
do, trong khi đó sự dịch mã của các đoạn mRNA M bởi các ribosome gắn trên
màng. Năm là giai đoạn tổng hợp và phủ (encapsidation) một đầu bằng đoạn
nucleotide để thích hợp nhƣ là những khuôn mẫu đối với RNA genome hoặc trong
một số trƣờng hợp là những mRNA. Sáu là sự tái bản genome tiếp theo là sự sao mã
thứ cấp. Sau đó là sự tạo hình, bao gồm cả protein G1 và G2 từ genome M trong
tiểu thể golgi. Giai đoạn cuối cùng trong tiến trình xâm nhiễm là sự hợp nhất giữa
Copyright: Tài liệu đại học ©