ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ THÙY NHUNG
CÁC PHẢN ỨNG CỦA MÀNG TẾ BÀO
ĐỐI VỚI TÁC DỤNG CỦA CÁC XUNG ĐIỆN
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Mã số : 60. 44. 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :
GS. TSKH. Nguyễn Ái Việt
Hà Nội – 2010
Mục lục
Lời cảm ơn 3
Mở đầu 5
1 Tổng quan về màng tế bào 8
1.1 Khái niệm màng tế bào . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.2 Thành phần cấu tạo của màng tế bào . . . . . . . . . . . . 10
1.3 Sự vận chuyển chất hoà tan qua màng . . . . . . . . . . . 12
2 Thuyết electroporation 18
2.1 Trạng thái không thuận nghịch của hiện tượng electroporation 21
2.2 Trạng thái khả nghịch của hiện tượng electroporation . . 22
trường điện một chiều. Đường gạch: kết quả của Kotnik [1],
đường liền: những tính toán của chúng tôi. . . . . . . . . . 40
3.8 Điện thế cảm ứng thay đổi theo thời gian khi chịu kích thích
của xung điện hình thang. Đường gạch: kết quả của Kotnik
[1], đường liền: những tính toán của chúng tôi. . . . . . . . 40
3.9 Điện thế cảm ứng thay đổi theo thời gian khi chịu kích thích
của xung điện hình thang. Đường gạch: kết quả của Kotnik
[1], đường liền: những tính toán của chúng tôi. . . . . . . . 40
2
3.10 Mật độ dòng qua lỗ (Đường gạch) và qua tụ (Đường liền)
trong trường hợp xung dài . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
3.11 Mật độ lỗ theo thời gian đối với tác dụng của các xung dài 41
3.12 Mật độ dòng qua lỗ (Đường gạch) và qua tụ (Đường liền)
trong trường hợp xung ngắn . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
3.13 Mật độ lỗ theo thời gian đối với tác dụng của các xung ngắn 41
3.14 Điện thế của màng TB (Đường liền) và của màng bào quan
(Đường gạch) của TB B thường . . . . . . . . . . . . . . . 43
3.15 Điện thế của màng TB (Đường liền) và của màng bào quan
(Đường gạch) của TB B ung thư. . . . . . . . . . . . . . . 43
3.16 Điện thế của màng TB (Đường liền) và của màng bào quan
(Đường gạch) của TB B thường, sử dụng các thông số mới. 44
3.17 Điện thế của màng tế bào (Đường liền) và của màng bào
quan (Đường gạch) của TB B ung thư, sử dụng các thông
số mới. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
3.18 Sự phân bố năng lượng của TB B thường theo tần số,
(Đường đậm: màng trong, đường liền nhạt: màng ngoài,
đường gạch: môi trường ngoài). . . . . . . . . . . . . . . . 45
3.19 Sự phân bố năng lượng của TB B ung thư theo tần số,
(Đường đậm: màng trong, đường liền nhạt: màng ngoài,
đường gạch: môi trường ngoài). . . . . . . . . . . . . . . . 45
Mở đầu
Sự kết hợp giữa vật lý và sinh học đã thúc đẩy các nghiên cứu về màng
mỏng trong suốt vài thập kỷ qua bao gồm các nghiên cứu có tính chất
cụ thể (thuộc về sinh học) và các nghiên cứu có tính chất tổng quát hơn
(thuộc về vật lý). Các nhà vật lý luôn bị cuốn hút bởi sự đa dạng trong
các cấu trúc và sự vận động của màng tế bào.
Hình 1: Màng tế bào plasma
Các quá trình vận động của màng tế bào được nghiên cứu và tìm hiểu
sâu hơn cùng với sự phát triển của kỹ thuật thực nghiệm.
Tế bào là thành phần không thể thiếu được trong mỗi cơ thể sống. Mỗi
tế bào được bảo vệ bởi màng tế bào. Lớp màng đôi lipid là một trong những
5
viên gạch cấu trúc quan trọng bậc nhất trong tế bào . Một lớp màng bao
gồm một rào thế linh động ngăn cách phần bên trong và bên ngoài của
tế bào, bảo vệ các bào quan (nhân và các vật liệu di truyền), có vai trò
như là một trung tâm chức năng hoá cho việc sản sinh các protein. Màng
sinh học có nhiều hình dạng khác nhau phụ thuộc vào cấu trúc, chức năng,
như hình phẳng (màng plasma), hình cầu, hình trụ hoặc có dạng phức tạp
hơn (Endoplasmic Recticulum, ER và bộ máy Golgi). Bề mặt của màng
lipid có hệ các điện tích linh động bao quanh, tính chất tương tự như các
hệ điện tử trên bề mặt hêli lỏng. Bề mặt của màng tế bào trong các môi
trường dung dịch có thể tích điện âm. Các lớp điện tích khuyếch tán từ
dung dịch rất linh động. Chúng sẽ chắn mặt màng và hình thành các lớp
điện tích dương hai chiều tích tụ ở sát mặt trong và mặt ngoài của màng
tế bào. Thêm vào đó, do các ion khác loại của các kênh ion trên màng có
khả năng thẩm thấu khác nhau nên phần trong của màng luôn được duy
trì ở mức điện thế âm hơn so với phía bên ngoài môi trường. Các cơ chế
cổng của các kênh ion trên màng tế bào được cho là có thể mở ra việc sử
dụng các cổng cảm nhận điện thế và đang là một vấn đề mở trong lý sinh
học.
quả gấp khoảng 10 lần so với quá trình chuyển hoá hoá học.
Trong luận văn này, chúng tôi xét mô hình màng tế bào được kích thích
bởi các xung điện cực mạnh. Khi chịu tác dụng này, trên màng tế bào sẽ
xuất hiện điện thế cảm ứng, dẫn đến hiện tượng electroporation. Kotnik
(2006) [?] đã nghiên cứu về điện thế chuyển màng nhưng không tính đến
hiện tượng electroporation. Ở đây, chúng tôi đã đưa ra một phương pháp
mới, phương pháp K-Wand để tính điện thế cảm ứng trên màng tế bào và
chứng minh sự tồn tại của hiện tượng electroporation. Phương pháp của
chúng tôi không chỉ áp dụng cho màng lipid kép mà còn có thể dùng cho
tế bào 3 lớp màng, mitochodria và xác định các tế bào ung thư qua việc
xác định năng lượng làm nóng chúng.
Ngoài phần mở đầu và kết luận, luận văn được chia thành 3 chương:
Chương I, chúng tôi trình bày tổng quan về màng tế bào. Sơ lược về lý
thuyết electroporation được trình bày trong chương II. Cuối cùng, chương
III là phương pháp và các kết quả đạt được của chúng tôi khi nghiên cứu
về các phản ứng của màng tế bào đối với kích thích của các xung điện
mạnh cực ngắn.
7
Chương 1
Tổng quan về màng tế bào
Cuối thế kỉ 19, các nhà sinh học bắt đầu nghi ngờ rằng lớp vỏ bao
quanh tế bào có chứa thành phần lipid từ công trình nghiên cứu của Ernst
Overton (1899). Ông đã chỉ ra rằng một vài loại phân tử nhuộm không tích
điện, về mặt hoá học gần giống với lipid, có thể xâm nhập vào trong tế bào
dễ dàng hơn các phân tử cấu tạo không giống lipid. Nhờ có công trình của
Chevural đầu thế kỷ XVIII, tính chất vật lý và hoá học của axit béo đã được
hiểu một cách đầy đủ. Sử dụng bazơ và triglixerit mạnh là chất thử, ông
đã tìm ra các tính chất của các phân tử có liên quan đến việc dự trữ năng
lượng và sản xuất màng tế bào này.
Sau đó, vào năm 1925, một thí nghiệm đánh dấu một bước ngoặt lớn
tế bào.
Màng tế bào không phải là tấm chắn thụ động. Chúng bao gồm các loại
protein đặc biệt kích thích hay xúc tác khác nhau. Các bơm vận chuyển
các chất tan hữu cơ đặc biệt và các ion vô cơ qua màng ngược với gradient
nồng độ, biến đổi năng lượng từ dạng này sang dạng khác.
Màng được chia thành ba miền: miền ngoài, miền trong và miền giữa.
Phân tích hoá học cho thấy màng chủ yếu được cấu tạo từ các lớp kép
photpho-lipid được bao phủ bởi các ion tự do, lớp này thường tích điện
âm với nồng độ rất cao tức là ở trạng thái plasma. Vì vậy, màng sinh chất
còn được gọi là màng kiểu plasma. Plasma tế bào đóng vai trò quan trọng
trong việc trao đổi chất và trao đổi thông tin qua lại giữa tế bào và môi
9
trường.
1.2 Thành phần cấu tạo của màng tế bào
Để hiểu được chức năng của màng tế bào, ta phải xác định rõ các thành
phần cấu tạo của chúng. Cấu tử chính của màng sinh chất là các protein
và lipid có cực. Tỷ lệ giữa protein và lipid khác nhau ở các loại màng khác
nhau. Các lipid trong màng tế bào chủ yếu là photpho-lipid, ngoài ra còn
có các lipid khác như galactolipit, triaxylixerol
Hình 1.1: Cấu trúc hai lớp của màng sinh học
Tất cả các màng sinh chất đều có tính chất cơ bản: Chúng không có
khả năng thẩm thấu đối với nhiều chất tan có cực hay tích điện nhưng có
khả năng thẩm thấu đối với các hợp chất không cực. Khi quan sát lớp cắt
ngang nhờ kính hiển vi điện tử, màng dày từ 5-8 nm. Màng có cấu trúc
khảm lỏng. Độ lỏng của lớp kép photpho-lipid phụ thuộc vào nhiệt độ. Cụ
thể, nhiệt độ có thể làm cho chúng chuyển từ dạng tinh thể đặc tới lỏng
hơn.
Thành phần và kết cấu của lipid
Hợp chất phospholipids trong tế bào tự động tạo nên các lớp màng đôi
phospholipids dạng tấm mỏng, với độ dày khoảng hai lần kích thước phân
tử khuyếch tán ra các bên với tốc độ rất nhanh.
11
Protein
Màng sinh chất khác nhau có protein khác nhau. Nhiều loại protein đóng
vai trò như chất vận chuyển, mỗi loại phụ trách vận chuyển một chất hoà
tan riêng đi qua màng. Một số protein có liên kết cộng hoá trị với một hoặc
nhiều lipid. Protein sắp xếp không đối xứng do khác nhau về chức năng.
Ta có thể chia protein màng thành hai loại: Protein xuyên màng và protein
rìa màng. Protein xuyên màng liên kết chặt chẽ với màng còn protein rìa
màng thì liên kết yếu hơn. Protein xuyên màng không tan trong nước. Sự
không tan của chúng là do sự có mặt của phần lớn các axit amin giàu nhóm
kỵ nước. Còn các protein rìa màng dễ dàng hoà tan trong nước. [6]
Protein rìa màng liên kết thuận nghịch với màng. Rất nhiều protein
rìa màng được gắn chắc với màng nhờ tương tác tĩnh điện và liên kết hy-
dro với vùng ưa nước của protein xuyên màng và các nhóm đầu phân cực
của các lipid màng. Protein rìa màng đóng vai trò như các chất điều hoà
các enzym liên kết màng hay giới hạn sự chuyển động của một số protein
màng. Khi nghiên cứu cấu trúc màng sinh chất, người ta đặc biệt chú ý
đến các protein xuyên màng. Protein xuyên màng có tác dụng nối buộc lớp
kép lipid, điều khiển chất tan hoặc các tín hiệu đi qua màng. Chúng bắc
qua bề dày của lớp kép và kéo lồi ra cả bên trong và bên ngoài bề mặt màng.
1.3 Sự vận chuyển chất hoà tan qua màng
Mọi tế bào sống lấy ở xung quanh các nguyên liệu thô để tổng hợp sản
xuất năng lượng và thải ra môi trường những chất không cần thiết. Màng
sinh chất chứa các protein đặc biệt giúp mang vào tế bào các chất cần
thiết như đường, các axit amin, các ion vô cơ Trong nhiều trường hợp,
các thành phần này chuyển vào trong tế bào ngược với gradien nồng độ.
Một số loại khác được bơm ra để duy trì nồng độ thấp hơn ở môi trường
xung quanh. Sự di chuyển của các phân tử nhỏ đi qua màng sinh chất nhờ
12
K
+
139 4
Na
+
12 145
Cl
−
4 116
HCO
−
3
12 29
X
−
138 9
Mg
2
+ 0.8 1.5
Ca
2
+ <0.0002 1.8
Bảng 1.1: Nồng độ các ion điển hình trong tế bào động vật
và nồng độ K
+
cao hơn so với môi trường xung quanh.
Sự không cân bằng này được duy trì nhờ hệ thống vận chuyển tích cực
trong màng sinh chất gồm có enzym Na
+
K
thế. Trên thực tế, màng tế bào có nhiều protein xuyên màng đóng vai trò
các kênh vận chuyển ion như kênh Na
+
, K
+
, Kênh K
+
cho phép ion K
+
đi qua nhưng ngăn chặn các loại ion khác như Cl
−
, sự vận chuyển này là
do cơ chế khuyếch tán gây ra bởi gradient nồng độ. Dòng ion dương khuếch
tán có xu hướng tập trung ở ngăn phải hình 1.2c gây ra một sự tích điện
dương ở ngăn phải và âm ở ngăn trái. Sự dư thừa các ion này chỉ xuất hiện
ở khu vực gần màng bởi các điện tích trái dấu hút nhau. Kết quả là, một
điện trường trên màng được sinh ra kèm theo sự chênh lệch điện thế giữa
ngăn phải và ngăn trái, ngăn trái có điện thế âm so với ngăn phải. Trạng
thái cân bằng được thiết lập nhanh chóng ứng với độ chênh thế xác định
khi các yếu tố gây ra dòng khuếch tán cân bằng nhau: đó là gradient nồng
độ và điện thế trên màng. Đây là loại màng bán thấm, về chức năng thì
giống với một tụ điện gồm phần điện môi (lõi ưa nước) và phần bản tụ
(các nhóm đầu cực phospholipid và các ion trong dung dịch). Ở trạng thái
cân bằng, hiệu điện thế cân bằng liên hệ với nồng độ khối cation của hai
ngăn bởi phương trình Nernst [6]: V
K
=
RT
ZF
ln
Thuyết electroporation
Electroporation [7] là hiện tượng màng sinh học liên quan đến những biểu
hiện cơ bản của tế bào và các màng giả hai lớp. Hiện tượng này thu hút
sự quan tâm đặc biệt của các nhà khoa học không chỉ vì những ảnh hưởng
sâu sắc của nó lên những biểu hiện của màng mà còn vì các ứng dụng
điện thế quan trọng trong sinh học, công nghệ sinh học và y học. Vì thế,
những hiểu biết cơ bản về cơ chế của hiện tượng electroporation là rất
quan trọng. Trong phần này, chúng tôi sẽ trình bày về những mô hình lý
thuyết đã được đề xuất, những giả thiết, sự thành công cũng như những
thất bại của các mô hình này. Chúng tôi đặc biệt quan tâm đến các mô
hình lỗ tạm thời do nước tạo thành, mà có thể giải thích cho : (1) những
đặc trưng điển hình của sự bất định cơ học (hệ quả bất khả nghịch của
electroporation) trong hai lớp lipid phẳng tại những hiệu điện thế cao. (2)
Những biểu hiện điện khả nghịch điển hình của các màng phẳng nói chung
và của các màng của tế bào và (3) Một vài đặc trưng của sự vận chuyển
phân tử.
Hiện tượng điện từ thầm hoá (electropermeabilization hay electropora-
tion) của tế bào đã được biết đến từ vài thập kỷ và gần đây đã nhận được
sự quan tâm của những nghiên cứu về tế bào và các mô. Rất nhiều quan
sát ban đầu đã đề xuất rằng một vài loại "phá vỡ do điện " có thể xuất hiện
trong các màng được kích thích điện. Gần mười năm sau đó, các báo cáo
đã đưa về sự việc các xung điện có thể giết chết các vi sinh vật và không
18
sinh nhiệt. Và không lâu, với việc tìm ra nhờ các túi sinh học, giới khoa
học đã đánh dấu một một mốc quan trọng về hiện tượng electroporation.
Những nghiên cứu thực nghiệm sau đó đã được thúc đẩy nhanh hơn, như
việc khám phá ra hệ thống vận chuyển các phân tử trong tế bào máu và
sự tăng độ dẫn của một màng cụ thể lên khoảng 1 Scm
−
2 trong 1 µs khi
U = 1.5r
cell
E
e
cosθ (2.1)
trong đó U là thế màng chuyển, r
cell
là bán kính và θ là góc giữa mặt trên
màng tế bào nơi U được đo và hướng của
−→
E
e
. Ở các cực (θ = 0, π), 75%
điện thế tập trung ở vùng gần tế bào, dọc theo các màng của chúng. Cường
độ điện trường của màng chuyển, E
m
, lớn hơn so với E
e
. Độ khuếch đại
tương ứng với sự tập trung trường này là E
m
/E
e
= 1.5r
cell
/h = 2 × 10
3
đối với r
cell
= 10µm và độ dày của màng là h ≈ 5 × 10
20
2.1 Trạng thái không thuận nghịch của hiện tượng
electroporation
Một đặc trưng quan trọng trong cấu hình thực nghiệm của lớp màng kép
phẳng là sau sự tích điện của màng, điện thế của các điện cực và điện thế
chuyển màng trở nên cân bằng nhau, nếu điện trở của màng lớn ở thời
điểm trước khi các lỗ được tạo thành trên màng.
Các đo đạc thực nghiệm về dòng qua màng chuyển, I(t) chỉ ra rằng tiếp
theo sự chuyển trong điện thế được đặt vào các điện cực, U
0
sau quá trình
tích điện ở màng, một dòng ổn định sẽ xuất hiện, phụ thuộc vào U. Sau
đó, dòng sẽ dao động δI do sự tăng một chiều I tới giá trị bão hoà. Trong
miền bão hoà của I, trên màng bị thủng (rupture). Điều này được khẳng
định bằng việc hiệu điện thế U giảm và dòng I qua các lỗ màng có giá trị
giống như không có màng . Nếu một màng mới được tạo ra và ta lặp lại thí
nghiệm này thì dòng I được sản ra vẫn có giá trị cũ, tuy nhiên, thời gian
sống của màng, τ
m
(được định nghĩa là thời gian từ khi điện thế ở mức
0 đến khi lên mức 1 của sự tăng dòng mạnh) thường sẽ khác. Đặc trưng
của các thăng giáng, và khoảng thời gian hiện tượng thăng giáng diễn ra,
cũng khác nhau. Tóm lại, độ dẫn và thời gian sống của màng đều thể hiện
những thuộc tính biến thiên ngẫu nhiên. Đó là kết luận chính để có thể
nói rằng hiện tượng tạo lỗ trên màng không có cơ chế hoàn toàn tất định.
Thêm vào đó, khi U tăng thời gian sống trung bình của màng được nhận
thấy là giảm đi rất nhanh. Trong một nghiên cứu điển hình, màng lipid của
não được sử dụng với điện thế bước V
0
= 0.4V [8]. Thời gian sống trung
¯τ U
gần như tuyến tính. Do đó, khi tăng U đến 100 mV thì ¯τ giảm đi 10 lần.
Với hiệu điện thế U lớn hơn, sự giảm ¯τ tương ứng với sự tăng U trở nên
kém rõ ràng hơn. Ví dụ, khi U tăng từ 200 mV đến 1.4 V, ¯τ
m
giảm hơn
sáu lần độ lớn, đạt tới khoảng 10µs. Trạng thái này phù hợp với lý thuyết
về lỗ sẽ được trình bày trong phần 2.2 .
2.2 Trạng thái khả nghịch của hiện tượng electropo-
ration
Phương pháp phục hồi điện tích cũng đã được dùng để chỉ ra rằng khi
màng cholesterol bị oxy hoá được tích điện nhanh (400ns) đạt khoảng 1V,
độ lớn của điện trở của màng giảm thuận nghịch xuống gần chín bậc [9].
Điểm đáng chú ý là điện thế không thể vượt quá U ≈ 1.2V dù cường độ
xung tiếp tục tăng mạnh. Thêm vào đó, sau khi phóng điện, màng vẫn cân
bằng về mặt cơ học, và có thể lặp lại như quá trình đã diễn ra. Do đó, ta có
thể quan sát được hiện tượng electroporation khả nghịch (gọi tắt là REP)
trên màng phẳng trong thời gian đầu. Bốn loại biểu hiện có thể được phân
biệt trong màng cholesterol phẳng bị oxy hoá được chỉ ra trong bảng (2.1)
22
Trạng thái điện tích đặc trưng Cường độ xung
"Sự đánh thủng thuận nghịch"; Lớn nhất
màng phóng điện đến khi U=0
Sự đánh thủng không hoàn toàn Nhỏ hơn
màng phóng điện đến khi U=0
Sự thủng (về cơ học); Nhỏ hơn nữa
Sự phóng điện chậm theo hình xich-ma
Màng tích điện không có U Nhỏ nhất
Bảng 2.1: Bốn trạng thái khác nhau của hiện tượng electroporation trên màng kép phẳng
Hiện tượng electroporation khả nghịch tiếp đó được nghiên cứu dựa trên
dẫn tới sự tăng nhanh của dòng I(t). Đáng chú ý, hiện tượng
electroporation của tế bào cũng liên quan đến trạng thái khả nghịch giống
trạng thái khả nghịch của màng cholesterol bị oxy hoá.
2.3 Những ảnh hưởng của điện thế chuyển màng
Các lỗ thấm nước (sau đây sẽ gọi là lỗ) về mặt điện tích có thể được coi
như là có năng lượng tương ứng với sự thay đổi của điện dung riêng của
nó, C
LW
, như lipid được thay bằng nước [14]. Người ta thấy rằng, việc các
23
Copyright: Tài liệu đại học ©