Download Đề tài Ứng dụng chỉ thị sinh học phân tử trong nghiên cứu bệnh lý cây trồng miễn phí
2. Tổng quan lài liệu
2.1. Phương pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)
2.1.1 Nguyên lý
Về nguyên lý, kỹ thuật RFLP dựa trên thực tế của sự biến dị và tái tổ hợp tự nhiên trong bộ gen ADN là nguyên nhân vài vị trí enzyme cắt giới hạn bị mất, được tạo ra hay được sắp xếp lại(6). Điều này dẩn đến khi sợi ADN bị cắt thành nhiều đoạn nhỏ bởi các enzym hạn chế thì giữa các giống/loài sẽ có những phân đoạn khác nhau về kích thước hay chiều dài.
2.1.2 Phương pháp
RFLP của ADN nhân là trình tự ADN có vị trí giới hạn ở 2 đầu và một trình tự đích ở giữa và không thể nhận biết bằng mắt thường được (do kích thước ADN quá lớn). Người ta phải dùng mẩu dò có gắn phóng xạ hay huỳnh quang để nhận biết các phân đoạn cắt hạn chế. Khi mẩu dò liên kết với ADN đích theo nguyên tác bổ sung, người ta có thể xác định được những phân đoạn cắt hạn chế riêng biệt từ một hỗn hợp các phân đoạn của ADN nhân trong chế phẩm xử lý cắt hạn chế. RFLP sản xuất ra một loạt băng khi lai Southern được thực hiện với sự kết hợp đặc biệt của enzym hạn chế và trình tự mẩu dò. Để thực hiện tốt kỹ thuật này cần có một loạt các đoạn ADN mẫu dò. Tập hợp các mẫu dò đó được gọi là thư viện (7,8).
Kỹ thuật RFLP có thể được mô tả như sau: cắt ADN bằng một enzym giới hạn nào đó. Điện di sản phẩm cắt trên gel agarose để phân giải chúng theo trọng lượng phân tử. Sau đó tiến hành lai, để lai, các mảnh ADN trong bản gel phải được biến tính thành sợi đơn và được chuyển lên một loại màng đặc biệt gọi là màng lai (màng celuloze hay màng nilon) và ở đó chỉ có ADN được giữ lại. Bên cạnh đó việc đánh dấu mẫu dò cũng được tiến hành ngay sau đó nhằm phát hiện ADN trên màng lai và nó cũng được sử dụng để lai với ADN trên màng. Theo nguyên tắc bổ sung, đoạn mẫu dò đã được đánh dấu sẽ tìm gặp và lai với đoạn ADN tương đồng với nó, chúng liên kết với nhau theo bằng liên kết hydro. Từ đó, chúng ta có thể phát hiện được các đoạn RFLP.
2.1.3 Ứng dụng của RFLP
RFLPs có thể sử dụng theo nhiều mục đích khác nhau. RFLPs có thể sử dụng trong nghiên cứu quan hệ huyết thống, tội phạm bằng cách xác định nguồn ADN mẫu.RFLPs có thể sử dụng để xác định tình trạng bệnh trong một cá thể. RFLPs có thể sử dụng để đo tỷ lệ tái tổ hợp để lập bản đồ di truyền với khoảng cách giữa các vị trí RFLP đo bằng centiMorgans.
Gen đánh dấu thông qua RFLP là phương tiện giúp cho việc tuyển chọn các tính trạng sâu bệnh. Người ta xác định được kiểu đồng hợp tử hay dị hợp tử ở từng locut và kỹ thuật này có thể áp dụng trong trường hợp phân tích đa gen. Kỹ thuật RFLP đã ứng dụng ở lúa mì với các gen ARN ribosom để nghiên cứu bệnh đạo ôn trên lúa (Zhihong và cs, 1990). Kỹ thuật này còn áp dụng cho nhiều loại cây trồng như cà chua (bematzky và cs, 1986), rau diếp (lADNy và cs, 1987), khoai tây (Gebarat và cs, 1989) .v.v.
/tai-lieu/de-tai-ung-dung-tren-liketly-2005/
++ Ai muốn tải bản DOC Đầy Đủ thì Trả lời bài viết này, mình sẽ gửi Link download cho!Tóm tắt nội dung:
TIỂU LUẬN: ỨNG DỤNG CHỈ THỊ SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU BỆNH LÝ CÂY TRỒNG
Trần Văn Dương
1. Mở đầu
Sự phát hiện ra enzym giới hạn (Smith & Wilcox, 1970) và phương pháp PCR (Mullis & Faloona, 1987) là cơ sở cho các phương pháp chỉ thị phân tử như RFLP (Botstein et al. 1980 ), microsatellites (Weber & May và Litt & Luty, 1989), RAPD (Welsh & McClelADN, 1990), AFLPs (Vos et al. 1995), v.v. Các phương này cho phép xác định các chỉ thị phân tử, lập bản đồ liên kết gen, đánh giá tính đa hình ADN...(1,2). Tuỳ những nghiên cứu cụ thể mà chỉ thị nào sẽ được lựa chọn sử dụng. Tuy nhiên, về cơ bản ta có thể sử dụng bất cứ chỉ thị nào trong đánh giá tính đa hình và lập bản đồ gen.
Ở Việt Nam đã bước đầu ứng dụng thành công các chỉ thị này vào nghiên cứu gen, nghiên cứu tính đa hình trong sinh giới, tìm chỉ thị liên quan tới mội số tính trạng …(3,4)
Bệnh ở thực vật do nhiều nguyên nhân. Có thể do côn trùng (sâu xanh, bọ xít…), nấm (fuccinia arachidis gây bệnh gỉ sắt ở lạc, cà chua), vi khuẩn (Xanthomonas oryze gây bệnh bạc lá lúa) hay virut (bệnh xoan lùn ở bông)… Tuy nhiên, trong cùng một loài thường có những giống mang gen kháng các bệnh trên. Chúng chủ yếu là các giống hoang dại, hay một số giống địa phương. Đây thực sự là nguồn nguyên liệu quý để các nhà chọn giống dùng để lai tạo ra các giống mang gen kháng. Bằng phương pháp chỉ thị phân tử người ta xác định các chỉ thị ADN liên quan tới gen kháng các bệnh đó. Chỉ thị này có thể liên kết chặt với gen kháng hay có thể chính là gen đó (tuỳ theo từng phương pháp cụ thể). Nhờ có sự hỗ trợ của chỉ thị phân tử (MAS) giúp các nhà chọn giống tiết kiệm thời gian chi phí trong quá trình chọn tạo (5). Chính vì những hữu ích và tiện dụng của chỉ thị phân tử trên chúng tui quyết định thực hiện đề tài “Xác định chỉ thị phân tử liên quan đến bệnh rỉ sắt và héo xanh vi khuẩn ở cây lạc bằng một số kỹ thuật sinh học phân tử” mong muốn tìm hiểu các chỉ thị phân tử để chẩn đoán bệnh giúp đẩy nhanh quá trình chọn giống.
2. Tổng quan lài liệu
Phương pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)
Nguyên lý
Về nguyên lý, kỹ thuật RFLP dựa trên thực tế của sự biến dị và tái tổ hợp tự nhiên trong bộ gen ADN là nguyên nhân vài vị trí enzyme cắt giới hạn bị mất, được tạo ra hay được sắp xếp lại(6). Điều này dẩn đến khi sợi ADN bị cắt thành nhiều đoạn nhỏ bởi các enzym hạn chế thì giữa các giống/loài sẽ có những phân đoạn khác nhau về kích thước hay chiều dài.
Phương pháp
RFLP của ADN nhân là trình tự ADN có vị trí giới hạn ở 2 đầu và một trình tự đích ở giữa và không thể nhận biết bằng mắt thường được (do kích thước ADN quá lớn). Người ta phải dùng mẩu dò có gắn phóng xạ hay huỳnh quang để nhận biết các phân đoạn cắt hạn chế. Khi mẩu dò liên kết với ADN đích theo nguyên tác bổ sung, người ta có thể xác định được những phân đoạn cắt hạn chế riêng biệt từ một hỗn hợp các phân đoạn của ADN nhân trong chế phẩm xử lý cắt hạn chế. RFLP sản xuất ra một loạt băng khi lai Southern được thực hiện với sự kết hợp đặc biệt của enzym hạn chế và trình tự mẩu dò. Để thực hiện tốt kỹ thuật này cần có một loạt các đoạn ADN mẫu dò. Tập hợp các mẫu dò đó được gọi là thư viện (7,8).
Kỹ thuật RFLP có thể được mô tả như sau: cắt ADN bằng một enzym giới hạn nào đó. Điện di sản phẩm cắt trên gel agarose để phân giải chúng theo trọng lượng phân tử. Sau đó tiến hành lai, để lai, các mảnh ADN trong bản gel phải được biến tính thành sợi đơn và được chuyển lên một loại màng đặc biệt gọi là màng lai (màng celuloze hay màng nilon) và ở đó chỉ có ADN được giữ lại. Bên cạnh đó việc đánh dấu mẫu dò cũng được tiến hành ngay sau đó nhằm phát hiện ADN trên màng lai và nó cũng được sử dụng để lai với ADN trên màng. Theo nguyên tắc bổ sung, đoạn mẫu dò đã được đánh dấu sẽ tìm gặp và lai với đoạn ADN tương đồng với nó, chúng liên kết với nhau theo bằng liên kết hydro. Từ đó, chúng ta có thể phát hiện được các đoạn RFLP.
Ứng dụng của RFLP
RFLPs có thể sử dụng theo nhiều mục đích khác nhau. RFLPs có thể sử dụng trong nghiên cứu quan hệ huyết thống, tội phạm bằng cách xác định nguồn ADN mẫu.RFLPs có thể sử dụng để xác định tình trạng bệnh trong một cá thể. RFLPs có thể sử dụng để đo tỷ lệ tái tổ hợp để lập bản đồ di truyền với khoảng cách giữa các vị trí RFLP đo bằng centiMorgans.
Gen đánh dấu thông qua RFLP là phương tiện giúp cho việc tuyển chọn các tính trạng sâu bệnh. Người ta xác định được kiểu đồng hợp tử hay dị hợp tử ở từng locut và kỹ thuật này có thể áp dụng trong trường hợp phân tích đa gen. Kỹ thuật RFLP đã ứng dụng ở lúa mì với các gen ARN ribosom để nghiên cứu bệnh đạo ôn trên lúa (Zhihong và cs, 1990). Kỹ thuật này còn áp dụng cho nhiều loại cây trồng như cà chua (bematzky và cs, 1986), rau diếp (lADNy và cs, 1987), khoai tây (Gebarat và cs, 1989) .v.v.
Hiện nay, ở Việt Nam RFLP đã được ứng dụng trong nghiên cứu gen Kappa casein và õ-actoglobulin ở bò đực giống hướng sữa (10). Sử dụng RAPD và RFLP định vị gen kháng rầy nâu ở lúa Indica (11). Lập bản đồ xác định vị trí gen ảnh hưởng đến tính kháng mặn của lúa (Oryza sativa L)(12)…
Chỉ thị RFLP có vài trò trong nhiều khía cạnh của sinh học phân tử, đặc biệt trong lĩnh vực lập bản đồ phân tử. Tuy nhiên, việc thực hiện phương pháp này mất nhiều thời gian, công sức trong thiết kế mẩu dò. Chi phí đắt, cho nên những chỉ thị tiện ích hơn lần lượt ra đời.
Chỉ thị RAPD (Random Aplified Polymorphic ADN)
Nguyên lý
Kỹ thuật RAPD là loại chỉ thị dựa trên nguyên tắc PCR sử dụng các đoạn mồi ngẫu nhiên. Mồi thường gồm khoảng 10 nucleotide được sắp xếp theo một trình tự ngẫu nhiên nào đó, vì vậy xác suất bắt cặp một đoạn nucleotide trong genome có 10 gốc bổ trợ sẽ vào khoảng 1/410( 1/1010 = 1/1.000.000. Có nghĩa cứ khoảng 1 triệu gốc nucleotide sẽ có 1 vị trí gồm 10 gốc bổ trợ cho 10 gốc của mồi RAPD với trình tự xác định nào đó. Do kỹ thuật này chỉ sử dụng một loại mồi đồng nhất cho cả hai đầu của đoạn ADN cần nhân bản, ngoài ra 2 đoạn mồi này phải được kết cặp trên hai sợi đơn khác nhau của chuỗi ADN và phải đi theo chiều vào nhau, nên xác suất trên phải nhỏ đi nhiều. Trên thực tế xác bắt cặp của các mồi còn nhỏ hơn nhiều lần nữa, bởi trong điều kiện PCR thông thường chỉ tổng hợp được một đoạn ADN không dài quá năm nghìn nucleotide. Đối với ADN thực vật, các mồi RAPD thường cho sản phẩm PCR từ một vài băng đến vài chục băng có chiều dài từ 100-5000 nucleotide. Tuỳ vào các đối tượng thực vật khác nhau mà
Tính đa hình trong kỹ thuật RAPD là do sự thay đổi base tại vị trí bắt mồi hay do thay đổi nhiểm sắc thể trong vùng được nhân (xen đoạn, mất đoạn, hay đảo đoạn) đẩn đến thây đổi kích thước hay cản trở sự nhân bản của ADN đích. Tính đa hình thướng được chỉ ra bởi sự có mặt hay vắng mặt của sản phẩm được nhân bản từ một locut đơn (9)
Phương pháp
Phương pháp RAPD do dùng mồi ngẩu nhiên...
