Download miễn phí Luận văn Phát hiện một số gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân và thịt bò, heo bằng kỹ thuật multiplex - PCR



- Phân lập vi khuẩn E. colitrong phân và thịt bò, heo bằng phương pháp
định lượng. Từ đó đánh giá mức độ vệ sinh thực phẩm bằng cách so sánh với tiêu
chuẩn Việt Nam về số lượng E. colitrên thịt tươi (TCVN 7046 - 2002). Sử dụng
kỹ thuật multiplex - PCR để phát hiện các gen độc lực của vi khuẩn E. coliphân
lập được bằng qui trình định lượng.
- Phân lập định tính vi khuẩn E. colitrong phân bê tiêu chảy, phân heo
con tiêu chảy, thịt bò và thịt heo. Phát hiện các gen độc lực của E. coliđã phân
lập định tính bằng kỹ thuật multiplex - PCR.


http://s1.liketly.com/flash/edoc/jh2i1fkjb33wa7b577g9lou48iyvfkz6-swf-2013-12-10-luan_van_phat_hien_mot_so_gen_doc_luc_cua_e_coli.YA65zRFHv3.swf /tai-lieu/de-tai-ung-dung-tren-liketly-49235/
Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí

Tóm tắt nội dung tài liệu:

chế lại phản ứng.
+ Các bản sao vừa tổng hợp không kết hợp với mồi mà lại bắt cặp với
nhau.
Số chu kỳ của phản ứng tùy thuộc số lượng mẫu ban đầu. Số bản mẫu 105
thì cần khoảng 25 – 30 chu kỳ, số bản mẫu 102 – 103 thì số chu kỳ phải là 35 – 40.
2.2.3 Các thành phần của một phản ứng PCR
- DNA mẫu: là thành phần cần khuếch đại.
- Mồi (primer): Mồi là những đoạn oligonucleotide mạch đơn, có trình tự
bổ sung với trình tự base của hai đầu mạch khuôn để khởi đầu quá trình tổng hợp
DNA. Việc chọn mồi là giai đoạn quyết định của phản ứng PCR. Các mồi được
chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình
tự lặp lại trên gen, không có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi xuôi và mồi ngược và
cũng không có những cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp bổ sung trong cùng một mồi.
Chiều dài các mồi tối thiểu cho hầu hết các ứng dụng PCR là 18 nucleotide
(thường là 18 – 24 nucleotide). Trình tự nằm giữa hai mồi “xuôi” và “ngược”
không quá lớn, phản ứng PCR sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 1Kb.
- Taq polymerase: Taq polymerase là một DNA polymerase chịu nhiệt,
được chiết tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus ở suối nước nóng. Taq DNA
polymerase không bị phá hủy ở nhiệt độ cao và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến
Download» Agriviet.com
20
cuối quá trình phản ứng dưới sự hiện diện của Mg2+. Taq DNA polymerase tổng
hợp DNA theo hướng 5’ → 3’ và hoạt động tốt nhất ở 70 - 720 C.
- Các nucleotide (dNTP- deoxyribonucleotide triphosphate): Là hỗn hợp 4
loại: dATP, dTTP, dCTP, dGTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp DNA.
- Dung dịch đệm: Thành phần dung dịch đệm có thể thay đổi tuỳ loại
enzyme được sử dụng, quan trọng nhất là ion Mg2+. Nó hình thành một phứp hợp
hoà tan với dNTP, rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho emzyme
polymerase, làm tăng nhiệt độ nóng chảy (Tm) của DNA mạch đôi. Nồng độ
Mg2+ (thường được sử dụng ở dạng MgCl2) là một yếu tố ảnh hưởng mạnh đến
hiệu quả và tính đặc hiệu của phản ứng PCR. Ngoài ra nồng độ MgCl2 có thể ảnh
hưởng đến quá trình bắt cặp của mồi, nhiệt độ để biến tính DNA thành dây đơn,
hoạt động của enzyme và sự trung thực của kết quả. Nồng độ Mg2+ phải được xác
định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm. Nồng độ MgCl2 trong hổn hợp
phản ứng cuối cùng thường biến thiên từ 0,5 – 5mM (Hồ Huỳnh Thùy Dương,
1998).
Download» Agriviet.com
21
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
A
B
C
AND KHUÔN MẪU
Lặp lại
n vòng
Hình 2.1 Nguyên lý của phản ứng PCR
A : Biến tính – tách rời 2 mạch của phân tử DNA
B : Ủ bắt cặp – cặp mồi chuyên biệt bắt cặp với khuôn
C : Kéo dài – DNA polymerase tổng hợp mạch mới kể từ mồi đã bắt cặp
dưới sự hiện diện của 4 loại dNTP và chất đệm thích hợp
Thời gian
(phút)
Nhiệt độ (0C)
40
50
60
70
90
100
80
1 2 3 4 5 6
Lặp lại n lần 1 chu kỳ
A
B
C
94 – 95 0C
40 – 60 0C
72 0C
Hình 2.2 Chu kỳ nhiệt độ của phản ứng PCR
Download» Agriviet.com
22
2.2.4 Phân tích kết quả PCR
Sản phẩm của phản ứng PCR (đoạn DNA được khuếch đại) sẽ được phát
hiện bằng phương pháp điện di.
Nguyên tắc của phương pháp điện di là dựa vào đặc tính cấu trúc của các
DNA. DNA là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi
chịu tác động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện
trường. Sự di chuyển của phân tử trong bản gel dưới tác động của một điện
trường phụ thuộc vào khối lượng phân tử (tức là số nucleotide) và nồng độ các
chất cấu thành gel, điện thế.
Điện di được thực hiện theo phương nằm ngang hay đứng. Các DNA trong
gel agarose được hiện hình dưới tia tử ngoại (UV) nhờ ethidium bromide, chất
này có khả năng gắn xen giữa các base của acid nucleic và phát huỳnh quang
dưới tác dụng của tia UV (bước sóng λ = 300 nm) thành vạch màu đỏ da cam.
Để ước lượng kích thước DNA bằng gel agarose, người ta sử dụng một
“yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử” (molecular weight marker – MWM) là
một tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước đã biết (DNA ladder).
2.3 Multiplex – PCR
Multiplex - PCR là một cải tiến của kỹ thuật PCR mà trong đó có thể nhân
lên đồng thời nhiều đoạn DNA mong muốn bằng cách sử dùng đồng thời nhiều
cặp mồi trong một phản ứng. Multiplex - PCR đầu tiên được mô tả bởi
Chamberlain năm 1988 và kể từ đó multiplex - PCR được ứng dụng rất nhiều
trong các lĩnh vực kiểm tra DNA (Protocol online).
Download» Agriviet.com
23
Chương 3
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện
™ Thời gian
Đề tài được thực hiện từ ngày 01/03/2004 đến ngày 30/11/2004.
™ Địa điểm
- Mẫu khảo sát được lấy từ các chợ lẻ, lò mổ, hộ - trại chăn nuôi ở TP. Hồ
Chí Minh và Long An.
- Việc nuôi cấy, phân lập vi khuẩn được thực hiện tại Phòng thực hành
Kiểm nghiệm thú sản và môi trường, Khoa Chăn nuôi - Thú y, Trường Đại học
Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
- Việc xác định các gen độc lực của E. coli được thực hiện tại Trung tâm
Phân tích thí nghiệm Hóa sinh, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí
Minh.
3.2 Nội dung
- Phân lập vi khuẩn E. coli trong phân và thịt bò, heo bằng phương pháp
định lượng. Từ đó đánh giá mức độ vệ sinh thực phẩm bằng cách so sánh với tiêu
chuẩn Việt Nam về số lượng E. coli trên thịt tươi (TCVN 7046 - 2002). Sử dụng
kỹ thuật multiplex - PCR để phát hiện các gen độc lực của vi khuẩn E. coli phân
lập được bằng qui trình định lượng.
- Phân lập định tính vi khuẩn E. coli trong phân bê tiêu chảy, phân heo
con tiêu chảy, thịt bò và thịt heo. Phát hiện các gen độc lực của E. coli đã phân
lập định tính bằng kỹ thuật multiplex - PCR.
Download» Agriviet.com
24
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phân lập vi khuẩn E. coli
™ Đối tượng lấy mẫu
- Thịt bò, heo được lấy từ các chợ lẻ (dùng cho qui trình định lượng).
- Bề mặt quày thịt bò, thịt heo được lấy trong lò mổ (dùng cho qui trình
phân lập định tính).
- Phân bê và phân heo con tiêu chảy được lấy từ một số trại và hộ chăn
nuôi.
- Phân bò và phân heo bình thường được lấy từ một số trại và hộ chăn
nuôi.
™ Cách lấy và bảo quản mẫu
- Mẫu thịt: Chọn ngẫu nhiên miếng thịt để lấy mẫu. Khối lượng mẫu là 50
g thịt.
- Mẫu bề mặt quày thịt: Chọn ngẫu nhiên quày thịt ở giữa ca giết mổ.
Dùng gạc vô trùng lau bề mặt quày thịt với tổng diện tích khoảng 200 cm2.
- Mẫu phân bình thường: Dùng muỗng múc khoảng 25 g ở phần giữa cục
phân gia súc mới thải.
- Mẫu phân tiêu chảy: Phân được lấy từ trực tràng bằng tăm bông (± 0,1 g)
rồi cho vào môi trường vận chuyển Carry Blair.
Tất cả các loại mẫu sau khi lấy đều được đựng trong công cụ vô trùng và
giữ lạnh ở 4 – 80C cho đến khi tiến hành xét nghiệm (mẫu được giữ tối đa 24 giờ).
™ Số lượng mẫu
Số lượng mẫu khảo sát được tính là số mẫu đã phân lập được vi khuẩn E.
coli từ các mẫu đã lấy.
Download» Agriviet....

---