Download miễn phí Đề tài Công nghệ gen trong sản xuất thuốc trừ sâu
Đối với côn trùng thuộc coleoptera như mọt gạo và bọ xít đã được xem như đối tượng quan trọng trong chiến lược sử dụng gen CryIIIA để phòng trị. Endotoxin CryIIA của Bt. Vartenebrionis là một phân tử protein 65 kDa. Gen CryIIIA được phân lập, đầu N được xác định bằng cách sử dụng một codon tổng hợp của threonine và proline. Công thức gen cải tiến của CryIIIA bao gồm promoter CaMV35S, teminator phục vụ sự thể hiện gen. Sự thể hiện gen CryIIIA trong giống lúa indica được chứng minh thông qua xét nghiệm sự thể hiện “transient” trong tế bào trần.
http://s1.liketly.com/flash/edoc/jh2i1fkjb33wa7b577g9lou48iyvfkz6-swf-2014-03-23-de_tai_cong_nghe_gen_trong_san_xuat_thuoc_tru_sau.8FtvXAa0g8.swf /tai-lieu/de-tai-ung-dung-tren-liketly-64367/Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
tử khoảng 130 kDa hay 70 kDa thành d - endotoxin, độc tố này bám dính lên tế bào thượng bì của ruột tạo nên các lỗ rò để cho ion nước chảy vào làm tế bào bị căng ra và phân huỷ.
Tuỳ theo côn trùng mà có ít nhất 3 cơ chế tác động gây chết của tinh thể độc.
1 : Sau khi ăn phải tinh thể một thời gian khoảng từ 5 á 20 phút, ruột giữa bị tê liệt, pH trong máu và bạch huyết tăng lên từ 1 á 1,5 đơn vị, còn pH ruột giữa hạ xuống do chất kiềm của ruột thấm vào máu. Tế bào biểu mô ruột bị phá huỷ, sau 1 giờ toàn bộ cơ thể bị tê liệt.
2 : Sau khi ăn phải tinh thể thì côn trùng ngừng ăn, ruột bị tê liệt nhưng pH của máu và bạch huyết không tăng. Sau 24 ngày côn trùng chết mặc dù không bị tê liệt toàn thân.
3 : Đặc biệt là tinh thể nhất thiết phải kèm theo bào tử mới gây chết. Côn trùng chết sau 2 á 4 ngày không có hiện tượng liệt.
3.2.2. Yếu tố ảnh hưởng
Tất cả các yếu tố ảnh hưởng của đến quá trình sinh trưởng và phát triển của Bt đều ảnh hưởng đến quá trình hình thành tinh thể độc tố.
Vi khuẩn Bt thường sinh trưởng ở khoảng nhiệt độ 27 á 300C, topt là 300C. Nếu nuôi cấy ở 150C trở xuống thì bào tử không hhình thành và pHopt cho sinh trưởng là 7, pH quá cao (pH = 12) hay quá thấp (pH = 3,3) đều làm biến tính tinh thể. Một số chất dinh dưỡng có hiệu quả rõ rệt khi cho vào môi trường nồng độ 0,3 á 0,5. Nồng độ O2 ảnh hưởng quan trọng đến sự hình thành bào tử và tinh thể độc vi khuẩn.
Quá trình hình thành bào tử đòi hỏi sự tổng hợp của một loại proteaza ngoại bào, ở những chủng đột biến do không có khẩ năng tổng hợp enzim này nên cũng sẽ không sinh ra được bào tử tinh thể. Như vây, sự tạo thành bào tử và tinh thể có liên quan đến sự chuyển hoá phần protein của tế bào sinh dưỡng.
Một số axit amin có tác dụng ức chế sinh trưởng của vi khuẩn cũng như hình thành tinh thể như loxin, izoloxin. Tuy nhiên khi có va lin trong môi trường thì tác dụng này cũng mất đi. Nếu bổ xung thêm treonin hay serin vào môi trường thì gây ức chế, nhưng nếu đưa cả hai vào môi trường thì không có hiện tượng này. Tác dụng ức chế của serin cũng mất đi nếu có mặt của methionin.
Những nhân tố ảnh hưởng đến sự trao đổi chất axit axetic cũng làm ức chế sự tạo thành bào tử và tinh thể độc .
Chất kháng sinh erytromcyin ở nồng độ thấp chưa đủ ức chế Bt sinh trưởng nhưng nó lại cản trở sự hình thành bào tử. Sự có mặt của chất kháng sinh này làm thể mang bào tử không bị phân giải và tinh thể còn lại sẽ bị giữ lại trong phần còn lại của thành tế bào.
3.3. Các gen mã hoá độc tố
Hàng loạt chúng Bt có khả năng sản sinh tinh thể độc tố diệt ấu trùng của một số loài côn trùng cánh vẩy, cánh cứng, hai cánh đã được nghiên cứu ở mức độ phân tử.
Người ta đã nghiên cứu trình tự 50 gen độc tố. Một số giống nhau hoàn toàn, một số khác gần giống nhau thay mặt cho cùng một gen hay biến dạng từ một gen. Có 14 gen riêng biệt trong đó 13 gen được gọi là gen độc tố (gen Cry) mã hoá tổng hợp protein gây độc với côn trùng và một gen tổng hợp protein gây độc với tế bào động vật có xương sống gọi là gen CytA . Hiện nay gen Cry được chia thành 6 lớp chính có ký hiệu : CryI, CryII, CryIII, CryIV, CryV , CryVI trên cơ sở cấu tạo giống nhau và phổ tác dụng với côn trùng thì :
Nhóm gen Cry
Kích thước
Hình dạng
Phổ tác dụng
CryI(A,B,C,D,E,F)
130 –138 kDa
Tinh thể hình tháp.
Côn trùng cánh cứng, vảy
CryII(A,B,C)
70 –71 kDa
Tinh thể hình lập phương .
Côn trùng cánh cứng, vảy
CryIII(A,B,C,D)
66 – 73 kDa
Tinh thể hình thoi dẹt .
Côn trùng cánh cứng
CryIV(A,B,C)
135 – 145 kDa
Tinh thể hình cầu, chữ nhật.
Côn trùng hai cánh
CryV(A,C)
81 kDa
Tinh thể hình tháp .
Côn trùng cánh cứng,vảy
CryVI
44 – 45 kDa
Tinh thể hình tháp.
Giun tròn
Bảng tra nhóm gen Cry
Trong tất cả các gen Cry thì gen CryI được nghiên cứu kỹ nhất. Vì gen CryI có trọng lượng phân tử 130 á 138 kDa. Mã hoá cho các protein độc tố, có cấu trúc tương đồng và kháng ấu trùng cánh vẩy. Gen CryI bao gồm 6 nhóm phụ ký hiệu từ CryIA đ CryIF. Trong đó CryIA được phân thành 3 nhóm nhỏ hơn là CryIA(a), CryIA(b), CryIA(c). Với lí do là gen CryI có tỷ lệ aa đồng nhất cao (vì có hơn 80% aa đồng nhất). Nhóm gen Cry được nghiên cứu nhiều và nó có 20 gen khác nhau ddã đươc giải trình tự và từ năm 1980 người ta thành công lần đầu tiên là tạo được thuốc trừ sâu baừng kỹ thuật gen . Những nghiên cứu ban đầu cho thấy quá trinh hình thành tinh thể độc tố liên quan mật thiết đến sự có mặt của plasmid. Gen mã hoá độc tố tự nhiên thường nằm trên plasmit cỡ lớn và dài tới 3 kb. Nhưng chỉ có đoan 2 kb tính từ đầu 5’ mã hoá đoạn protein có tính độc, phần còn lại mã hoá đoạn protein có liên quan tới tính gắn.
Bảng tra kí hiệu protein độc tố
(Các serotype Bt nguồn gốc Crickmore 1996)
Kí hiệu
Chủng Bt
Diệt sâu hại
Bộ
CryI (a,c)
Kusstaki
Sâu xanh đục thân
Lepidoptera
Alesti
Sâu đo, sâu xám, mối
Lep. Diptera
CryI (b)
Berlinet
Sâu keo, mối, sâu hại kho
Lep. Coleoptera
CryI (b,c)
Thurigens
Sâu tơ, sâu xanh hạt cải
Lep
CryI (d,l,f)
Aizawai
Sâu bộ cánh vẩy
Lep
CryIII (a,b,c)
Ruristaki
Sâu bộ cánh vẩy
Lep
CryIII a
Shangai
Bọ khoai tây
Coleoptera
CryIII a
Tenebrionis
Bọ cánh cứng
Coleoptera
CryIV a
Israelausis
Muỗi Culex và Aedes
Diptera
Mỗi chủng Bt có ký hiệu protein độc tố riêng, căn cứ vào các protein độc tố này mà người ta đã nhận biết được chủng Bt có khả năng diệt sâu hại ở bộ nào mà định hướng cho việc sản xuất ra chế phẩm Bt.
IV. Công nghệ sản xuất Bt
4.1. Sản xuất chế phẩm Bt (theo phương pháp cổ truyền )
Sản xuất Bt được thựchiện bằng cả hai phương pháp lên men chìm và lên men xốp.
Trong công nghệ lên men xốp thường dùng những hạt cơ chất rắn, những hạt này có thể hay không có khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng trên bề mặt. Các hạt cơ chất rắn này đóng vai trò là nguồn dinh dưỡng hay chất mang vô cơ.
Bên cạnh đó công nghệ sản xuất Bt qui mô lớn gặp nhiều khó khăn. Đó là việc cung cấp khí cho môi trường, ngăn chặn sự nhiễm. Điều chỉnh sự lên men thu hoạch. Phương pháp lên men xốp có sản lượng thấp so với lên men chìm và nó không phải là phương pháp thực tế để sản xuất chế phẩm thương mại.
Đối với phương pháp lên men chìm, việc nghiên cứu tìm ra môi trường dinh dưỡng tối ưu là rất càn thiết. Ngoài ra phải quan tâm tới các thông số trong quá trình lên men như : nhiệt độ, độ pH, độ O2 hoà tan, tốc độ không khí, để xác định thời gian thu hoạch tối ưu.
Quá trình sản xuất lên men Bt :
Chủng BT (trong ống thạch)
Nhân giống cấp I (trên máy lắc)
Nhân giống cấp II
Kích thích lên men (nhiệt độ, thông gió, pH)
Lọc Ly tâm + chất phụ gia(trộn) Sấy chế phẩm thô
đóng gói sản phẩm
Chất bảo quản + chất phụ gia
Dung dịch đóng chai bảo quản
4.2. Sự chuyển gen Bt vào thực vật
4.2.1. Chuyển nạp gen Cry IA(b) vào cây lúa
Gen CryIA(b) dạng khảm tinh thể cụt với 2 promoter có tính chất cấu trúc là 355 CaMV và Actin – 1, hai promoter chuyển tính trên mô chúng được chuyển nạp vào cây lúa với hai dạng hình khác nhau và bằng phương pháp bắn gen trên tế bào trần (Datta và công sự năm 1998) đã sử dụng 1800 cây lúa đ...
