Download miễn phí Luận văn Bước đầu nghiên cứu enzyme xylanolytic và cellulolytic từ một chủng vi khuẩn ưa nhiệt
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 4
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6
1.1. Cấu trúc của lignocellulose 6
1.1.1. Cấu trúc thành tế bào thực vật 6
1.1.2. Cellulose 9
1.1.3. Lignin 11
1.1.4. Hemicellulose 15
1.2. Enzyme thủy phân lignocellulose 17
1.2.1. Enzyme cellulolytic 18
1.2.2. Enzyme xylanolytic 20
1.3. Ứng dụng của enzyme lignocellulolytic 22
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23
2.1. Nguyên liệu 23
2.1.1. Mẫu đất 23
2.1.2. Hóa chất 23
2.1.3. Thiết bị 23
2.2. Phương pháp nghiên cứu 23
2.2.1. Sàng lọc và phân lập vi khuẩn kị khí xylanolytic-cellulolytic ưa nhiệt 23
2.2.2. Nhận dạng chủng vi khuẩn kị khí xylanolytic-cellulolytic ưa nhiệt. 24
2.2.2.1. Kiểm tra hình thái tế bào vi khuẩn 24
2.2.2.2. Tách chiết ADN tổng số 24
2.2.2.3. Định lượng ADN bằng cách đo độ hấp thụ tử ngoại ở bước sóng 260 nm và 280 nm. 25
2.2.2.4. PCR nhân bản đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S 26
2.2.2.5. Gắn sản phẩm PCR vào vector p-GEM T 26
2.2.2.6. Tách ADN plasmid từ vi khuẩn E.coli DH5α 27
2.2.2.7. Đọc trình tự đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S 28
2.2.3. Thu nhận chế phẩm enzyme 29
2.2.4. Xác định hoạt độ enzyme 30
2.2.4.1. Xác định hoạt độ enzyme 30
2.2.4.2. Ảnh hưởng của pH đối với hoạt độ và độ bền của enzyme 32
2.2.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hoạt độ và độ bền của enzyme 32
2.2.5. Xác định protein 32
2.2.6. Thủy phân các chất lignocellulose 32
2.2.7. Tách phức hệ multienzyme từ dịch lỏng của môi trường nuôi cấy 32
2.2.8. Điện di gel và kỹ thuật zymogram 33
2.2.9. Sắc ký bản mỏng (TLC) 33
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34
3.1. Sàng lọc và phân lập vi khuẩn kị khí xylanolytic-cellulolytic ưa nhiệt 34
3.1.1. Sàng lọc các vi khuẩn ưa nhiệt kỵ khí bằng môi trường làm giàu và nuôi cấy ở nhiệt độ cao 34
3.1.2. Sàng lọc các chủng vi khuẩn có hoạt tính xylanolytic-cellulolytic 38
3.2. Kết quả nhận dạng vi khuẩn kị khí xylanolytic-cellulolytic ưa nhiệt 39
3.2.1. Xác định hình thái tế bào vi khuẩn 39
3.2.2. Nhận dạng vi khuẩn bằng đọc trình tự đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S 40
3.2.2.1. Tách chiết ADN hệ gen của chủng vi khuẩn NKP13 40
3.2.2.2. Nhân bản đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S của chủng vi khuẩn NKP13 bằng PCR 41
3.2.2.3. Nhân dòng gen mã hóa cho ARN ribosome 16S của chủng vi khuẩn NKP13 vào vector pGEM T 42
3.2.2.4. Giải trình tự gen mã hóa cho ARN ribosome 16S của chủng vi khuẩn NKP13 46
3.3. Nghiên cứu phức hệ enzyme xylanolytic-cellulolytic của chủng NKP13. 48
3.3.1. Khả năng sinh tổng hợp xylase và CMCase 48
3.3.2. Ảnh hưởng của pH lên hoạt độ xylanase và CMCase 50
3.3.2.1. pH phản ứng tối ưu 50
3.3.2.2. Độ bền pH 51
3.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ enzyme xylanase và CMCase và độ bền nhiệt của enzyme 52
3.3.3.1. Nhiệt độ phản ứng tối ưu 52
3.3.3.2. Độ bền nhiệt 52
3.3.4. Khả năng thủy phân nguyên liệu lignocellulose của enzyme 53
3.3.5. Điện di chế phẩm enzyme trên gel polyacrylamide có SDS 55
KẾT LUẬN 57
KIẾN NGHỊ 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO 58
http://s1.liketly.com/flash/edoc/jh2i1fkjb33wa7b577g9lou48iyvfkz6-swf-2013-12-27-luan_van_buoc_dau_nghien_cuu_enzyme_xylanolytic_va.LYP7KJ9Kdc.swf /tai-lieu/de-tai-ung-dung-tren-liketly-51683/Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Cấu trúc của lignocellulose
Cấu trúc thành tế bào thực vật
Trong tự nhiên, các lớp của thành tế bào thực vật được minh họa bằng mô hình của gỗ (Hình 1.1). Ở giữa các tế bào, có một hợp chất đóng vai trò như keo dán gắn kết các tế bào lại với nhau, đó là lớp gian bào (middle lamella). Lớp này cấu tạo từ các chất keo, có bản chất pectin và không có tác động về quang học. Bên trong là thành tế bào sơ cấp (primary wall).
Hình 1.1: Cấu trúc thành tế bào thực vật [37]
Thành tế bào sơ cấp có thể được chia thành mặt bên trong và mặt bên ngoài. Sự sắp xếp của các vi sợi trong thành tế bào sơ cấp phân tán tăng dần từ mặt trong ra mặt ngoài. Tiếp đến là thành tế bào thứ cấp gồm 3 lớp: lớp ngoài (S1), lớp giữa (S2) và lớp trong (S3). Sự phân chia thành tế bào thứ cấp thành ba lớp S chủ yếu là do sự định hướng khác nhau của các vi sợi trong ba lớp đó. Điển hình các vi sợi định hướng xoắn trong vách tế bào. Lớp ngoài của thành tế bào thứ cấp, các vi sợi được định hướng trong cấu trúc xoắn chéo có độ nghiêng tạo thành một góc lớn với trục dọc của tế bào. Lớp giữa là lớp dày nhất và ở lớp giữa có góc nhỏ và độ nghiêng của sợi xoắn ốc trong khi vi sợi trong lớp 3 được sắp xếp như ở lớp ngoài, với một góc rộng với trục dọc của tế bào. Ngoài ra trong một số trường hợp, trên mặt trong của thành tế bào có lớp sần sùi (W). Chức năng của thành tế bào là chống đỡ cho các cơ quan của cây đặc biệt là các vách dày và cứng. Thành tế bào còn giữ các chức năng quan trọng chính như hấp thụ, thoát hơi nước hay vận chuyển và bài tiết.
Lignocellulose là thành phần cấu trúc chính của thực vật thân gỗ và các thực vật khác như cỏ, lúa, ngô…Trong tự nhiên, chúng ta có thể tìm thấy lignocellulose ở thực vật hay các chất thải nông nghiệp, lâm nghiệp và các chất thải rắn trong thành phố. Thành phần chủ yếu của lignocellulose là cellulose, hemicellulose và lignin (Hình 1.2). Cellulose và hemicellulose là các đại phân tử cấu tạo từ các gốc đường khác nhau, trong khi lignin là một polymer dạng vòng được tổng hợp từ tiền phenylpropanoid. Thành phần cấu tạo và phần trăm của các polymer này là khác nhau giữa các loài. Hơn nữa, thành phần cấu tạo trong cùng một cây hay các cây khác nhau là khác nhau dựa vào độ tuổi, giai đoạn sinh trưởng, phát triển của cây và các điều kiện khác. Thành phần của lignocellulose được trình bày ở bảng 1.1 [9].
Hình 1.2: Thành phần chủ yếu của lignocellulose
Bảng 1.1: Thành phần lignocellulose trong rác thải và phế phụ liệu nông nghiệp phổ biến [9]
Nguồn lignocellulose
Cellulose (%)
Hemicellulose (%)
Lignin (%)
Thân gỗ cứng
40-55
24-40
18-25
Thân gỗ mềm
45-50
25-35
25-35
Vỏ lạc
25-30
25-30
30-40
Lõi ngô
45
35
15
Giấy
85-99
0
0-15
Vỏ trấu
32.1
24
18
Vỏ trấu của lúa mì
30
50
15
Rác đã phân loại
60
20
20
Lá cây
15-20
80-85
0
Hạt bông
80-95
5-20
0
Giấy báo
40-55
25-40
18-30
Giấy thải từ bột giấy hóa học
60-70
10-20
5-10
Chất rắn nước thải ban đầu
8-15
-
24-29
Chất thải của lợn
6
28
-
Phân bón gia súc
1.6-4.7
1.4-3.3
2.7-5.7
Cỏ ở bờ biển Bermuda
25
35.7
6.4
Cỏ mềm
45
31.4
12.0
Các loại cỏ (trị số trung bình cho các loại)
25-40
25-50
10-30
Bã thô
33.4
30
18.9
Lượng lớn lignocellulose được thải ra từ các ngành lâm nghiệp, nông nghiệp, công nghiệp giấy và gây ra ô nhiễm môi trường. Tuy nhiên, lượng lớn các sinh khối thực vật dư thừa được coi là rác thải có thể được biến đổi thành nhiều sản phẩm có giá trị khác nhau như nhiên liệu sinh học, hóa chất, các nguồn năng lượng rẻ cho quá trình lên men, bổ sung chất dinh dưỡng cho con người và thức ăn cho động vật [15].
Cellulose
Cellulose là hợp chất hữu cơ có công thức cấu tạo (C6H10O5)n, và là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật, gồm nhiều cellobiose liên kết với nhau, 4-O- (β-D-Glucopyranosyl)-D-glucopyranose (Hình 1.3). Cellulose cũng là hợp chất hữu cơ nhiều nhất trong sinh quyển, hàng năm thực vật tổng hợp được khoảng 1011 tấn cellulose (trong gỗ, cellulose chiếm khoảng 50% và trong bông chiếm khoảng 90%).
Hình 1.3: Công thức hóa học của cellulose
Các mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và liên kết van Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là tinh thể và vô định hình. Trong vùng tinh thể, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, vùng này khó bị tấn công bởi enzyme cũng như hóa chất. Ngược lại, trong vùng vô định hình, cellulose liên kết không chặt với nhau nên dễ bị tấn công [40]. Có hai mô hình cấu trúc của cellulose đã được đưa ra nhằm mô tả vùng tinh thể và vô định hình như hình 1.4 [29].
Hình 1.4: Mô hình Fringed fibrillar và mô hình chuỗi gập
Trong mô hình Fringed Fibrillar: phân tử cellulose được kéo thẳng và định hướng theo chiều sợi. Vùng tinh thể có chiều dài 500 Å và xếp xen kẽ với vùng vô định hình.
Trong mô hình chuỗi gập: phân tử cellulose gấp khúc theo chiều sợi. Mỗi đơn vị lặp lại có độ trùng hợp khoảng 1000, giới hạn bởi hai điểm a và b như trên hình vẽ. Các đơn vị đó được sắp xếp thành chuỗi nhờ vào các mạch glucose nhỏ, các vị trí này rất dễ bị thủy phân. Đối với các đơn vị lặp lại, hai đầu là vùng vô định hình, càng vào giữa, tính chất kết tinh càng cao. Trong vùng vô định hình, các liên kết β - glycoside giữa các monomer bị thay đổi góc liên kết, ngay tại cuối các đoạn gấp, 3 phân tử monomer sắp xếp tạo sự thay đổi 180o cho toàn mạch. Vùng vô định hình dễ bị tấn công bởi các tác nhân thủy phân hơn vùng tinh thể vì sự thay đổi góc liên kết của các liên kết cộng hóa trị (β - glycoside) sẽ làm giảm độ bền của liên kết, đồng thời vị trí này không tạo được liên kết hydro [2].
Cellulose có cấu tạo tương tự carbohydrate phức tạp như tinh bột và glycogen. Các polysaccharide này đều được cấu tạo từ các đơn phân là glucose. Cellulose là glucan không phân nhánh, trong đó các gốc glucose kết hợp với nhau qua liên kết β-1à 4- glycoside, đó chính là sự khác biệt giữa cellulose và các phân tử carbohydrate phức tạp khác. Giống như tinh bột, cellulose được cấu tạo thành chuỗi dài gồm ít nhất 500 phân tử glucose. Các chuỗi cellulose này xếp đối song song tạo thành các vi sợi cellulose có đường kính khoảng 3,5 nm. Mỗi chuỗi có nhiều nhóm OH tự do, vì vậy giữa các sợi ở cạnh nhau kết hợp với nhau nhờ các liên kết hidro được tạo thành giữa các nhóm OH của chúng. Các vi sợi lại liên kết với nhau tạo thành vi sợi lớn hay còn gọi là bó mixen có đường kính 20 nm, giữa các sợi trong mixen có những khoảng trống lớn. Khi tế bào còn non, những khoảng này chứa đầy nước, ở tế bào già thì chứa đầy lignin và hemicellulose.
Cellulose có cấu trúc rất bền và khó bị thủy phân. Người và động vật không có enzyme phân giải cellulose (cellulase) nên không tiêu hóa được cellulose, vì vậy cellulose không có giá trị dinh dưỡng. Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy cellulose có thể có vai trò điều hòa hoạt động của hệ thống tiêu hóa. Vi khuẩn trong dạ cỏ của gia súc, các động vật nhai lại và động vật nguyên sinh trong ruột của mối sản xuất enzyme phân giải cellulose. Nấm đất cũng có thể phân hủy cellulose. Vì vậy chún...
