Download miễn phí Khóa luận Nghiên cứu nhân nhanh giống địa lan Hồng hoàng Sapa (cymbidium iridioides) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào



MỤC LỤC
 
1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích yêu cầu đề tài 2
1.2.1. Mục đích 2
1.2.2. Yêu cầu của đề tài 2
2. PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Sơ lược về cây hoa lan 3
2.1.1. Nguồn gốc, vị trí trong hệ thống phân loại thực vật 3
2.1.2. Đặc tính thực vật học của địa lan 4
2.1.3. Đặc điểm thực vật của địa lan Hồng hoàng Sapa 7
2.1.4. Yêu cầu về ngoại cảnh của cây lan 7
2.2. Tình hình sản xuất hoa lan trong và ngoài nước 11
2.2.1. Tình hình sản xuất hoa trên thế giới 11
2.2.2 Tình hình sản xuất hoa lan ở Việt Nam 12
2.3. Các nghiên cứu về nhân giống địa lan bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào 13
2.3.1. Cơ sở khoa học của biện pháp nhân giống vô tính bằng nuôi cấy mô tế bào 13
2.3.2. Một số nghiên cứu tiêu biểu 14
2.4. Phương pháp cắt lớp mỏng tế bào (Thin cell layers - TCL) 15
2.4.1. Khái niệm: 15
2.4.2. Một số nghiên cứu về phương pháp cắt lớp mỏng tế bào 15
2.5. Kĩ thuật cắt lớp mỏng tế bào (TCL) 16
2.5.1. Phương pháp TCL kinh điển 16
2.5.2. Phương pháp TCL cải tiến 16
2.6. Quy trình kỹ thuật về nuôi cấy mô tế bào 17
2.7. Các vấn đề cần quan tâm trong nhân giống in - vitro 18
2.7.1. Tính bất định về mặt di truyền (genetic in stability) 18
2.7.2. Sự nhiễm mẫu (explantcontamination) 19
2.7.3. Sự tiết độc tố từ mẫu cấy (Toxic compounds) 19
2.7.4. Hiện tượng thuỷ tinh hoá (vitri fication, hyperhy dricity) 20
2.8. Quy trình trồng và chăm sóc cây Địa lan nhân bằng nuôi cấy mô 20
2.8.1. Giai đoạn lấy từ trong ống nghiệm ra 21
2.8.2. Giai đoạn ở trong chậu chung 21
2.8.3. Giai đoạn trồng vào chậu nhỏ 22
2.8.4. Giai đoạn thay chậu nhỏ và trồng vào chậu lớn 23
2.9. Một số kỹ thuật trồng Địa lan cơ bản 23
2.9.1. Kĩ thuật trồng cây con vào chậu 23
2.9.2. Kỹ thuật chuyển chậu 24
2.9.3. Nước tưới cho lan 25
2.9.4. Kỹ thuật thúc mầm cây 25
2.9.5. Phòng trừ bệnh cho cây 26
3. PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27
3.1. Vật liệu 27
3.2. Nội dung nghiên cứu 27
3.2.1. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ sung khoai tây vào môi trường đến sự nảy mầm của hạt: 27
3.2.2. Thí nghiệm 2: Xác định môi trường khởi động thích hợp cho sự phát sinh hình thái của lát cắt 27
3.2.3. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin và BA tới quá trình nhân nhanh thể protocorm. 28
3.2.4. Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa( ND) đến hệ số nhân, chất lượng của chồi: 29
3.2.5. Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của than hoạt tính và -NAA đối với sự ra rễ của cây. 29
3.2.6. Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng việc xử lý giá thể đối với cây ra vườn ươm 30
3.2.7. Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng chế độ che đối với cây ra vườn ươm. 30
3.2.8. Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của dinh dưỡng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây 30
3.3. Phương pháp nghiên cứu 30
3.3.1. Cách bố trí thí nghiệm 30
3.3.2. Phương pháp tiến hành 31
4. PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33
4.1. Tạo nguồn vật liệu vô trùng 34
4.2. Nghiên cứu nhân nhanh bằng phương pháp cát lát mỏng 35
4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng nhóm Cytokinin đến quả trình nhân nhanh thể protocorm 39
4.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa lên hệ số nhân và chất lượng của chồi 43
4.5. Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh 43
4.6. Các nghiên cứu ở giai đoạn sau nuôi cấy mô 43
4.6.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của biện pháp xử lý giá thể đến sự sinh trưởng phát triển của cây địa lan Hồng hoàng giai đoạn bồn mạ. 43
4.6.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của biện pháp che tối khi cây địa lan đưa ra vườn ươm 43
4.6.3. Ảnh hưởng của dinh dưỡng khác nhau đến sự sinh trưởng 43
5. PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43
5.1. Kết luận 43
5.2. Đề nghị 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO 43
 


http://s1.liketly.com/flash/edoc/jh2i1fkjb33wa7b577g9lou48iyvfkz6-swf-2014-09-14-khoa_luan_nghien_cuu_nhan_nhanh_giong_dia_lan_hong.rPrXr6vWCt.swf /tai-lieu/khoa-luan-nghien-cuu-nhan-nhanh-giong-dia-lan-hong-hoang-sapa-cymbidium-iridioides-bang-phuong-phap-nuoi-cay-mo-te-bao-76734/


Để tải tài liệu này, vui lòng Trả lời bài viết, Mods sẽ gửi Link download cho bạn ngay qua hòm tin nhắn.

Ket-noi - Kho tài liệu miễn phí lớn nhất của bạn


Ai cần tài liệu gì mà không tìm thấy ở Ket-noi, đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí

Tóm tắt nội dung tài liệu:

g lá đều có khả năng hình thành chồi. ở Việt Nam, những nghiên cứu về nuôi cấy lát mỏng tế bào hiện còn là vấn đề khá mới. Tới nay chỉ có một số kết quả nghiên cứu của một số tác giả như: Trần Thanh Vân, Bùi Thị ánh Tuyết, Trần Duy Quý, Lê Thị ánh Hồng đã sử dụng lớp mỏng ngang của cuống lá và cụm hoa của cây Saivitpaulia Vononvhawindhl. ở viện Sinh học Nông nghiệp 1 Hà Nội cũng có một số nghiên cứu lát mỏng tế bào trên cây phong lan, trên cây dứa
Kĩ thuật cắt lớp mỏng tế bào (tcl)
Phương pháp TCL kinh điển
Theo Trần Thanh Vân (1973, 1974, 1983, 1986) thì lớp mỏng tế bào được cắt theo chiều dọc hay chiều ngang từ những cơ quan khác nhau với kích cỡ rất nhỏ (từ vài micro đến 1 mm x 5mm) và số tế bào giảm đi cho phép TCL bộc lộ tính đồng nhất với các phân tử DNA ngoại lai từ quá trình cài lồng gen. Cắt lớp mỏng tế bào theo chiều dọc (itcl được sử dụng khi phân loại tế bào ( tế bào mô rộng, biểu bì, tế bào tượng tầng, tế bào nhu mô) ITCL có thể cắt từ thân, gân lá, cuống lá, lá mầm cắt lớp mỏng tế bào theo chiều ngang (tTCL) cũng có thể sử dụng cơ quan khác như phiến lá, rễ, cơ quan của hoa thân, mô sinh đỉnh. Với mục đích là để hình thành mô phân sinh đỉnh. Hình thành mô sẹo hay tái sinh chồi. Cơ chất của môi trường cấy thường làm đặc hay lỏng. Một số loài thử nghiệm thành công khi sử dụng TCL là cây thuốc lá, cà chua, lan hồ điệp. công cụ chứa là ống nghiệm hay đĩa peptri có kích thước sao cho phù hợp với thể tích môi trường nuôi cấy và thể tích không khí để cung cấp dinh dưỡng cho mẫu cấy.
Phương pháp TCL cải tiến
Sử dụng tổ hợp tiền chất trên chất ức chế để nghiên cứu động lực của các con đường sinh tổng hợp khác nhau và để làm giảm mức tối thiểu sự biến đổi nội tạng của nhân tố môi trường cũng như tính gắn kết của vật liệu sinh học. Phương pháp cải tiến được Richard (1987) thực hiện bằng việc sử dụng các đĩa giếng gồm 24 đĩa với kích thước 1,6 cm để làm vật liệu chứa. Mỗi đĩa đựng một thể tích môi trường xác định sao cho tỉ lệ thể tích không khí trên thể tích môi trường thích hợp. Một màng nhựa mỏng có kích thước đàn hồi đã cách li mỗi cá thể theo trật tự để ngăn ngừa sự thay đổi giữa các đĩa riêng biệt và sự nhiễm vi sinh vật. Đĩa được bịt kín với hai lớp màng (urgo) phương pháp này có ưu điểm là sự phân bố ngẫu nhiên các mẫu cấy TCL trong mỗi đĩa. Nhờ đó giảm được kích cỡ của của các đĩa giếng và lát mỏng tiếp xúc được với các điều kiện đồng nhất của môi trường (ánh sáng, nhiệt độ, CO2, O2 ) dẫn đến giảm sự biến động.
Quy trình kỹ thuật về nuôi cấy mô tế bào
Theo Georger (1993) quá trình nhân giống vô tính in vitro bao gồm các bước:
Bước 0: chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
Trước khi tiến hành nhân giống in - vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này cần sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu in - vitro.
Bước 1: Nuôi cấy khởi động
Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in - vitro. Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt. Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây. Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn , đỉnh chồi nách và sau đó là đỉnh chồi hoa và cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá, chồi ngọn, chồi nách được sử dụng để nhân nhanh các cây: măng tây, dứa, khoai tây, thuốc lá, hoa cúc ..
Bước 2: Nhân nhanh
Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng thông qua con đường: hoạt hoá chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính. Vấn đề này phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả là cao nhất. Theo nguyên tắc chung môi trường có nhiều xitokynin sẽ kích thích tạo chồi. Chế độ nuôi cấy thường là 25- 270C và 16 giờ chiếu sáng/ ngày, cường độ ánh sáng 2000- 4000 lux. Tuy nhiên đối với mỗi loại đối tượng nuôi cấy đòi hỏi có chế độ nuôi cấy khác nhau: nhân nhanh suplơ cần quang chu kì chiếu sáng 9 giờ/ ngày, nhân nhanh phong lan phalenopsis ở giai đoạn đầu cần che tối.
Bước 3: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Để tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ thường được bổ sung một lượng nhỏ auxin. Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu xytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng
Bước 4: Thích ứng cây in - vitro ngoài điều kiện tự nhiên
Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỉ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu:
+ Cây trong ống nghiệm đã đạt được những tiêu chuẩn hình thái nhất định( số lá, số rễ, chiều cao cây).
+ Có giá thể tiếp nhận cây in - vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước.
+ phải chủ động điều chỉnh được ẩm độ, sự chiếu sáng của vườn ươm cũng
như có chế độ dinh dưỡng phù hợp [17].
Các vấn đề cần quan tâm trong nhân giống in - vitro
Tính bất định về mặt di truyền (genetic in stability)
Mục đích của nhân giống in - vitro là tạo ra quần thể cây đồng nhất (Tue-to-type) với số lượng rất lớn. Tuy nhiên, trong một số trường hợp phương pháp này cũng tạo ra những biến dị soma. Tần số biến dị cũng hoàn toàn khác nhau và không lặp lại. Cây tạo ra do nuôi cấy tế bào mô sẹo có nhiều biến dị hơn so với nuôi cấy chồi đỉnh. Dạng biến dị phổ biến là bạch tạng, sọc lá, sinh trưởng của cây bất thường, hệ số nhân in - vitro cũng giảm sút. Nhiều cây khi trồng trên đồng ruộng có số lá trên 100 lá vẫn chưa ra hoa kết quả trong khi cây bình thường có thể xử lý ra hoa khi cây có mặt 40 lá.
Sự nhiễm mẫu (explantcontamination)
Các vi sinh vật như nấm, vi khuẩn nói chung đều bị loại trừ khi khử trùng mẫu đưa vào nuôi cấy. Tuy nhiên một số loại vi khuẩn như Agrobacterium, Bacillus, Corylabactorium, Erwinnia và Pscudomnas có thể xâm nhập vào mô dẫn, tồn tại trong mô và bắt đầu gây tác hại khi tế bào bắt đầu phân chia (sau 1 – 2 tuần nuôi cấy). Để khắc phục được hiện tượng trên, trước hết cần lựa chọn cây mẹ đúng tiêu chuẩn. Người ta cũng có thể sử dụng một số chất kháng sinh để chống hiện tượng nhiễm khuẩn và nấm mốc. Nhưng mô thực vật rất mẫn cảm với kháng sinh và có phản ứng lên kiểu di truyền do đó cần rất thận trọng khi sử dụng kháng sinh. Chất kháng sinh thường gây ra những huỷ hoại ở ti thể và lạp thể nên có ảnh hưởng đến di truyền tế bào chất.
Sự tiết độc tố từ mẫu cấy (Toxic compounds)
Trong nuôi cấy mô thường quan sát thấy hiện tượng hoá nâu hay đen mẫu, mẫu này có thể khuyếch tán trong môi trường. Hiện tượng này là do mẫu nuôi cấy có chứa nhiều chất tanin hay hydroxyphenol. Thí dụ các chất phenol: encomicaxit và tyramine đã làm hoá nâu mẫu cây lan Cattleya khi nuôicấy. Các phương pháp phòng trừ sự hoá n...

---