ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CHUA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC BÀI BÁO CÁO
MÔN SINH HỌC SINH SẢN Đề Tài:
GVHD: Cô Nguyễn Thị Thương Huyền
Nhóm 1:
1. Đỗ Thái Thục Uyên 0515200
2. Hồ Thị Kim Lan 0515283
3. Đỗ Thị Ngọc Anh 0615006
4. Bùi Thị Thúy Ái 0615175
5. Lê Thị Xuân Bình 0615
6. Trương Thị Bích 0615182
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày tháng 3 năm 2009
MỤC LỤC
I. TỔNG QUAN
III.2.2.1 Tách Phôi
III.2.2.1.1 Tách phôi làm đôi
III.2.2.1.2 Tách phôi thành từng tế bào riêng rẽ
III.2.2.1.3 Ý nghĩa
III.2.2.2 Chuyển Nhân
III.2.2.2.1 Giới thiệu
III.2.2.2.2 Nguyên lý và quy trình cơ bản
III.2.2.2.3 Một số kỹ thuật chuyển nhân được ứng dụng phổ biến
III.2.2.2.4 Sự phát triển của phôi sau khi chuyển nhân
III.2.2.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công của kỹ thuật chuyển
nhân
III.2.2.2.6 Hiệu quả của kỹ thuật chuyển nhân
III.2.3 Đạo Lý Sinh Học Trong Nhân Bản Vô Tính
III.3 THÀNH TỰU VÀ ỨNG DỤNG
III.3.1 THÀNH TỰU
III.3.2 ỨNG DỤNG III.3.2.1 Ứng dụng trong nông nghiệp
III.3.2.2 Ứng dụng khác của nhân bản
III.3.2.3 Ứng dụng trong y-sinh học
Các sinh vật đã ra đời, tồn tại và phát triển qua một thời gian dài, với nhiều sự tiến
hóa, thay đổi để thích nghi với những biến động của môi trường. Một yêu cầu được
đặt ra là làm sao để duy trì được số lượng loài còn sống, như vậy mới có thể duy trì
nòi giống và phát triển. Để làm được điều này buộc sinh vật phải thực hiện một
chức năng sống của mình đó chính là Sinh sản!
Trong tự nhiên, có hai hình thức sinh sản phổ biến là Sinh sản vô tính và Sinh sản
hữu tính. Mỗi hình thức phù hợp với từng bậc tiến hoá của sinh vật. Thông thường,
ở những loài có mức độ tiến hoá thấp, thường sử dụng hình thức sính sản vô tính;
còn ở những loài có mức độ tiến hoá cao hơn thì sử dụng hình thức sinh sản hữu
tính. Vậy một vấn đề đặt ra là tại sao khi trình độ khoa học kỹ thuật ngày càng phát
triển cao hơn, thì các nhà khoa học lại có xu hướng nghiên cứu trên các loài động
vật bậc cao – thậm chí trên cơ thể con người - nhằm tạo ra các thế hệ bằng hình
thức sinh sản vô tính. Vậy chứng tỏ sinh sản vô tính ngày càng thể hiện được tầm
quan trọng trong nghiên cứu khoa học và việc nghiên cứu, mở rộng và áp dụng
sinh sản vô tính để phục vụ cho mục đích của con người là rất cần thiết. Nhưng
việc áp dụng sinh sản vô tính vào việc tạo ra các cá thể mới có phù hợp với quy
luật tự nhiên và đạo lý sinh học hay không là một câu hỏi lớn đã và đang được bàn
luận xôn xao trong giới khoa học và những giới quan tâm.
I.5 SINH SẢN VÔ TÍNH
Bản chất của sinh sản vô tính là quá trình nguyên phân. Ở đây, có sự phát triển của
một cá thể mẹ qua nhiều lần phân bào nguyên nhiễm, tiếp theo là sự tách rời một
phần cá thể ấy, để hình thành nên một cơ thể con. Cad tế bào con nhận được bộ
gen nguyên vẹn từ tế bào mẹ ban đầu, đến lượt mình, chúng lại cho ra các thế hệ
con cái tiếp theo. (Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, 2006, Công nghệ sinh học
người và động vật).
I.6 LƯỢC SỬ QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU
phôi đã biệt hóa 1 tuần.
9
Năm 1997: Ra đời cừu Dolly, động vật có vú đầu tiên được tạo ra từ phương
pháp sinh sản vô tính. Con người bắt đầu đóng vai của Chúa.
Năm
1998: Các nhà nghiên cứu của trường đại học Wisconsin lần đầu tiên
tạo ra được các tế bào gốc phôi, mở ra con đường cho sự sản xuất “theo nhu
cầu” các mô cho cấy ghép.
9
Tháng 1.2002: Một nhóm nghiên cứu ở bang Texas thực hiện sinh sản vô
tính lần đầu tiên một con mèo sau khi đã từ chối thực hiện làm một con chó
vô tính.
9 Tháng 12.2005: Tại Mỹ và Italy, các nhà nghiên cứu thông báo rằng các thí
nghiệm về sinh sản vô tính người đang được tiến hành. Tuy nhiên, đây
chẳng qua chỉ là một trò đùa.
9
Tháng 10.2003: Tại Trung Quốc, các bác sỹ thông báo sự thụ thai đầu tiên
bằng kỹ thuật “chuyển nhân”. Nhân của trứng của một nữ bệnh nhân vô sinh
được cấy vào trong trứng đã được loại bỏ nhân của một phụ nữ khác.
Phương pháp này rất giống với sinh sản vô tính đã vấp phải sự phản đối
kịch liệt.
9
Tháng 12.2003: Các nhà nghiên cứu của bệnh viện nhi Boston tạo ra các
tinh trùng từ các tế bào gốc và sử dụng chúng để tạo ra một phôi.
9
Tháng 2.2004: Các nhà khoa học Hàn Quốc tạo ra các tế bào gốc phôi từ
một phôi người thu được bằng phương pháp sinh sản vô tính.
9
Tháng 3.2004: Một nhà nghiên cứu của trường đại học Harvard nuôi 17
dòng tế bào gốc lấy từ các phôi dư thừa được tạo ra từ các thụ thai trong ống
VII. TIẾN TRÌNH THỰC HIỆN
9 Lập nhóm (16/2/2009)
9 Nhận đề tài (16/2/2009)
9 Họp nhóm phân tích đề tài, lập đề cương (28/2/2009)
9 Tham khảo ý kiến của Giảng viên về Đề cương (02/3/2009)
9 Sữa chữa Đề cương (02/3/2009)
9 Phân chia nhiệm vụ cho từng thành viên theo nội dung Đề cương
(02/3/2009)
9 Tổng hợp Tài liệu từ sách và internet. (02/3/2009 – 09/3/2009)
9 Tổng hợp bài viết thành phần (09/3/2009)
9 Hoàn chỉnh bài báo cáo lần 1. (16/3/2009)
9 Tham khảo ý kiến của Giảng viên về bài báo cáo (17/3/2009)
9 Sửa chữa và hoàn chỉnh bài báo cáo lần 2 (18/3/2009)
VIII. NỘI DUNG
III.4 SINH SẢN VÔ TÍNH TỰ NHIÊN
III.1.3 Hình Thức Sinh Sản Vô Tính Tự Nhiên ở Động Vật Không Xương
III.1.1.1
Nảy chồi: các chồi phát triển đủ lớn sẽ tách
rời khỏi cơ thể mẹ. Trong vài trường hợp, cá thể con
không rời khỏi cơ thể mẹ, chúng hợp thành một tập đoàn
III.1.1.2
Phân mảnh: Cá thể mẹ phân ra thành 2 hay nhiều phần bằng nhau,
mỗi phần pháy triển thành cá thể mới. Hải quỳ phân chia bằng hình thức này. Ở
giun đốt, nơi đầu mút thân sẽ tạo thành cá thể mới, đầu và cơ quan thụ cảm sẽ
hình thành trước khi cá thể bố mẹ phân mảnh. Dạng biến tấu khác được thấy ở
bọt biển: một số tế bào chuyên biệt trở thành chồi mầm, chồi mầm được giải
phóng, phát triển thành cá thể mới. (Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, 2006,
Công nghệ sinh học người và động vật)
http://images.google.com.vn/imgres?imgurl=http://images.nld.com.vn/images/uplo
aded/nvhung/2009/01/23/5-
chan2.jpg&imgrefurl=http://www.nld.com.vn/
20090123120332977P0C1077/hai-ngay-hon-
20000-luot-khach-tham-
quan.htm&usg=___3liMS5ZKBFfffDMrOAK
AXWCQlM=&h=300&w=400&sz=40&hl=vi
&start=8&um=1&tbnid=ei0Gz0LuCdM23M:
&tbnh=93&tbnw=124&prev=/images%3Fq%
3DHa%CC%89i%2Bquy%CC%80%26hl%3Dvi%26sa%3DG%26um%3D1
Hình 3. Hải quỳ
III.1.1.3
Nhân đôi: Hình thành eo thắt, phân chia đều tế bào chất và nhân (
trùng biến hình, trùng đế giày…) (Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, 2006,
Công nghệ sinh học người và động vật)
Hình 4. Một tế bào ban đầu, nhân phân chia, tế bào chất phân chia và hình thành
2 tế bào mới.
http://www.ekcsk12.org/faculty/jbuckley/regbio/mitosisqz.html
HÌnh 6. So sánh sự khác nhau giữa trứng bình thường và trứng trinh sản
Tùy thuộc vào trạng thái di truyền của trứng khi sự phát triển của phôi bắt đầu mà
có 2 hình thức trinh sản: đơn bội và lưỡng bội.
III.1.1.5.1 Trinh sản đơn bội: Nhân của trứng trải qua các lần phân chia giảm
nhiễm bình thường và tế bào trứng mang bộ nhiễm sắc thể đơn bội (n),
không qua thụ tinh nhưng v
ẫn phát triển thành phôi rồi thành cơ thể đơn
bội. ( Nguyễn Sỹ Mai,1988, Những kiễn thức cơ bản về di truyền học) Ví dụ
như: ong, kiến, tò vò và một số rệp, nhện…
Thường những cơ thể này có sức sống kém và hoàn toàn vô sinh nhưng đặc biệt
ở ong và một số loài không xương sống, trinh sản đơn bội lại làm xuất hiện
những con đực hữu thụ bình thường, chúng là những giao tử đã được “cơ thể
Sinh đôi cùng trứng ở người được xem là hình thức tạo dòng vô tính tự nhiên.
Trường hợp này xảy ra rất ít, nguyên nhân chưa được tìm hiểu rõ ràng, mặc dù về
hình thức, hợp tử phân đôi thành hai tế bào phôi, từ đó hình thành nên hai cá thể,
phát triển song song trong tử cung của người mẹ.
Các hiện tượng đa sinh nhiểu hơn hai cá thể rất hiếm gặp trong tự nhiên.
Loài tatu (armadillo) chỉ rụng trứng duy nhất
trong chu kỳ một năm. Sau khi trứng được thụ
tinh, phôi phân chia nguyên nhiễm tạo thành 4
tế bào phôi, mỗi tế bào cho ra một con. Như
vậy, có bốn con (đôi khi nhiều hơn) ra đời từ
một phôi ban đầu, tất cả tatu vừa được sinh ra
một lứa đều có bộ máy di truyền như nhau, và
tất nhiên cùng giới tính.
Hình 7. Tatu Dasytus Bellus
(Bolivia, 2001)
(Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, 2006, Công nghệ sinh học người và động vật)
Trinh sản: Ở động vật có xương sống, trinh sản tự nhiên ở bò sát như thằn lằn đá
(Lacerta saxicola) và ở gà tây trong điều kiện tự nhiên có đến 40% trứng không
thụ tinh có khả năng phát triển, nhưng chỉ có tỉ lệ nhỏ phát triển thành gà con.
Trong bệnh học người, trinh sản có thể là nguồn gốc của một số u quái. Và người
ta có thể dùng nhiều tác nhân khác nhau như thay đổi nhiệt độ, pH, độ muối,
tác nhân hóa học hay cơ học để tác động vào trứng để không xảy ra quá trình thụ
tinh nhưng vẫn phát triển thành cơ thể gọi là trinh sản nhân tạo. Ví dụ khi trứng đã
thành thục bằng xử lí lạnh hoặc axit, đặc biệt đối với những trứng đẻ vào nước.
(
http://elearning.hueuni.edu.vn/mod/searchbook/searchall.php?searchcourse=trin
thụ tinh thực sự bởi con đực,
nhưng rất hiếm (khoảng một phần
triệu trường hợp giao phối), điều
này giúp đổi mới vốn gen loài.
Hình 8.Kỳ giông Ambystoma
(Jim Bogart, 2003)
9 Phụ sinh: Đây là quá trình tạo ra một cá thể lưỡng bội chỉ chứa thông tin di
truyền của con đực. do vậy, quần thể loài phụ sinh chỉ bao gồm những con
đực. Tinh trùng của chúng sẽ được thụ tinh với trứng của loài có quan hệ
gần gũi. Chẳng han, loài cá A. nobillis sẽ thụ tinh với trứng của loài
Cyprinnus carpio để tạo hợp tử, hợp tử phát triển tạo thành phôi. Phôi chỉ
chứa nguyên liệu di truyền của con đực A, nobillis. Rõ ràng, A. nobillis chỉ
mượn trứng của Cyprinus carpio để phát triển loài.
9
Trinh sản giả: Nhiều tác giả gọi là trinh sản lai, bởi hiện tượng này không
hoàn toàn là sinh sản vô tính mà còn có tính chất bán dòng, hay nửa dòng
(hemiclonal), với một nửa bộ gen được truyền cho thế hệ tiếp theo và một
nửa còn lại được thay thế.
Trong những loài trinh sản giả, con cái giao phối với con đực và cả hai đều
đóng góp nguyên liệu di truyền cho con của chúng. Nhưng khi những con
cái trưởng thàn, các trứng do chúng sản xuất không chứa nguyên liệu di
truyền từ cha, mà chứa một bản sao chính xác nguyên liệu di truyền từ mẹ.
Quá trình sinh sản tiếp tục thì cứ mỗi thế hệ sẽ mang một nửa vốn di truyền
từ mẹ và một nửa vốn di truyền từ cha.
Hình thức nói trên thường thấy ở chủng cá Poeciliopsis.
màng ZP hoặc không, trước khi được chuyển vào mẹ nhận.
Tỷ lệ mang thai trong hai trường hợp này khác nhau đôi chút. Ở một số loài, các
phôi nửa phải được đặt vào trong màng ZP bởi chúng có xu hướng kết hợp và dung
hợp vào nhau khi tiếp xúc, hình thành phôi khảm lớn hơn. Chưa có bằng chứng nào
về những khiếm khuyết sau khi sinh cũng như những bất thường khác biểu hiện ở
thế hệ con cái khi thực hiện quy trình này. Có thể sử dụng nhều phương pháp để
tách phôi ở mỗi giai đoạn khác nhau, chẳng hạn dùng enzyme (phương pháp hóa
học); các yếu tố vật lý (siêu âm, laser…) hay tách bằng tác động cơ học (sử dụng
dao hay các pipette). Tuy nhiên phương pháp cơ học vẫn được coi là tiện dụng và
an toàn hơn cả.
a. Điều kiện của phôi
Chỉ nên chọn các phôi được xác định chắc chắn là phát triển bình thường.
Giai đoạn cuối của phôi dâu (phôi dâu già) hoặc giai đoạn đầu của phôi nang (phôi
nang sớm), khi khối tế bào đủ lớn và chưa biệt hóa sẽ cho kết quả tách đôi cao hơn. Hình 10. Hai con bê đầu tiên ra đời từ kỹ thuật cắt phôi tại Việt Nam
Viện chăn nuôi quốc gia – Từ Liên, Hà Nội, 2005
Nếu tách ở giai đoạn phôi dâu, chỉ cần chia hai khối mầm phôi; nếu cắt ở giai
đoạn phôi nang, cần chú ý ngoài phần nhân ra, thì phần lá nuôi (trophoblast)
cũng phải được tách kèm. Khi chia cắt phôi ở các giai đoạn muộn hơn, tế bào
phôi đã biệt hóa hình thành nên các lá phôi, lúc này xác suất cho một cơ thể
trọn vẹn khó được đảm bảo, thông thường thai bị chết trước khi sinh. Hình 11. Cắt phôi làm đôi
càng nhanh càng tốt, cố gắng trong khoảng 20 phút cho một phôi (Vlanov và
cs, 1987). Cần chú ý khi chuyển phôi vào vỏ trứng, tránh không để tế bào sót,
rơi rụng.
Hình 12. Cắt phôi theo quan điểm thứ nhất
Thao tác phân tách phôi theo quan điểm thứ hai
- Gắn dao cắt vào hệ thống vi thao tác sao cho mũi dao thẳng góc với đáy đĩa
Petri.
- Đưa phôi vào đĩa có chứa sẵn 200-300 ml dung dịch nuôi cấy, đợi 3-5 phút,
phôi sẽ bám xuống đáy của đĩa.
- Sau khi phôi đã cố định và được quan sát rõ (dưới kính hiển vi phóng đại
nhỏ), di chuyển bộ phận dao cắt xuống gần phôi, tăng độ phóng đại lên dần.
- Lưỡi dao cho thấp xuống từ từ và đặt vào đúng giữa khối tế bào (giữa phôi),
nếu là phôi nang phải cân đối để có thể chia 1/2 lá phôi cho mỗi nửa.
- Cho dao thấp xuống nữa hướng tới đáy đĩa; khi dao đã chạm tới đáy: phôi đã
được cắt (điều khiển lưỡi dao chuyển động nhanh, dứt khoát).
- Chuyển phôi sang dung dịch nuôi cấy khác. Hạn chế mọi tác động mạnh,
không cần thiết vì phôi sau khi cắt rất mỏng manh và đã bị tổn thương. Yêu cầu
cả hai phương pháp trên phải đảm bảo mỗi nửa phôi có được ít nhất từ 40 đến
45% khối tế bào phôi còn nguyên vẹn. Điều này cần lưu ý người thao tác về
việc lựa chọn dụng cụ cắt.
Sử dụng các dao cắt có chất lượng không tốt có thể phá vỡ từ 20-30% các tế
bào phôi, với các loại dao tốt, tỷ lệ này có thể chỉ 10-15%. Sau khi cắt, phôi
được nuôi cấy trong môi trường mới từ 2-3 giờ trước khi đem cấy
c. Khả năng sống của phôi nửa (half-embryo)
tế bào phôi giai đoạn hai tế bào của nhím biển (sea urchin) bằng cách lắc với
nước biển, những tế bào rời đã phát triển thành những cá thể riêng biệt. Hơn
mười năm sau, một thí nghiệm tương tự với kết quả cũng tương tự được lập lại
bởi Hans Spemann, nhưng trên đối tượng kỳ giông.
Các thí nghiệm thời đó chưa kiểm soát được nhiệt độ cũng như hệ thống thao
tác, hóa chất chưa tốt, nên kìm hãm sự ứng dụng của phương pháp này trên
động vật hữu nhũ. Thành công tách phôi đầu tiên trên gia súc với mục đích
nhân nhanh những loài có giá trị được tiến hành bởi Willasden (1979) và Ozil
và cs (1982). Đến nay, kỹ thuật này đã được ứng dụng thành công ở chuột nhà,
chuột cống, thỏ, cừu, bò, heo và khỉ Rhesus.
b. Quy trình
9 Tạo phôi: Chọn phôi ở giai đoạn sớm, các phôi này có thể được
thu nhận bằng cách gội rửa tử cung con vật hay tạo ra trong
phòng thí nghiệm.
9 Tách rời các tế bào: Các tế bào giai đoạn này liên kết với nhau
khá yếu nên để tách rời chúng, có thể dùng enzyme trypsin hoặc
lắc nhẹ trong môi trường ổn nhiệt, đồng thời không có các ion
Ca
2+
và Mg
2+
.
9 Đóng gói tế bào phôi: Để các tế bào phát triển thành phôi, chúng
được bao bởi lớp ZP. Các ZP có thể được tạo ra bằng cách hút bỏ
noãn bào của tế bào trứng cùng loài hay khác loài, hoặc ZP nhân
tạo
9 Nuôi cấy: Nuôi phôi in vitro đến giai đoạn blastocyst và cấy
truyền vào mẹ nhận đã gây động dục đồng pha.
phương thức điển hình của vi thao tác trong tạo dòng vô tính. Khác với vi tiêm tinh
trùng, nhân tế bào sinh dưỡng của cơ thể trưởng thành (hay của tế bào phôi) được
thu nhận và chuyển vào trứng trưởng thành (đã loại bỏ nhân). Kỹ thuật này giúp
tạo các dòng tế bào mới, và nếu tiếp tục phát triển, một ” phôi ” mới sẽ hình thành
để cho ra một cá thể mới thông qua cấy phôi. Cá thể con ra đời có một ” bản sao ”
DNA chính xác của chính cơ thể mẹ đã cung cấp nguồn tế bào sinh dưỡng ban đầu
nói trên. Ngoài vi tiêm, thao tác chuyển nhân có thể còn được kết hợp hỗ trợ bằng
các kỹ thuật xung điện khác. Chuyển nhân là một trong các kỹ thuật quan trọng của
công nghệ tạo dòng vô tính, nhưng không là phải kỹ thuật duy nhất. Chẳng hạn có
thể tiến hành tách phôi (còn gọi là sự chia phôi), hay trinh sản để tạo dòng vô tính
động vật.
III.2.2.2.2 Giới thiệu
Chuyển nhân là kỹ thuật then chốt của công nghệ tạo dòng động vật mà trong
đó biểu hiện đỉnh cao là các sản phẩm của nhân bản (cloning) vô tính. Ở một
số động vật, đã có những tế bào phôi sớm chưa biệt hóa và cả các tế bào đã biệt
hóa với mức độ cao của cơ thể trưởng thành được sử dụng chuyển nhân thành
công. Trong những năm gần đầy, công nghệ chuyển nhân của tế bào phôi được
ứng dụng trên chuột khi sử dụng những tế bào gốc phôi thu nhận từ lớp ICM,
phôi giai đoạn blastocyst. Sau đó, nhiều kiểu tế bào đã biệt hóa thu nhận từ
phôi, thai hay tế bào của cơ thể trưởng thành (Wilmut và cs, 1997) được khai
thác và sử dụng để chuyển nhân
Hình 15. Quá trình chuyển nhân tạo cừu Dolly
Sự ra đời của cừu Dolly như là một thuyết về tính toàn năng của tế bào sinh
dưỡng trưởng thành đã mở ra nhiều cơ hội mới và hướng mới trong nghiên
cứu. Từ đó ra đời các thuật ngữ “ Chuyển nhân tế bào sinh dưỡng ” (Somatic
cell nuclear transfer_SCNT) và “ Chuyển nhân tế bào phôi ” (embryonic cell
trưởng thành và nuôi cấy chín in vitro. Một số nghiên cứu cho thấy có sự tương
tự giữa hai loại trứng này trong hiệu quả tạo dòng. Tuy nhiên, trên thực tế ở
một vài quy trình khác, việc sử dụng trứng chín in vivo cho kết quả phôi phát
triển đến blastocyst cao hơn khi dùng trứng chín in vitro. Chẳng hạn Ono và cs
(2001) đã coi việc sử dụng trứng chín in vivo làm cytoplast như một gải pháp
để cải thiện sự phát triển của heo và chuột tạo dòng vô tính.
Hình 16. Loại nhân tế bào trứng Nếu nguyên liệu di truyền (nhân) được chuyển từ một tế bào này sang tế bào
khác, trước hết DNA của tế bào nhận phải được tách ra. Trong trường hợp
trứng còn được bao bọc bởi màng zona pellucida, nên loại bỏ nhân ở kỳ nghỉ
MII, bởi lúc này, NST đang được nén chặt và tập trung ở mặt phẳng xích đạo
của thoi vô sắc. Quy trình chuyển nhân được khái quát gồm năm bước sau:
a. Bước 1 - chuẩn bị cytoplast:
Các tế bào trứng chưa thụ tinh được sử dụng như là tế bào nhận nhân mới, sau
khi loại bỏ nhân của chính chúng. Các trứng này thường được thu nhận bằng
phương pháp chọc hút buồng trứng, sau đó, nuôi trưởng thành in vitro và cuối
cùng loại bỏ nhân. Quá trình bao gồm việc loại bỏ các NST ở kỳ metaphase và
đẩy ra thể cực thứ nhất. DNA ty thể của trứng vẫn phải còn trong nguyên sinh
chất.
b. Bước 2, chuẩn bị tế bào cho nhân:
Các tế bào cho có thể lấy từ nhiều nguồn khác nhau với nhiều mức độ biệt hóa
khác nhau. Ngoài trường hợp sử dụng tế bào tuyến vú tạo cừu Dolly như đã
kết quả dung hợp, do vậy phải duy trì ổn định.
Ngoài ra, cần lưu ý tới các thông số lý hóa khác (áp suất, độ keo ). Mg cần
thiết cho quá trình dung hợp để cung cấp nguồn cation hóa trị hai, giúp duy trì
tốt sự tiếp xúc màng giữa hai tế bào. Thêm vào môi trường 0,1 mg/ml các đại
phân tử (như albumin huyết thanh bò, polyvinyl alcohol hay PVP) để ngăn cản
trứng không dính vào dụng cụ. Tuy nhiên, nếu dùng các đại phân tử, chúng
phải đủ lớn để không thể xuyên qua màng ZP gây ảnh hưởng đến sự tiếp xúc
của hai màng cần dung hợp. Hầu hết các nhà nghiên cứu đều 239 không dùng
hệ thống đệm cho môi trường dung hợp, mặc dù nếu sử dụng đệm 0,5 mM
HEPES thì cũng cho kết quả tốt (Wells và cs, 1999). Để tiến hành dung hợp
bằng xung điện , cặp trứng-tế bào được đặt vào môi trường nhược trương nhẹ,
nồng độ ion thấp giữa hai điện cực song song. Phát xung điện một chiều với
điện áp cao sẽ làm vỡ cấu trúc phospholipide trên màng, do đó tạo ra những lỗ
hổng. Trong quá trình hàn gắn, các màng sẽ dung hợp với nhau. Điện áp quá
cao và thời gian dài sẽ làm ly giải tế bào, nhưng điện áp thấp và thời gian ngắn,
khó dung hợp. Do vậy, cần điều chỉnh sao cho thích hợp, các thông số sử dụng
là1,25–1,5 kV/cm trong 50 µgiây. Có nhiều buồng chứa chuyên biệt khác nhau
cho việc dung hợp trứng với tế bào, chúng có thể được điều chỉnh kích thước
và vị trí các cực điện. Thông thường, các buồng dung hợp đều có hướng dẫn
phương pháp tính toán lực điện trường và cách thức vận hành. Cũng có thể vi
tiêm tế bào cho nhân vào bên dưới màng zona pellucida, cạnh với màng của
cytoplast rồi dung hợp chúng bằng xung điện. Bằng cách này, thông tin di
truyền từ tế bào cho sẽ đi vào cytoplast. Thường ngay sau đó, tế bào khởi động
hiện tượng “ tái thiết lập chương trình ” nhờ sự tương tác giữa các nhân tố bên
trong cytoplast với NST của tế bào cho. Ở bò, tỷ lệ thành công với dung hợp
điện thường 36%-89%, tỷ lệ này ở heo là 59% và ở cừu là 63% - 85%
((Wilmut và cs, 1997; Wells và cs, 1998). Dung hợp bằng virus Sendai đã bị
bất hoạt thường cho hiệu quả thấp (43% - 69%) nên ít được sử dụng. Nếu sử
dụng kết hợp giữa dung hợp xung điện và virus Sendai thì kết quả cao hơn.
Việc làm trên tạo lực cơ học mạnh khi tế bào cọ sát nhiều lần với miệng ống
pipette, khiến màng sinh chất tổn thương, lỏng lẻo và vỡ, giải phóng nhân. Hút
và thu nhận nhân 2n . Tiêm nhân vào trứng có thể được tiến hành bằng phương
pháp cổ điển hay dùng xung điện. Ở ngựa, với phương pháp vi tiêm cổ điển, tỷ
lệ các tế bào tái thiết lập chương trình 240 là13%-30%, nếu kết hợp xung điện,
tỷ lệ này tới 80% (Choi và cs, 2002), thậm chí cao hơn cả với phương pháp
dung hợp bằng điện 20%- 48%. Tương tự, ở chuột, khi tiêm nhân tế bào cho
vào trứng bằng phương pháp có hỗ trợ xung điện, tỷ lệ nhân được cấu trúc lại
trong trứng cao tới 79%-95 (Wakayama và cs, 2001), thậm chí cao hơn cả
phương pháp dung hợp bằng xung điện hay virus Sendai (Ogura và cs, 2000).
Một kỹ thuật mới bỏ qua bước dung hợp hay tách nhân tế bào cho, được đưa ra
bởi Jang-Won Lee (2003): sử dụng tế bào cho nguyên vẹn (không tách riêng
nhân), để tiêm thẳng vào trứng nhận đã loại nhân. Quy trình này được áp dụng
để tạo dòng heo với nhân cho là cumulus và thu được tỷ lệ thành công cao. Các
tế bào cumulus sau khi thu nhận được ly tâm ở tốc độ 800 g trong 5 phút để rửa
sạch môi trường nuôi và làm cô đặc. Huyền phù cặn bằng môi trường thao tác
và đặt các tế bào vào giọt thao tác (đã chứa sẵn các trứng bị loại bỏ nhân). Có
thể hút vài tế bào vào pipette chuyển để tăng nhanh quá trình. Tiến hành
chuyển tế bào (thực hiện dưới kính vi thao tác ở độ phóng đại X 200).
Tế bào được chuyển vào khoảng không quanh hoàng thể của trứng. Trước khi
đâm thủng màng zona pellucida, tế bào cần được định vị gần với đầu pipette để
làm giảm lượng môi trường đưa vào trứng. Nên đưa pipette vào trứng tại vị trí
lỗ có sẵn trước đó (tạo ra trong quá trình loại nhân). Tế bào được chuyển vào
khoang trứng, sử dụng bộ phận vi tiêm để đẩy ra khỏi pipette khi đã đặt chúng
tiếp xúc với màng trứng ở vị trí hoàng thể và sau đó rút nhẹ nhàng pipette ra.
d. Bước 4, hoạt hóa phôi:
hoặc trạng thái nghỉ, tương ứng với trứng. Trước hết, nguồn nhân được thu nhận
từ tế bào tuyến vú của cừu Finn Dorset (động vật 1), tiến hành nuôi cấy in vitro để
chúng phân chia. Bước này rất hữu dụng khi cần có sự thay đổi hoạt động trong bộ
gen tế bào cho nhân. Các tế bào cho nhân (và cả tế bào trứng) đều cùng được bỏ
đói (starve), tức nuôi chúng trong môi trường dinh dưỡng tối thiểu, không cho
phát triển. Việc này làm cho các tế bào bắt đầu “ đóng khóa ” tất cả các gen hoạt
động và cùng đi vào trạng thái nghỉ G0. Trứng của cừu Blackface (động vật 2)
được loại bỏ nhân và đặt cạnh tế bào cho nhân. Dùng một xung điện để dung hợp
hai tế bào với nhau và đồng thời hoạt hóa sự phát triển phôi. Kỹ thuật này “ bắt
chước ” sự hoạt hóa của tinh trùng một cách không hoàn toàn. Sau khi kích thích,
thường chỉ một vài tế bào sống sót và phát triển thành phôi. Nếu phôi sống sót,
Copyright: Tài liệu đại học ©