Bài 10 Nấm men
A. PHÂN LOẠI NẤM MEN
B - CÁC PHƢƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM DÙNG ĐỂ ĐỊNH TÊN NẤM MEN

1. Quan sát hình thái tế bào nấm men và đo kích thƣớc
2. Nhuộm màu tế bào nấm men:
- Thuốc nhuộm soudan III:
- Thuốc nhuộm đen Soudan B (theo Burdon):
- Thuốc nhuộm safranin:
- Dung dịch nhuộm nhân tế bào:
- Dung dịch lục malachit:
3. Quan sát quá trình nảy chồi của tế bào nấm men
- Môi trƣờng mạch nha - cao nấm men - glucoza - pepton:
4. Quan sát khuẩn ty giả:
- Môi trƣờng khoai tây - glucoza:
- Môi trƣờng ngô:
5. Quan sát bào tử bắn (Ballistoconidium, Ballistospore):
- Môi trƣờng bột ngô:
6. Quan sát bào tử túi (ascospore):
a. Môi trƣờng miếng thạch cao:
b. Môi trƣờng miếng thạch cao cải tiến:
c. Môi trƣờng Gorodkowa (1908)
d. Xử lý với tia tử ngoại:
e. Môi trƣờng thạch nƣớc
f. Môi trƣờng Amano (1950)
g. Môi trƣờng dịch tinh bột khoai tây 0,5% (Almeida và Lacaza)
h. Môi trƣờng Kleyn:
6. Quan sát đặc tính nuôi cấy
7. Thí nghiệm xác định khả năng lên men các loại đƣờng
8. Thí nghiệm xác định khả năng đồng hoá các hợp chất cacbon khác nhau:
8.1. Phƣơng pháp đánh giá khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng dịch thể:

cực- multilateral budding) hoặc chỉ nẩy chồi ở hai cực (nẩy chồi theo hai cực- Bipolar budding)
hoặc chỉ nảy chồi ở một cực nhất định (nẩy chồi theo một cực – monopolar budding). Nấm
men còn có hình thức sinh sản phân cắt nhƣ vi khuẩn. Có thể hình thành một hay vài vách
ngăn để phân cắt tế bào mẹ thành những tế bào phân cắt (fission cells). Điển hình cho kiểu
phân cắt này là các nấm men thuộc chi Schizosaccharomyces. Ở một số nấm men thuộc ngành
Nấm đảm, có thể sinh ra dạng bào tử có cuống nhỏ (sterigmatoconidia) hoặc bào tử bắn
(ballistoconidia hay ballistospore). Bào tử có cuống nhỏ thƣờng gặp ở các chi nấm men
Fellomyces, Kockovaella và Sterigmatomyces, khi đó chồi sinh ra trên một nhánh nhỏ và tách
ra khi nhánh bị gẫy. Bào tử bắn đƣợc sinh ra trên một gai nhọn của tế bào nấm men và bị bắn
ra phí đối diện khi thành thục. Nếu cấy các nấm men sinh bào tử bắn thành hình zich zắc trên
thạch nghiêng hoặc trên đĩa Petri thì sau một thời gian nuôi cấy sẽ thấy xuất hiện trên thành
ống nghiệm hoặc nắp đĩa Petri có một hình zích zắc khác đƣợc hình thành bởi các bào tử bắn
lên. Bào tử bắn là đặc điểm của nấm men thuộc các chi Bensingtonia, Bullera, Deoszegia,
Kockovaella, Sporobolomyces Một số nấm men còn có một hình thức sinh sản vô tính nữa,
đó là việc hình thành các bào tử đốt (arthroconidia hay arthrospore). Khi đó sẽ hình thành các
vách ngăn ở đầu các nấm men dạng sợi, sau đó tách ra thành các bào tử đốt. Loại này gặp ở
các nấm men thuộc cả hai ngành: Nấm túi và Nấm đảm. Thƣờng gặp nhất là ở các chi nấm
men Galactomyces, Dipodascus (dạng vô tính là Geotrichum) và Trichosporon. Nấm men còn
có thể tạo thành dạng tản (thallus) dƣới dạng khuẩn ty (sợi nấm- hyphae) hay khuẩn ty giả
(giả sợi nấm – pseudohyphae).
Dạng sinh sản hữu tính ở nấm men là dạng các bào tử túi (ascospore) đƣợc sinh ra từ
các túi (asci). Có thể xảy ra sự tiếp hợp (conjugation) giữa hai tế bào nấm men tách rời hoặc
giữa tế bào mẹ và chồi. Còn có cả sự biến nạp trực tiếp trong 1 tế bào sinh dƣỡng (vegetative
cell), tế bào này biến thành túi không qua tiếp hợp (unconjugated ascus). Thƣờng trong mỗi
túi có 4 hay đôi khi có 8 bào tử túi. Trong một số trƣờng hợp lại chỉ có 1-2 bào tử túi. Bào tử
túi ở chi Saccharomyces có dạng hình cầu, hình bầu dục; ở chi Hanseniaspora và loài
Hansenula anomala có dạng hình mũ ; ở loài Hansenula saturnus bào tử túi có dạng quả xoài
giữa có vành đai nhƣ dạng Sao Thổ. Một số bào tử túi có dạng kéo dài hay hình xoắn…Bề mặt
bào tử túi có thể nhẵn nhụi, có thể xù xì hoặc có gai… Bào tử màng dày (hay bào tử áo-
chlamydospore) là dạng bào tử giúp nấm men vƣợt qua đƣợc điều kiện khó khăn của ngoại Nảy chồi
Bào tử túi
Bào tử màng dày
Bào tử đốt Vỏ nhày ở nấm men

Một vài loài nấm men gây bệnh ở người:
Candida albicans
Cryptococcus neoformans
Để phân loại nấm men ngƣời ta phải tiến hành nghiên cứu các đặc điểm sau đây:
*Đặc điểm hình thái: tế bào, khuẩn lạc, kiểu nẩy chồi, các dạng bào tử vô tính và hữu
tính, khuẩn ty và khuẩn ty giả
*Đặc điểm sinh lý và sinh hoá:
- Lên men 13 loại đƣờng
- Đồng hóa 46 nguồn carbon. Có thể dùng bộ kít chẩn đoán nhanh ID 32C (Bio
Mérieux SA, Marchy-l‟Étoile…)
- Tính chống chịu với 0,01% hoặc 0,1% cycloheximide (có thể bao gồm trong bộ
kit ID 32C).

C để
đƣờng hoá cho đến khi hết tinh bột (thử với dịch Lugol không thấy có màu xanh lam). Lọc lấy
dịch trong có thể thêm 3 lòng trắng trứng rồi trộn đều, đun sôi rồi lọc lấy dịch trong. Điều
chỉnh bằng nƣớc để có nồng độ đƣờng đạt 6
o
Baume.
Phân vào các dụng cụ thuỷ tinh đã khử trùng. Nếu làm môi trƣờng đặc thì thêm 2% thạch. Tốt
nhất là dùng mầm đại mạch, nếu không thì có thể dùng mầm lúa. Nồng độ thích hợp để nuôi
cấy nấm men dùng khi phân loại là 5,7
o
Baume. Có tài liệu lại sử dụng nồng độ 5-8
0
Baume.
Nấm men đƣợc nuôi cấy trong các ống nghiệm thạch nghiêng hoặc các ống nghiệm đựng 3 ml
môi trƣờng dịch thể. Nuôi cấy ở 25-30
0
C trong 3 ngày, sau đó lấy ra làm tiêu bản và quan sát.
Muốn đo kích thƣớc tế bào nấm men ngƣời ta thƣờng sử dụng trắc vi thị kính). Số tế bào nấm
men đƣợc đo không ít hơn 20. Chú ý là phải đo các tế bào trƣởng thành chứ không đo các chồi
mới nảy sinh. Tế bào nấm men có hình thái và kích thƣớc khác nhau tuỳ loài, tuỳ chi. Chúng có
thể có hình cầu, hình bầu dục, hình trứng, hình quả chanh châu Âu, hình ống v.v Khi quan
sát tế bào nấm men dƣới kính hiển vi có thể phân biệt đƣợc thành tế bào, tế bào chất, không
bào (vacuole) và các hạt dị nhiễm (metachromatic granules). Thành tế bào nấm men thẫm
hơn so với nguyên sinh chất, còn không bào thƣờng có hình tròn, màu nhạt hơn. Các hạt dị
nhiễm thƣờng bắt ánh sáng mạnh hơn, chúng lắc lƣ trong nguyên sinh chất theo chuyển động
Brown. Kích thƣớc của tế bào nấm men khác nhau rất nhiều tuỳ loài thuỳ chi, tuỳ điều kiện
sinh trƣởng và có thể thay đổi trong khoảng 1-5 x 5-30àm hay có khi dài hơn nữa. Kích thƣớc
tế bào của các loại nấm men thông thƣờng vào khoảng 4-5àm.

2. Nhuộm màu tế bào nấm men:

hạt glicogen có màu đỏ nâu. Muốn quan sát các giọt mỡ trong tế bào nấm men có thể làm tiêu
bản nhƣ sau:
Rỏ một giọt formalin lên phiến kính, dùng que cấy lấy một ít nấm men đã nuôi cấy 48-
72 giờ hoà vào giọt formalin. Để yên 5 phút sau đó thêm một giọt dung dịch thuốc nhuộm
xanh methylen, lại thêm một giọt thuốc nhuộm soudan III. Đặt lamelle dƣới kính hiển vi rồi
quan sát ta sẽ thấy nguyên sinh chất của tế bào nấm men bắt màu lam nhạt, không bào
không bắt màu còn các giọt mỡ có màu đỏ hồng.
- Thuốc nhuộm soudan III:
Soudan III 0,05g
Cồn 90% 100ml
Cũng có thể nhuộm các giọt mỡ bằng phƣơng pháp sau đây: Lấy thuốc nhuộm đen
Soudan B (Soudan black B) cho vào ống nghiệm. Dùng que cấy lấy một ít nấm men hoà vào
dịch thuốc nhuộm này. Giữ 20 phút. Lấy khoảng 2 vòng que cấy dịch thuốc nhuộm có nấm
men phết lên phiến kính. Làm khô tự nhiên. Nhuộm tiêu bản trong 30 giây bằng dịch thuốc
nhuộm safranin. Rửa nƣớc, đợi khô rồi soi kính. Nguyên sinh chất của tế bào nấm men sẽ có
màu đỏ nhạt còn các giọt mỡ có màu đen lam.
- Thuốc nhuộm đen Soudan B (theo Burdon):
Soudan black B 0,3g
Cồn 70% 100ml
(Trộn đều, để 24 giờ rồi mới sử dụng. Dùng trong vòng một tháng).
- Thuốc nhuộm safranin:
Dịch safranin 2,5% (trong cồn 95%) 10ml
Nƣớc cất 100ml
Muốn nhuộm nhân của tế bào nấm men có thể sử dụng phƣơng pháp sau đây:
Lấy một giọt nƣớc đặt lên 1 phiến kính. Dùng que cấy lấy một ít nấm men hoà vào giọt nƣớc
đó rồi dàn thành vết mỏng. Làm khô tự nhiên. Thêm vài giọt dung dịch picroformol, giữ vài
phút sau đó rửa bằng cồn 70%. Ngâm tiêu bản vào trong dung dịch FeNH
4
(SO
4

4
)
2
.12H
2
O 3g
Nƣớc 100ml
+ Dung dịch thuốc nhuộm hematoxilin
Hematoxilin 1g
Cồn 10ml
Nƣớc 90ml
Hoà tan hematoxilin trong cồn, sau đó thêm nƣớc, đậy nút bông rồi để 1 tháng sau mới sử
dụng.
Để quan sát tế bào nấm men có thể dùng dung dịch nigrozin 5%. Khi đó tế bào sẽ không bắt
màu, có thể phân biệt rõ trên một nền màu lam đen.
Để quan sát bào tử túi (tránh lầm với các không bào) có thể sử dụng một số các phƣơng pháp
nhuộm bào tử đã đƣợc giới thiệu trong chƣơng IV (phƣơng pháp nghiên cứu vi sinh vật học tập
1 NXB KHKT 1971). Cũng có thể nhuộm bào tử túi bằng phƣơng pháp sau đây: Rỏ 1 giọt nƣớc
lên phiến kính. Dùng que cấy lấy một ít nấm men trộn vào giọt nƣớc, dàn thành vết mỏng, để
khô tự nhiên.
Cố định trên ngọn lửa bằng đèn cồn, nhuộm bằng dung dịch lục malachit. Nhuộm 2 phút,
thƣờng xuyên hơ trên ngọn lửa cho bốc hơi (không đƣợc đun sôi). Rửa nƣớc nhẹ, nhuộm thêm
30 giây bằng dung dịch safranin 0,5% trong nƣớc. Nang bào tử sẽ bắt màu xanh lục còn tế
bào dinh dƣỡng có màu hồng.
- Dung dịch lục malachit:
Lục malachit (malachite green) 1g
Nƣớc 100ml (không đun nóng)

3. Quan sát quá trình nảy chồi của tế bào nấm men
(sử dụng cho tế bào nấm men dinh dƣỡng không có dạng sợi - non filamelletous vegetative

trƣờng pepton - glucoza, môi trƣờng khoai tây - glucoza hay môi trƣờng ngô.
- Môi trường thạch - pepton - glucoza:
Pepton 10g
Glucoza 20g
Thạch 20g
Nƣớc 1000ml
- Môi trường khoai tây - glucoza:
Nƣớc chiết khoai tây 10% 1000ml
Glucoza 20g
Thạch 20g
Cách làm nƣớc chiết khoai tây: cân 100g khoai tây đã gọt vỏ, rửa sạch và thái nhỏ,
thêm 300ml nƣớc, hấp ở áp lực 1at trong 1 giờ sau đó bổ sung nƣớc cho đủ 1000ml.
- Môi trường ngô:
cân 12,5g ngô, thêm 300ml nƣớc đun cách thuỷ 60
0
C trong 1 giờ, lọc lấy nƣớc trong.
Thêm nƣớc cho đủ 300ml. Sau đó thêm 3,8g thạch. Hấp ở áp lực 1at trong 15 phút. Lọc nóng
qua bông thấm nƣớc rồi phân vào các ống nghiệm và khử trùng ở áp lực 1at trong 15 phút.
Đổ môi trƣờng vào hộp Petri. Dùng que cấy, cấy nấm men thành 3 cặp đƣờng song
song ngắn, ở 3 chỗ. Dùng panh lấy lá kính mỏng (thƣờng xuyên ngâm trong còn 70%) đốt nhẹ
hết cồn, để nguội một chút rồi cẩn thận đặt nhẹ nhàng lên vết cấy. Phải cấy thế nào để hai
đƣờng cấy song song ở mỗi chỗ có chiều ngang nằm gọn giữa lá kính mỏng, hai đầu dài hơn lá
kính mỏng một chút (để sau này dễ quan sát). Cần chú ý là bề mặt thạch phải thật khô, khi
đậy lá kính mỏng, phải tránh bọt khí, đậy xong phải tránh di chuyển làm xô lệch lá kính mỏng.
Cũng có thể tiến hành theo phƣơng pháp sau đây: đổ môi trƣờng vào một hộp Petri, đợi
nguội 60
0
C, dùng panh lấy các phiến kính (lamelle) đặt nhẹ vào để sao cho có một lớp môi
trƣờng bám vào tạo thành lớp mỏng trên một mặt của phiến kính. Lấp ba phiến kính đã phủ
môi trƣờng nhƣ vậy đặt vào hộp Petri khác. Trong hộp Petri này có đựng một ít nƣớc vô trùng

đối diện với vết cấy sẽ có một hình ảnh mờ giống hệt với hình dáng vết cấy. Đó là các bào tử
bắn đã bắn ra lƣu lại trên phía đối diện vết cấy.
Hoặc cấy nấm men theo đƣờng thẳng hoặc zich zăc vào đĩa Petri chứa môi trƣờng bột
ngô, để ở 20
0
C sau từng thời điểm 3, 5,7,10, 15 ngày. Úp ngƣợc đĩa Petri lên một phiến kính
sạch, để qua đêm. Quan sát bào tử bắn trên phiến kính trên kính hiển vi.

6. Quan sát bào tử túi (ascospore):
Một số nấm men có khả năng hình thành bào tử hữu tính gọi là bào tử túi (ascospore
hay asconidium). Bào tử túi có khả năng bảo vệ nấm men chống lại với nhiều ảnh hƣởng có hại
của điều kiện ngoại cảnh. Thƣờng quan sát thấy bào tử túi của nấm men trong những môi
trƣờng nuụi c?y lõu Có thể là do việc tích luỹ một số sản phẩm trao đổi chất đã kích thích quá
trình tạo thành bào tử túi. Trong tế bào của mỗi loại nấm men sinh bào tử túi thƣờng tạo
thành một số lƣợng bào tử túi nhất định. Khi chứa bào tử túi thì tế bào đƣợc gọi là túi (asci, số
ít - ascus).
Thƣờng mỗi túi có 4 bào tử, một số loài chỉ có 1-2 bào tử, một số rất ít loài lại có tới 8
bào tử. Bào tử túi ở nấm men có hình dạng rất khác nhau, đây cũng là một đặc điểm thƣờng
dùng khi phân loại nấm men. Saccharomyces cerevisiae và rất nhiều loài nấm men khác có
bào tử túi hình cầu hay hình trứng. Hansenula anommala, Hanseniaspora có bào tử túi hình
bán cầu, phía dƣới có mép nhƣ vành mũ, Pichia membranaefaciens có bào tử túi vô quy tắc (có
thể có hình trứng, dài, tam giác, bầu dục, bán cầu ), Hansenula saturnus có hình bào tử túi
hình quả xoài, ở giữa có một vành đai nhỏ. Bào tử túi Schawanniomyces occidentalis cũng có
hình dạng tƣơng tự nhƣ vậy nhƣng bề mặt có gai. Một số loại nấm men lại có bào tử túi dài, có
khi hình xoắn. Thƣờng thƣờng nấm men tạo thành bào tử túi sau 5-10 ngày nuôi cấy trên môi
trƣờng thạch mạch nha. Muốn quan sát chỉ việc lấy một ít nấm men làm tiêu bản soi tƣơi
không cần nhuộm màu. Mục đích việc quan sát bào tử túi phải trả lời ba câu hỏi sau đây:
1. Nấm men có hình thành bào tử túi hay không.
2. Bào tử túi hình thành từ các tế bào dinh dƣỡng không xảy ra sự tiếp hợp trƣớc
đó hay là sau khi có sự tiếp hợp giữa hai tế bào dinh dƣỡng; cũng có thể là xảy ra sau khi có

4
: 0,2g
CaCl
2
: 0,05g
MgSO
4
: 0,05g
FeSO
4
: 0,001g
(NH4)
2
SO
4
: 0,5g
b. Môi trường miếng thạch cao cải tiến:
Cách tiến hành nhƣ trên nhƣng bề mặt miếng thạch cao đƣợc làm ẩm bằng nƣớc mạch
nha loãng hoặc dung dịch có chứa 2% manitol và 0,5% KH
2
PO
4
.
c. Môi trường Gorodkowa (1908)
Nƣớc thịt: 1 g
Pepton: 1 g
NaCl: 0,5 g
Glucoza: 0,25 g
Thạch: 2 g
Nƣớc: 100ml

HPO
4
: 0,02g
Biotin (có thể không cần): 2
Dịch hỗn hợp I: 1 ml
Thạch: 2 g
Nƣớc: 100 ml
Cách pha dịch hỗn hợp I: MgSO
4
- 0,4g; CuSO
4
- 0,002g; FeSO
4
- 0,2g; MnSO
4
- 0,2g; NaCl -
0,4g; nƣớc cất - 100ml).
Chú ý: Quan sát bào tử túi là đặc điểm quan trọng trong phân loại, tuy nhiên trong một số
trƣờng hợp khó có thể phát hiện thấy bào tử túi. Điều này có thể do các nguyên nhân sau:
- Môi trƣờng sinh bào tử túi là không thích hợp.
- Chủng nghiên cứu là dị tản (heterothalic) hay đồng tản (homothalic).
- Bào tử túi khó phát hiện và do ngƣời làm phân loại còn thiếu kinh nghiệm.
- Nấm men nghiên cứu thuộc loại không sinh bào tử túi (anascoporogenous).

6. Quan sát đặc tính nuôi cấy
Để quan sát các đặc tính nuôi cấy của nấm men ngƣời ta thƣờng cấy nấm men lên môi
trƣờng dịch thể, môi thƣờng thạch nghiêng và môi trƣờng thạch đĩa (hoặc dùng chai Roux).
Cấy nấm men vào các ống nghiệm đựng 3ml môi trƣờng mạch nha 10-15
0
Baling (xem phần

- Bề mặt trơn, nhẵn, bóng, ƣớt hay xù xì, ráp, có cấu tạo nhung hay gai, có nếp nhăn
hay không?
- Màu sắc khuẩn lạc.

7. Thí nghiệm xác định khả năng lên men các loại đƣờng
Khả năng lên men các loại đƣờng là một trong những chỉ tiêu quan trọng đƣợc sử dụng
để phân loại nấm men. Trong thí nghiệm này ngƣời ta thƣờng sử dụng môi trƣờng nƣớc chiết
giá đậu hay môi trƣờng chiết nấm men 0,5%.
- Cách làm môi trƣờng nƣớc chiết giá đậu: cân 200g giá đậu thêm 1000ml nƣớc. Đun
sôi 30 phút. Lọc lấy dịch trong rồi thêm nƣớc cho đủ 1000ml.
- Cách làm môi trƣờng nƣớc chiết nấm men: cân 200g men bia ép (hay 100g men bia
khô) thêm 1000ml nƣớc. Hấp bằng nồi hấp áp lực trong 15 phút ở nhiệt độ 120
0
C. Lọc nóng
qua nhiều lớp giấy lọc. Lại lọc nguội tới trong. Thêm nƣớc cho đủ 1000ml. Cũng có thể dùng
cao nấm men với nồng độ sử dụng là 0,5%.
Cách tiến hành:
- Sử dụng ống nghiệm có kích thƣớc 180 x16 mm. Đặt ngƣợc một ống Durham
(50x6mm) (miệng của ống Durham chạm đáy ống nghiệm).
- Phân 10-15ml môi trƣờng cơ sở (0,5% cao nấm men) và chứa từng nguồn đƣờng khác
nhau, ở nồng độ 50mM (tƣơng đƣơng 1%) riêng với rafinoza 100mM (tƣơng đƣơng 2%). Riêng
ống kiểm tra là không có một nguồn đƣờng nào. ống đối chứng là D-glucoza. Các ống nghiệm
chứa môi trƣờng đƣợc khử trùng sau đó cấy vào 100μl (khoảng 2 giọt) dung dịch huyền phù
nấm men có mật độ 10
7
tế bào/ml, để 25
0
C sau một tuần.
- Quan sát việc tạo CO
2

trelaloza, lactoza, melibioza, raffinoza, melezitoza, inulin, tinh bột tan, D-xyloza, L-arabinoza,
D- arabinoza, D-riboza, L-rhamnoza, D-glucosamin, N-acetyl-D-glucosamin, methanol,
ethanol, glycerol, erythritol, ribitol, galactitol, D-mannitol, D-glucitol, a- metyl-D-glucosid,
salicin, glucono-d-lacton, D-gluconat, 2-ketogluconat, 5-ketogluconat, DL-lactat, succinat,
citrat, inositol, hexandecan, saccharat, xylitol, L-arabinitol, propan 1,2 diol, butan 2,3 diol, D-
glucuronic acid, D-galacturonic acid.
- Giống gốc đƣợc chuẩn bị trên môi trƣờng thạch - pepton - glucoza - cao men - malt
để qua đêm. Sau đó tế bào đƣợc lấy ra và pha trong môi trƣờng nitơ cơ sở đạt tới mật độ tế
bào là 25x10
6
/ml (hay mật độ A
640
= 1,0).
- Sau đó lấy ra 100l
cấy vào các ống môi trƣờng đã chuẩn bị sẵn, sau đó để tĩnh hay lắc tay từng lúc (hàng
ngày). Cũng có thể lắc nghiêng bằng máy lắc ngang (góc lệch 15-40
0
) hay lắc tròn với các nấm
men có độ lắng cao.
Đánh giá sự sinh trƣởng thƣờng là dùng mắt so với hai ống dƣơng và âm bằng cách đặt
một miếng bìa trắng vạch một đƣờng đen và đặt đằng sau các ống nghiệm để so sánh. Tuy
nhiên có thể dùng phƣơng pháp so màu để so sánh với các đƣờng chuẩn đƣợc vẽ từ sinh khối
khô (cách này thƣờng ít đƣợc dùng với các tế bào nấm men có các tế bào kết dính với nhau).
Thí nghiệm có thể kéo dài trong một tuần hoặc có thể đến 4 tuần.
8.2. Sinh trưởng trên môi trường thạch
ống nghiệm có chứa 15ml môi trƣờng thạch nitơ cơ sở ở 45
0
C sau đó thêm 0,5 ml dịch
huyền phù tế bào nấm men đƣợc chuẩn bị nhƣ đã mô tả ở trên và lắc cho đều (tránh tạo bọt).
Các bƣớc phải thao tác nhanh để thạch không bị đông và nấm men không bị chết. Sau đó đổ

thấp ở các ống kiểm tra (không có nitơ) do lƣợng NH
3
ở khí quyển hoà tan vào môi trƣờng.

10. Thí nghiệm xác định khả năng hình thành hợp chất
loại tinh bột:
- Chuẩn bị dịch Lugol nhƣ sau:
5g I
2
và 10g KI đƣợc pha trong 100ml nƣớc cất. Pha loãng 5 lần trƣớc khi dùng.
Lodder và Kreger - van Rij đã sử dụng thí nghiệm này để phân biệt hai giống nấm men
Torulopsis (không hình thành hợp chất loại tinh bột) và Cryptococcus (hình thành hợp chất loại
tinh bột).
Môi trường :
(NH
4
)
2
SO
4
: 1 g
KH
2
PO
4
: 1 g
MgSO
4
.7H
2

2
O: 0,5 g
CaCl
2
.2H
2
O: 0,1 g
NaCl: 0,1 g
Cao nấm men: 1 g
Glucoza: 30 g
Nƣớc: 1000 g
Phân vào các bình tam giác một lớp môi trƣờng cao khoảng 0,5cm rồi khử trùng. Cấy
nấm men và nuôi cấy ở 25-30
0
C trong ba tuần, sau đó dùng thuốc thử Lugol để kiểm tra khả
năng sinh tinh bột.

11. Thí nghiệm xác định nhu cầu vitamin cho sinh trƣởng của nấm men:
Các nấm men khác nhau có nhu cầu khác nhau về vitamin để sinh trƣởng. Các thí
nghiệm ở đây nhằm kiểm tra sự sinh trƣởng của chủng nấm men vắng mặt tất cả hay từng loại
vitamin khác nhau.
Cách tiến hành nhƣ sau:
Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên môi trƣờng dịch thể. Môi trƣờng có đầy đủ các thành
phần dinh dƣỡng trừ vitamin (môi trƣờng không chứa nguồn vitamin nào). Toàn bộ ống
nghiệm thí nghiệm đƣợc chia thành hai lô. Một lô không có mặt bất kỳ một loại vitamin nào và
một lô thiếu từng vitamin lần lƣợt theo thứ tự dƣới đây (lƣợng vitamin cho 1 lít môi trƣờng).
Acid para-amino benzoic acid: 200 mg
Biotin: 20 mg
Acid folic: 2 mg
Myo - inositol: 10 mg

KH
2
PO
4
: 2g
glucoza : 5g
thạch: 20g
nƣớc: 1000ml
Đun tan môi trƣờng, thêm 6ml dung dịch đỏ phenol (phenol red) có nồng độ 0,2%
trong cồn. Khử trùng môi trƣờng ở nồi hấp (115
0
C/15 phút). Đợi nguội đến 50
0
C thêm 100ml
dung dịch urea (dung dịch 20% khử trùng riêng qua màng lọc). Phân vào ống nghiệm thủy
tinh vô trùng, làm thạch nghiêng. Sau đó cấy nấm men và giữ ở 26
0
C trong 7 ngày. Nếu nấm
men có khả năng sinh ureaza để phân giải urea thì môi trƣờng sẽ chuyển màu đỏ xẫm. Cũng
có thể tiến hành thí nghiệm với môi trƣờng dịch thể.

15. Thí nghiệm làm đổi màu Diazonium blue B (DBB test)
Một ống giống đƣợc cấy trên môi trƣờng pép ton - cao men - glucoza - malt - thạch 10
ngày tuổi và giữ ở 5
0
C trong vòng vài giờ. Sau khi đổ dung dịch DBB lạnh (ice - cold) lên trên.
Nếu môi trƣờng chuyển sang màu đỏ sẫm trong 2 phút ở nhiệt độ phòng, kết quả đƣợc coi là
dƣơng tính.
Dung dịch DBB đƣợc giữ trong lạnh băng (ice - cold) và đƣợc dùng trong ít phút trƣớc
khi nó mất màu. Chuẩn bị dung dịch này bằng cách hoà tan muối DBB (Brentamine Blue B của

120
0
C/15 phút (Môi trƣờng này đƣợc sản xuất và bán rộng rãi).
4. Môi trường thạch V-8 (Wicketam và cộng sự, 1946)
Đây là môi trƣờng đƣợc chuẩn bị từ hỗn dịch chiết của một số loại rau và men bánh mì.
Bình A chứa 14g thạch và 340 ml nƣớc. Bình B chứa 350 ml dịch chứa V-8 (sản xuất từ công ty
Campbeoo soup, Camden, N.J. USA) đƣợc trộn đều với 5g men ép đã đƣợc làm tan trong 10ml
nƣớc.
Bình B đƣợc đun sôi trong 10 phút và để nguội, điều chỉnh pH đến pH = 6,8 tại 20
0
C.
Bình A đƣợc làm tan thạch và trộn đều với bình B và phân vào các ống nghiệm khử trùng ở
120
0
C trong 15 phút.
5. Môi trường pepton - cao men - glucoza (Vander Walt và Codder, 1970)
Môi trƣờng dịch thể đƣợc chuẩn bị từ 5g- cao nấm men, 20g- D-glucoza, 10g- pepton
trong 1000ml nƣớc. Không cần điều chỉnh pH, thanh trùng ở 120
0
C trong 15 phút.
6. Thành phần môi trường tổng hợp (tinh khiết về thành phần hoá học)
(Wikerlam và Duta, 1948; Wikerlam, 1951; Barnett và Ingram, 1955; Difco manual of
Dehydroted culture media and Keagents).
Nguồn nitơ:
(NH
4
)
2
SO
4

FeCl
3
.6H
2
O: 200 mg
MnSO
4
.4H
2
O: 400 mg
Na
2
MoO
4
.H
2
O: 200 mg
ZnSO
4
.7H
2
O: 400 mg
Muối khoáng
KH
2
PO
4
: 850 mg
K
2

)
2
SO
4
, L-asparagin và các chất sinh trưởng.
Phân loại các chi nấm men

Phân loại các chi nấm men dựa trên các chỉ tiêu chủ yếu là: đặc điểm tế bào dinh dưỡng, đặc
điểm sinh sản hữu tính và đặc điểm sinh lý, nuôi cấy. Sau đây là các đặc điểm chủ yếu của từng chi
cụ thể:

I. Các chi nấm men thuộc ngành nấm túi.
Bào tử túi là bào tử hữu tính đặc trưng cho Ngành Nấm túi (Ascomycota) .
Bào tử đảm là bào tử hữu tính đặc trưng ở các nấm thuộc ngành nấm đảm (Basidiomycota).

A. Dạng sinh sản hữu tính ( Teleomorph)

1. Ambrosiozyma (5 loài)

Sinh sản sinh dưỡng: Tế bào nảy chồi đa cực, khuẩn ty giả và khuẩn ty thật với bào tử trần nảy
chồi (blastoconidia) , khuẩn ty thật có các lỗ trên vách ngăn, có thể nhìn thấy các chấm nhỏ khi
quan sát trên kính hiển vi.
Sinh sản hữu tính: Các túi bào tử cụm thành từng đám. Túi thường tạo thành trên sợi. Mỗi túi
thường có 1-4 bào tử túi dạng mũ.
Đặc điểm sinh lý: Lên men : Yếu và chậm
Đồng hoá nitrat : - (1 loài có)
Màng trên môi trường dịch thể : -
Cơ chất giống tinh bột : -
Đồng hóa inositol : -
Hoạt hoá Ureaza : -

4. Babjevia (1 loài)
Sinh sản sinh dưỡng: Tế bào nảy chồi đa cực, khuẩn ty thật hiếm khi tạo thành, khuẩn ty
giả sơ đẳng
Sinh sản hữu tính: Chồi phát triển trong các túi bào tử và vẫn gắn với tế bào mẹ. Có 4-30 bào tử
túi trong suốt, hình cầu hay elip.
Đặc điểm sinh lý: Lên men : -
Đồng hoá nitrat : -
Màng trên môi trường dịch thể : -
Cơ chất giống tinh bột : -/+
Đồng hóa inositol : -
Hoạt hoá Ureaza : -
Hoá lỏng gelatin : -

5. Cephaloascus (2 loài)

Sinh sản sinh dưỡng: Tế bào nảy chồi đa cực, có cả khuẩn ty giả và khuẩn ty thật, có bào
tử trần nảy chồi (blastoconidia) được sinh ra trên các gai khác nhau
Sinh sản hữu tính: Các bào tử túi thẳng đứng có thể nhẵn hoặc xù xì và trong suốt, màu hơi
nâu. Các túi bào tử cụm thành từng đám, mỗi túi chứa 4 bào tử túi hình mũ.
Đặc điểm sinh lý: Lên men : -/+
Đồng hoá nitrat : -
Màng trên môi trường dịch thể : +
Cơ chất giống tinh bột : -
Đồng hóa inositol : -
Hoạt hoá Ureaza : -
Hoá lỏng gelatin : - 6. Citeromyces (1 loài)
Sinh sản sinh dưỡng: Tế bào nảy chồi đa cực, không có khuẩn ty thật và khuẩn ty giả.