Tuyển chọn các chủng vi khuẩn Azotobacter
cho sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh vật

Trần Thị Linh

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận văn Thạc sĩ ngành: Vi sinh vật học; Mã số: 60 42 40
Người hướng dẫn: TS. Lê Như Kiểu
Năm bảo vệ: 2012

Abstract: Phân lập, tuyển chọn các chủng Azotobacter từ đất canh tác. Lựa chọn tổ
hợp chủng Azotobacter thích hợp để sản xuất phân bón. Phân loại và mức độ an toàn
của các chủng vi sinh vật nghiên cứu. Đánh giá ảnh hưởng của tổ hợp các chủng
Azotobacter lựa chọn đến sinh trưởng, phát triển và năng suất của cây lạc (thí nghiệm
trong nhà lưới và ngoài đồng ruộng diện hẹp).

Keywords: Vi sinh vật học; Vi khuẩn Azotobacter; Sản xuất phân bón; Phân bón hữu
cơ

Content
MỞ ĐẦU
Một thực trạng chúng ta đang thấy hiện nay là sự lạm dụng phân bón hóa học, thuốc bảo
vệ thực vật đã làm giảm khả năng chống chịu của cây trồng dẫn đến bùng nổ dịch bệnh, ảnh
hưởng không tốt đến chất lượng nông sản và cũng là nguyên nhân tất yếu dẫn đến thoái hóa
đất canh tác. Các sản phẩm hóa học này đã để lại những tồn dư của chúng và đang được tích
lũy trong hệ sinh thái, trở thành mối hiểm họa nghiêm trọng đe dọa sức khỏe của con người
và môi trường sống. Sử dụng phân bón hữu cơ vi sinh vật (HCVSV) là giải pháp mà các nhà
khoa học trên thế giới cũng như ở Việt Nam đang hướng đến.
Đất nước ta có nền kinh tế nông nghiệp là chủ yếu thì việc quan tâm đến năng suất và
chất lượng nông sản là mục tiêu hàng đầu vì không những giúp nâng cao đời sống của nông
dân mà còn thúc đẩy sự phát triển nền kinh tế quốc gia. Phân bón HCVSV (hay còn gọi là

Nội dung nghiên cứu
- Phân lập, tuyển chọn các chủng Azotobacter từ đất canh tác.
- Lựa chọn tổ hợp chủng Azotobacter thích hợp để sản xuất phân bón.
- Phân loại và mức độ an toàn của các chủng vi sinh vật nghiên cứu
- Đánh giá ảnh hưởng của tổ hợp các chủng Azotobacter lựa chọn đến sinh trưởng, phát
triển và năng suất của cây lạc (thí nghiệm trong nhà lưới và ngoài đồng ruộng diện hẹp). 3

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vi khuẩn Azotobacter
1.1.1. Đặc điểm hình thái và các đặc tính sinh lí, sinh hóa của Azotobacter.
Họ Azotobacteraceae gồm 2 chi Azotobacter (Beijerinck, 1901) và Azomonas
(Winogradsky, 1938).
Azotobacter được phân lập lần đầu tiên vào năm 1901. Đó là loài Azotobacter
chroococcum, về sau người ta tìm thấy nhiều loài khác trong chi Azotobacter (beijerinskii,
vinelandii, agllis).
Azotobacter là vi khuẩn cố định nitơ sống tự do trong đất, hiếu khí, không sinh bào tử,
Gram âm. Khi còn non tế bào thường có dạng hình que, kích thước khoảng 2,0- 7,0 × 10- 2,5
μm, đứng riêng rẽ hay xếp thành từng đôi chồng chất, tế bào nhuộm màu đồng đều, có khả
năng di động nhờ tiên mao mọc khắp cơ thể (chu mao). Khi già tế bào Azotobacter mất khả
năng di động, kích thước thu nhỏ lại trông giống như hình cầu. Nguyên sinh chất xuất hiện
nhiều hạt lổn nhổn. Đó là các hạt volutin, granulose, các giọt mỡ… Quan sát dưới kính hiển vi
ta còn thấy khi già tế bào Azotobacter được bao bọc bởi một vỏ nhầy khá dày. Vỏ nhầy của vi
khuẩn Azotobacter chứa khoảng 75 % là chất hiđrit của axit uronic và chứa khoảng 0,023 %
nitơ. Lượng ADN trong tế bào Azotobacter thường thấp hơn so với nhiều loại vi khuẩn khác
(0,70- 0,81%) [4].
Azotobacter có thể sử dụng nhiều loại hợp chất hữu cơ làm nguồn thức ăn cacbon.
Chúng cũng cần nhiều nguyên tố khoáng, đặc biệt là 2 nguyên tố vi lượng bor (B) và

4
+
. Muối nitrat là nguồn thức ăn nitơ
thích hợp đối với nhiều loại tảo, nấm sợi và xạ khuẩn nhưng ít thích hợp với nhiều loại nấm
men và vi khuẩn. Sau khi vi sinh vật sử dụng hết gốc NO
3
-
các ion kim loại còn lại: K
+
, Na
+
,
Mg
2+
,… làm kiềm hoá môi trường. Để tránh hiện tượng này người ta sử dụng muối NH
4
NO
3

làm nguồn nitơ cho nhiều loại vi sinh vật. Tuy nhiên gốc NH
4
+
thường bị hấp thụ nhanh rồi
mới hấp thụ đến gốc NO
3
-

Nguồn khoáng
Ngoài các chất hữu cơ, vô cơ, nước v.v… trong tế bào vi sinh vật còn chứa nhiều chất
khoáng. Lượng chất khoáng trong tế bào thường thay đổi tuỳ loài, tuỳ từng giai đoạn và điều

+ AH
2
+ ATP
nitrogenaza
NH
3
+ A + ADP +P

Năm 1992 các nhà khoa học đã hoàn thiện được cơ chế của quátrình cố định nitơ phân
tử như sau [4]
N = N NH = NH H
2
N-NH
2
NH
3

N
2
+ 8H
+
+ 8e
-
+ 16 Mg.ATP + 16º
nitrogenaza
2NH
3
+ H
2
+16 Mg.ADP + 16P

1.6. Chế phẩm phân bón chứa Azotobacter và hiệu quả trong trồng trọt trong những
nghiên cứu ban đầu.
Hoạt động của vi sinh vật có ích giúp đẩy nhanh quá trình khoáng hóa các hợp chất hữu
cơ trong đất, nâng cao độ phì nhiêu của đất, phù hợp với mọi loại đất. Đặc biệt là làm tăng độ
mùn, cung cấp các chất dinh dưỡng và giúp cải tạo đất xám, đất xám bạc màu, đất phèn. Khắc
phục hiện tượng chai đất do sử dụng phân bón hóa học lâu ngày, giúp cho đất tơi xốp màu mỡ
trở lại. Bảo vệ đất chống rửa trôi xói mòn. Cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết giúp cho
cây tăng trưởng, phát triển khỏe mạnh, có khả năng chống chịu tốt với sâu bệnh, nâng cao
năng suất cây trồng. Cung cấp các hệ vi sinh vật có ích, khả năng thích ứng cao, cải tạo đất
đồng thời có thể kìm hãm sự phát triển của các vi sinh vật gây hại từ đó làm giảm mầm mống
sâu bệnh (nấm, mốc ). Bên cạnh đó một số chủng vi sinh vật có khả năng tiết ra hoạt chất có
tác dụng kích thích sinh trưởng giúp cây phát triển nhanh, tốt, hạn chế sâu bệnh. Giúp bộ rễ
phát triển nhanh, sâu rộng, chắc khỏe, nâng cao năng suất, sản lượng cho cây trồng.
1.7. Tình hình nghiên cứu và sử dụng phân bón hữu cơ vi sinh vật ở trong nƣớc và ngoài
nƣớc.
Ở trong nước
Chiến lược an toàn dinh dưỡng cho cây và đất trồng là sử dụng cân đối phân bón hoá
học và phân bón sinh học cho cây trồng phù hợp với nhu cầu dinh dưỡng và điều kiện đất đai,
khí hậu, trong đó phân bón sinh học có vai trò vô cùng quan trọng
Trên thế giới
Ðến nay nhiều nước trên thế giới đã sản xuất chế phẩm vi sinh vật theo nhiều hướng,
nhiều dạng khác nhau. Phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên, kinh tế xã hội, khoa học công nghệ

7
và trình độ dân trí của mỗi nước. Nhưng tất cả đều sản xuất theo hướng tiện cho người sử
dụng và cho hiệu quả kinh tế cao nhất.
Ưu điểm
Tăng năng suất cây trồng, chất lượng sản phẩm tốt hơn, giảm ô nhiễm của hàm lượng
NO
3

216-2003. Thời gian theo dõi thí nghiệm là một chu kỳ sinh trưởng phát triển của cây trồng
(từ khi gieo trồng cho đến khi thu hoạch xong). Số liệu nghiên cứu được xử lý Microsoft Exel
2003 và phần mềm IRRISTAT.
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập, tuyển chọn các chủng Azotobacter hữu hiệu
Thu được 25 mẫu đất từ những khu vực trồng lúa tại Xuân Mai và khu vực trồng rau
màu tại đất phù sa sông Hồng ở Hà Nội. Trước khi phân lập, mẫu lấy về đem hong khô ở
nhiệt độ phòng để tăng tính chọn lọc. Việc hong khô đất là rất cần thiết vì các chủng phân lập
từ đất khô có khả năng tồn tại tốt hơn trong điều kiện nuôi cấy nhân tạo. Các chủng phân lập
từ đất ẩm dễ bị chết sau một thời gian dài bảo quản và dễ bị nhầm với Azomonas, một loại vi
khuẩn cũng cố định nitơ, có hình dạng giống Azotobacter nhưng không hình thành bào nang
[5].
Từ 25 mẫu đất này, đã phân lập được 09 chủng Azotobacter với đặc điểm hình thái
khuẩn lạc được tổng hợp tại bảng sau:
3.1.1. Tuyển chọn các chủng Azotobacter có khả năng cố định nitơ
Các chủng vi khuẩn Azotobacter được cấy truyền trên môi trường Ashby để xác định
thuần chủng và ổn định hoạt tính sinh học. Sau đó đánh giá lại khả năng cố định nitơ tự do
dựa vào phản ứng màu Nessler. Kết quả ở hình 3.2.
Kết quả ở hình 3.2 cho thấy cả 09 chủng đều có phản ứng màu với thuốc thử Nessler.
Trong đó, chủng AT10 có phản ứng mạnh nhất với thuốc thử Nessler, sau đó lần lượt là các
chủng AT4, AT7, AT2, AT6, AT9 và cuối cùng là 3 chủng AT1, AT3, AT8.
Để xác định hoạt tính cố định nitơ của các chủng Azotobacter mới phân lập được, 06
chủng AT10, AT4, AT7, AT2, AT6 và AT9 được cấy vào môi trường bán lỏng AT ở 30
0
C
trong 24 giờ, sau đó xác định hoạt tính khử axetylen trên máy sắc ký khí. Kết quả đo hoạt tính
khử axetylen của từng chủng được thể hiện ở bảng 3.2 và biểu đồ 3.1.

9
Như vậy, kết quả thử phản ứng màu của các chủng Azotobacter với thuốc thử Nessler

etylen/ml/ngày)
Sinh AIA
(

gAIA/ml)
Ức chế vi khuẩn gây bệnh héo
xanh lạc (vòng vô khuẩn D-d, mm)
AT2
2148,7
430
28

10
AT4
3281,6
39
-
AT7
2706,2
280
26
AT9
1071,6
410
-
AT10
4345,6
317
+
Ghi chú: (+): Vòng phân giải nhỏ (< 0,1 cm)

và năng suất của cây lạc
3.4.1. Đánh giá ảnh hƣởng của chế phẩm Azotobacter đối với cây lạc ở điều Hình 3.5:
Ảnh hưởng của dịch hỗn hợp các chủng Azotobacter đến khả năng sinh trưởng
phát triển và ức chế bệnh héo xanh cây lạc
3.4.2. Đánh giá ảnh hƣởng của chế phẩm Azotobacter đối với cây lạc L14 trên đồng
ruộng diện hẹp.
Bảng 3.11: Ảnh hưởng của dịch hỗn hợp các chủng Azotobacter đến khả năng sinh trưởng
và phát triển của cây lạc ngoài đồng ruộng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

Kết luận
1. Ba chủng Azotobacter AT2, AT7 và AT10 thuộc loài Azotobacter beijerinckii. Có
hoạt tính cố đinh nitơ thông qua khả năng hình thành etylen đạt từ 1071,6 – 4345,6
µmol/ml/ngày. Có hoạt tính sinh tổng AIA đạt tới 335µg/ml trong 7 ngày.
2. Hai chủng AT2 và AT7 có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh héo xanh
R.solanacearum, vòng phân giải ức chế đạt 26 – 28mm. Đây là một đặc tính quý, có
tính ứng dụng thực tiễn trong sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh rất cao.
3. Ba chủng Azotobacter AT2, AT7 và AT10 đảm bảo an toàn sinh học, thích hợp với
điều kiện sản xuất chế phẩm phân bón hữu cơ vi sinh vật và điều kiện áp dụng ra đồng
ruộng Việt Nam.
4. Trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhiễm dịch AT2, AT7 và AT10 cho hiệu quả năng
suất cao hơn, có ảnh hưởng tốt đến cây trồng như: chiều cao cây, trọng lượng thân lá
tươi và khô đạt giá trị cao nhất và tăng lần lượt 31,4%; 35,1%; 42,1% so với công
thức đối chứng và các công thức khác.

12
5. Hiệu quả của hỗn hợp dịch nuôi cấy trên đồng ruộng cho kết quả phù hợp với kết quả
thí nghiệm trong nhà lưới. Tất cả các chỉ tiêu đánh giá khi nhiễm hỗn hợp dịch nuôi

Nguyễn Thu Hà, Nguyễn Ngọc Quyên, Vũ Thị Minh Đức (2001), “Phân lập,
tuyển chọn chủng Azotobacter cho sản xuất phân bón vi sinh vật”, Hội thảo
Quốc tế sinh học. 2. 144 – 148.

13
6.
Nguyễn Minh Hưng Và cộng sự (2007), Phân bón vi sinh vật, Nxb nông
nghiệp.
7.
Phạm Xuân Lân (2007), Nghiên cứu ảnh hưởng của 1 số loại phân hữu cơ vi
sinh tới năng suất, hàm lượng NO3 của rau cải bắp và hóa tính đất trồng rau
tại thị xã Hà Giang, Đại học Nông Lâm.
8.
Vũ Triệu Mẫn, Lê Lương Tề (1998), Giáo trình bệnh cây công nghiệp, Nxb
nông nghiệp, Hà Nội.
9.
Nguyễn Thị Thanh Phụng (1982), “Nghiên cứu về đặc điểm vi sinh vật đất
trong các hệ sinh thái nông nghiệp Việt Nam”, Tạp chí Khoa học nông nghiệp,
7, tr. 294-300.
10.
Lê Xuân Phương (2009), Vi sinh vật học môi trường, Nhà xuất bản Đà Nẵng.
11.
Nguyễn Xuân Thành, Lê Văn Hưng, Phạm Văn Toản (2003), “Giáo trình công
nghệ vi sinh vật trong sản xuất nông nghiệp và xử lý ô nhiễm môi trường”, Nhà
xuất bản nông nghiệp.
12.
Ngô Tự Thành, Vũ Thị Minh Đức, Nguyễn Ngọc Quyên, Nguyễn Thu Hà
(2003), “Đặc tính sinh học của một số chủng Azotobacter”, Tạp chí Di truyền
học ứng dụng. 4. 31-37.
13.