1



BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC




GVHD: PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI
SVTH: LÂM THIÊN NGỌC

2



MỞ ĐẦU


những vaccin hay kích thích miễn dịch nhất định có thể ảnh hưởng đến sự phát
triển PMWS.
Những khác biệt trong sự phổ biến của PMWS ở các nước có thể góp phần vào
sự hiểu biết về sự phát sinh bệnh của tình trạng này. Đến nay, nhiều nghiên cứu về
bệnh này đã được báo cáo. Có nhiều phương pháp để xác định sự có mặt của
PCV2, bài này chỉ đề cập đến việ
c phát hiện PCV2 trên môi trường nuôi cấy tế
bào.Việc phát hiện PCV2 chỉ cho phép kết luận thú bị nhiễm PCV2 nhưng không
thể kết luận thú bị PMWS.
TỔNG QUAN
GIỚI THIỆU
PMWS ( Hội chứng còi cọc trên heo sau cai sữa) là 1 căn bệnh truyền nhiễm
nguy hiểm và phổ biến, ảnh hưởng đến nền công nghiệp nuôi heo trên toàn cầu.
Bệnh được phát hiện đầu tiên ở tây Canada 1991, với những triệu chứng như mấ
t
trọng lượng liên tục, bệnh hô hấp và vàng da. Những triệu chứng tương tự cũng
xuất hiện trên heo ở Mỹ, Pháp, bắc Ireland, Tây Ban Nha, Đan Mạch và Đức. Việc
xác định kháng nguyên PCV và nucleic acid trong những bệnh tích đưa đến khả
năng là virus PCV mới và độc hại hơn đã xuất hiện trong những đàn heo ở những
nước này. Tất cả PCV phân lập từ PMWS đều có những nhóm có liên hệ về trình
tự nucleotide, 96% trình tự nucleotide intragroup được xác định nhưng có vài sự
khác biệt với PCV phân lập từ dòng tế bào PK15, ít hơn 80% trình tự nucleotide
được xác định. Người ta cho rằng PCV gây ra PMWS nên được xem như là PCV
loại 2 và PCV gây bệnh trong môi trường tế bào PK15 là PCV loại 1.
Khi chưa có những nghiên cứu về dịch tễ phân tử, có 2 giả thiết liên quan đến
PCV2: một, PCV2 chính là PCV1 nhưng do sự thay đổi về kỹ thuật chăm sóc nuôi
dưỡng heo cũng như những yếu tố
môi trường khác đã tạo điều kiện cho PCV1 trở
4

đoán này dựa trên những trường hợp có tiền sử còi cọc và sự vỡ tế bào bạch cầu
hoặc viêm u hạt được quan sát trong nhiều cơ quan có liên quan với kháng nguyên
5


PCV2. Sự thiếu hụt tế bào bạch cầu không được quan sát hoặc mô lympho không
được chấp nhận trong những trường hợp này.
Có vài dấu hiệu bệnh lâm sàng cơ bản của PMWS làm tiền đề cho những chẩn
đoán lâm sàng bệnh bao gồm sưng hạch lympho, còi cọc, khó thở, tiêu chảy, vàng
vọt, vàng da. Những dấu hiệu này không xuất hiện riêng lẻ ở từng con heo, đa số
heo trong trang trại bị nhiễm bệnh sẽ có biể
u hiện lâm sàng bệnh. Để xác định
bệnh cần: sự hiện diện của những dấu hiệu lâm sàng bệnh, những bệnh tích mô học
và sự hiện diện của PCV 2 trong những bệnh tích đó.
Dấu hiệu lâm sàng của PMWS bị giới hạn bởi tuổi cai sữa của heo. PMWS xuất
hiện trên heo tuổi từ 25 đến 120 ngày, tập trung cao nhất trong khoảng tuổi từ 60
đến 80 ngày tuổi.

CÁC PHƯƠNG PHÁP CH
ẨN ĐOÁN VIRUS GÂY PMWS (
POSTWEANING MULTISYSTEMIC WASTING SYNDROME)
II.1 Phát hiện DNA PCV2 trong nuôi cấy tế bào
Để phát hiện DNA PCV2 bằng nuôi cấy tế bào, 5g mỗi bộ phận (phổi, hạch
lympho, hạch amidan) được thu thập, hòa lẫn trong 10 ml PBS (phosphate –
buffered saline) và đồng nhất.
Ly tâm dung dịch ở 1,500×g trong 30 phút ở 4°C, dịch nổi được thu thập lại và lọc
(0.45 μm, Sartorius,Göttingen, Germany).
Dịch lỏng sẽ được ủ ở 3 trong số 24 giếng của đĩa nuôi cấy ( Corning Inc., NY,
USA ), chứa 1 lớ
p NSK( dòng tế bào thận heo sơ sinh), tăng trưởng trong môi

phosphatase) và gắn với chất màu (chromogen), có thể quan sát dưới kính hiển vi
quang học.
2.2 Cách thực hiện
7


- Hóa mô miễn dịch được tiến hành trên mô, ngay cả khi mẫu bị đông lạnh
ở −20°C. Mẫu mô được thu nhận từ những con heo có những dấu hiệu lâm sàng
của pmws như giảm cân liên tục, bệnh đường hô hấp, vàng da, sưng hạch lympho.
- Mẫu mô dày khoảng 4-μm được nhuộm hematoxylin và eosin (HE) và với thuốc
nhuộm hóa mô miễn dịch sử dụng kháng thể đơn dòng chống PVC2.
- Sau khi làm khô và loại bỏ chất nhờn ở m
ẫu, peroxidase nội sinh sẽ ức chế với
peroxide hydrogen 0.3% trong methanol 30 phút, sự phục hồi kháng thể nhờ
protease XIV (0.05%) ở 37°C.
- Kháng huyết thanh thỏ đa dòng được đưa vào mẫu mô ở mức pha loãng 1:2000
trong PBS (phosphate –buffered saline) (pH 7.2) trong 1h ở 37°C
- Sau đó rửa mẫu trong PBS, 5 phút, thêm vào biotinylated anti-rabbit IgG trong
30 phút, 37°C.
- Sau đó, lại rửa bằng PBS, và streptavidin-biotin-peroxidase được đưa vào để
phát hiện sự có mặt của PCV trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.
- Sau 5 phút rửa trong PBS, mẫu được ủ trong enzyme diaminobenzidine.
tetrahydrochloride (DAB) trong 5 phút ở nhiệt
độ phòng ( DAB được sử dụng như
chất tạo màu), rửa và nhuộm với haematoxylin 1 phút ở nhiệt độ phòng.
- Mẫu được làm sạch nhờ cồn và xylene, đặt dưới lamen làm tiêu bản.
- Mẫu mô được nhuộm tương phản papanicoleu hematoxyline, làm khô nước và
cố định với dibutyl phthalate xylene. Mô lympho của heo con nhiễm PMWS ngẫu
nhiên , sự hiện diện của PCV2 được xác định nhờ PCR và lai in situ, được sử dụng
như là đối chứng dương. Đố

Fig. 1 Electron microphotograph of small
circovirus particles from supernatant of
newborn swine kidney cell culture on pooled
organs (bronchial lymph nodes, lungs, tonsils)
from wild boars with PCV2 infection. Negative
staining. Bar 50 nm
10


Không có virus khác giống những phân tử được quan sát trong môi trường
không nhiễm và đối chứng. Chỉ có 1 mẫu cho kết quả dương tính với nhuộm kháng
nguyên IHC trong tế bào chất và nhân tế bào của những nang trong hạch lympho
phổi (hình 2)

11


II.3 Lai tại chỗ (In situ hybridization)
3.1 Nguyên tắc:
Lai tại chỗ là kiểu lai phân tử trong đó trình tự đích cần tìm nằm ngay trong tế
bào, trong mô. Quá trình lai với mẫu dò đánh dấu và phát hiện phân tử lai được



enzyme tiêu hóa protein sử dụng protease XIV hoặc proteinase K ở nồng độ là 0.5
mg/ml cho 10, 20, 30 hoặc 40 phút ở 37°C.)
50 µl hỗn hợp lai được đưa vào và đặt dưới lamen.
DNA mục tiêu trong mô và mẫu dò PCV2 trong hỗn hợp lai sẽ bị biến tính khi ủ ở
90°C, 10 phút ngay sau khi làm lạnh ở túi đá. Sự lai được thể hiện trong khoảng
18-22h, ở 37°C trong môi trường ẩm.
Sau khi lai, slide kính được rửa 2 lần trong muối natri citrate. Slide được rửa lại
lần nữa trong PBS sau khi ủ trong buffer maleic acid 20 phút, 37°C.
Những mẫ
u cắt sau đó được chuyển vào buffer maleic acid, chứa 1% tác nhân ức
chế, sau khi ủ trong kháng thể anti-digoxygenin POD, pha loãng 1:200 trong 1%
chất ức chế/ buffer maleic acid.
Mẫu được rửa đầu tiên trong buffer maleic acid rồi đến 5mM PBS. Cuối cùng, đưa
DAB vào ( 3,3 diaminobenzidine).
Slide sẽ được nhuộm tương phản nhẹ với Harris hematoxylin, làm khô bằng cồn và
cố định làm tiêu bản để quan sát bằng kính hiển vi quang học.
3.3 Kết quả:
Hình thái học tế bào bị khử ở cả những mô cố
định formalin và ethanol khi so sánh
với những mẫu cắt nhuộm hematoxylin và eosin (HE) của cùng mẫu mô và phương
pháp cố định formalin.
Mô cố định ethanol có sự giảm rõ ràng về hình thái học khi ISH được so sánh với
HE hoặc ISH trên những mô cố định formalin.
Cả hai phương pháp cố định ethanol và formalin đều tạo ra cùng dạng nhuộm trên
mô dương tính PCV2. Khi cố định ethanol, mẫu tuyến ức và hạch lympho âm tính
PCV2 không chứa tế bào dương tính ISH. Mẫu nhiễm PCV2 chứa mô heo bị
PMWS được b
ảo quản formalin và ethanol. Mẫu cắt tuyến ức bị PMWS được cố


Hạn chế và ưu điểm của phương pháp IHC
Chậm
Đặc hiệu, nhạy
Đơn giản, dễ thực hiện, giá thành thấp
Thuận lợi trong việc bảo quản mẫu bệnh phẩm

Hạn chế và ưu điểm của phương pháp lai tại chỗ
Đặc hiệu cao
Độ nhạy cao, không ổn định
Phức tạp, giá thành cao

Phân lập virus
Để phân lập virus, kho
ảng 15% dịch nổi của mẫu mô được thu nhận từ MEM-
SA (Môi trường thiết yếu tối thiểu chứa muối earle và peniciline và streptomycin)
16


bằng cách nghiền mẫu với cối, chày vô trùng và thêm vào ít cát vô trùng. Sau đó
hòa tan với MEM-SA rồi ly tâm ở 3,000 x g trong 30 phút ở 4
0
C, loại bỏ dịch nổi.
trước khi ủ với môi trường tế bào, 100 µl chloroform được thêm vào đến 2ml dịch
nổi và trộn lẫn liên tục khoảng 10 phút ở nhiệt độ phòng. Hỗn hợp được chuyển
vào ống ly tâm và ly tâm ở 3000 x g trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi. Dịch nổi này
được sử dụng như nguyên liệu cấy cho nghiên cứu phân lập virus.

0
C trên gel silica trước khi sử dụng cho hóa
miễn dịch và ISH
17



II.4 Các phương pháp khác
Ngoài sử dụng phương pháp hóa mô miễn dịch và lai in situ, 1 số phương pháp
khác cũng được sử dụng để chẩn đoán PMWS virus như phương pháp PCR,
phương pháp ELISA, miễn dịch huỳnh quang gián tiếp…
4.1 Phương pháp PCR:
PCR được thực hiện để xác định sự hiện diện của PCV2 DNA trong
phổi, hạch bạch huyết và hạch amidan. DNA virus được ly trích với bộ kit QIAmp
DNA mini, thu thập từ động vật và đồng nhấ
t trong dung dịch PBS ( phosphate
buffer solution) tỉ lệ 1:5. Phản ứng PCR được thực hiện trong máy chu trình nhiệt
mastercyler gradient (eppendorf, Hamburg, Germany). 2 µl DNA trích được sử
dụng cho khuếch đại trình tự CAP (capsid protein gene). Sự khuếch đại được thực
hiện trong 25 µl hỗn hợp phản ứng với thành phần sau: MgCl2 (1 mM), Buffer
GoTaq® 1X (Promega, Madison, WI, USA), dNTPs (0.2 mM), primers 150 (5′-
ACTGTCAAGGCTACCACAGTCA-3′) và PMWS-1443 (5′-
CGGATATTGTAGTCCTGGTCG-3′; 1 μM), GoTaq® (1.25 U), and 2.5 μL of
DNA. Điều kiện phản ứng là : biến tính ở 94°C trong 1 phút, 35 chu kỳ ở 94°C
trong 1 phút, 55°C trong 1 phút, 72°C trong 1 phút , kéo dài ở 72°C trong 10 phút .
sả
n phẩm PCR (481) chạy điện di ở gel 2% agarose và được quan sát nhờ cơ chế
geldoc2000 (Bio-Rad Laboratories Inc., France). Đối chứng dương được chuẩn bị
từ 100 μL môi trường tế bào thận heo sơ sinh (NSK) nhiễm virus dòng PCV2 phân
lập từ đàn heo Italy. Với cùng lượng môi trường tế bào NSK, không có virus PCV

huyết thanh, giếng mẫu nhận được 50ml kháng thể đơn dòng chuyên biệt cho
PCV2, 12B6, pha loãng đến 42 mg/ml trong PBS-T, trong khi giếng chuẩn chỉ
nhận được PBS-T, sau đó ủ trong 30 phút ở 37
0
C. Kết hợp với HRP-GAM, pha
loãng 1:8000 trong PBS-T chứa 5% huyết thanh dê, thêm vào 100ml vào tất cả các
giếng, ủ ở 1h ở 37
0
C. Ezyme 3,3-5,5-tetramethylbenzidine được thêm vào ở nhiệt
độ phòng và phản ứng dừng sau 10 phút với 1 M H
2
SO
4
. Độ hấp thu được đọc ở
bước song 450nm. Kết quả mật độ quang OD được giải thích bằng việc tính toán
PI sử dụng công thức sau:
PI = 100 - [(serum OD/control OD) X 100]
19


Huyết thanh OD( cho mỗi huyết thanh) = huyết thanh trung bình giếng mẫu –
huyết thanh trung bình chuẩn và OD đối chứng= trung bình giếng mẫu tiếp hợp -
trung bình giếng chuẩn tiếp hợp (0% ức chế)
Kết quả giữa dãy âm và dương tính được tính toán từ trung bình phần trăm ức
chế của dãy âm IIF cộng 2 hoặc 3 độ lệch chuẩn của giá trị trung bình. Sự tính
toán này có độ tin cậy 95% hoặc 96% mà tất cả giá trị âm tính sẽ rơi vào trong
ph
ạm vi giới hạn.
Độ nhạy và tính chuyên biệt của ELISA được tính toán bằng công thức sau:
Độ nhạy = dương tính thật x 100/ dương tính thật + dương tính giả

Những nghiên cứu xa hơn cần được thực hiện để hiểu rõ hơn vai trò dịch tễ học
của heo hoang dã trong việc dẫn truyền sự nhiễm PCV2, đặc biệt như là 1 nơi chứa
tiềm tàng của những heo nuôi sống ở cùng khu vực địa lý
Trong chẩn đoán xác định nguyên nhân gây PMWS cần phải sử dụng các kỹ
thuật liên quan trực tiếp giữ
a virus và bệnh tích mô, vì vậy kỹ thuật hóa mô miễn
dịch và lai tại chỗ được khuyến khích sử dụng và đáng tin cậy hơn.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Nguyễn Ngọc Hải, 2007. Công nghệ sinh học trong thú y.
F. McNeilly et al,1999. Journal of virological methods 80, p 123-128
Alexander Hamberg, Susan Ringler, Steven Krakowka, 2007. Method for detection
of porcine circovirus type 2, p 135-141
G. M Alan et al, 1998. PCV-like viruses in diseased pigs, p 3-10
S. Petrini et al, 2009. Detection of PCV2 from wild boars in central Italy, p 465-
469 21


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU……………………………………………………………….3
TỔNG QUAN………………………………………………………… 4
Giới thiệu ……………………………………………………… 4
Phương pháp chẩn đoán………………………………………… 6