Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
Chương 1. Mở đầu
1.1. Đặt vấn đề
Hoa mười giờ (Portulaca grandiflora) là cây thân thảo thuộc họ rau sam, mặc
dù là một loài cây thân thảo phổ biến và dễ trồng nhưng chính nhờ tính đa dạng và
màu sắc sặc sỡ mà loài cây này mới giúp tôn lên vẻ đẹp của những khu vườn hay
khuôn viên, đặc biệt là lúc hoa nở rộ.
Nuôi cấy in vitro hoa mười giờ để khảo sát điều kiện sinh sống của hoa mười
giờ trong ống nghiệm khác thế nào so với điều kiện bên ngoài, ở bên ngoài môi
trường tự nhiên hoa mười giờ rất dễ trồng và thời gian phát triển cũng khá nhanh
nhưng khi tiến hành nuôi cấy in vitro mất khá nhiều thời gian thì mục đích chính là
khảo sát tập tính cũng như điều kiện sống của hoa mười giờ. Đây là loài cây thân có
nhiều lông nhỏ gây khó khăn trong việc tạo nguồn mẫu vô trùng. Đó là những bước
nghiên cứu ban đầu làm tiền đề cho việc nghiên cứu nuôi cấy hoa mười giờ ra hoa
trong ống nghiệm là một loại hình được khá nhiều người ưa thích vì nhìn rất đẹp, có
thể kinh doanh được, không phải chăm sóc như hoa ngoài tự nhiên mà cây vẫn tươi
tốt. Hoa mười giờ chính là đồng hồ sinh học vì cứ khoảng 8 – 10 giờ sáng là hoa nở
rộ, nghiên cứu này cũng để khảo sát vấn đề này xem vì sao hoa mười giờ lại có tập
tính này, cũng như hoa quỳnh nở vào lúc 12 giờ đêm, đó chính là điều đặc biệt của
loài cây này nhưng khi nuôi cấy trong ống nghiệm với điều kiện không có oxy cây
vẫn phát triển tốt nhưng để cây ra hoa và nở cả ngày là điều không dễ chút nào vì nó
phá vỡ quy luật tự nhiên của cây, đó là cứ 8 – 10 giờ cây mới cho hoa nở. Đây là vấn
đề cần phải nghiên cứu khá lâu và mất nhiều thời gian.
Là loài cây rất phổ biến và dễ trồng nên nó có giá trị kinh tế không cao khi
chưa tiến hành nuôi cấy in vitro. Đây là bước đầu khai thác giá trị kinh tế của loài
cây này, mặc dù khá phổ biến nhưng đây cũng là một loại thuốc nam rất công dụng
cùng với một số cây thuốc khác trong họ của nó như loài rau sam rất tốt cho sức
khỏe.
1.2. Mục đích và yêu cầu
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 1
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh

mục tiêu áp dụng kỹ thuật này để sản xuất cây giống thương mại. Vi nhân
giống đã trở thành một phương pháp nhân giống chuẩn và phổ biến đối với
nhiều loại cây trồng như: cây công nghiệp, cây lâm nghiệp, cây cảnh, cây
dược liệu, cây ăn trái và rau xanh. Phương pháp này có những ưu điểm vượt
trội so với phương pháp truyền thống:
Có khả năng tái sinh cây con từ các vùng mô và cơ quan khác nhau của
cây (trục thân, lóng thân, phiến lá, cuống lá, hoa, chồi phát hoa, hạt phấn) mà
ngoài tự nhiên không thể thực hiện được.
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 3
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
Có thể sản xuất được số lượng lớn cây giống trong một thời gian ngắn,
trên một diện tích nhỏ nhằm đáp ứng nhu cầu thương mại.
Cây con tạo ra đồng nhất về mặt di truyền.
Tạo cây sạch virus thông qua xử lý nhiệt hay nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.
Sản xuất quanh năm và chủ động kiểm soát được các yếu tố ngoại cảnh
như nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm,…
Bảo quản nguồn giống cây in vitro với số lượng lớn nhưng lại chiếm diện
tích rất nhỏ.
Tạo cây có khả năng ra hoa, tạo quả sớm.
Tạo dòng toàn cây cái (cây chà là) hoặc toàn đực (cây măng tây) theo
mong muốn.
Dễ dàng tạo giống cây trồng mới bằng phương pháp chuyển gen.
• Bên cạnh những ưu điểm nổi bật thuận lợi cho mục đích nhân giống như đã
được đề cập ở trên thì phương pháp vi nhân giống cũng có những nhược điểm
cần phải được khắc phục:
Giá thành cây con được sản xuất từ kỹ thuật vi nhân giống còn khá cao.
Tiến trình nhân giống phức tạp gồm nhiều giai đoạn liên quan và cần
khoảng thời gian dài trước khi có thể thích ứng trồng ngoài vườn ươm.
Sự đa dạng của dòng sản phẩm nhân giống rất hạn chế, nghĩa là cây con
tạo ra thường ít đồng nhất về mặt kiểu hình.

điều kiện môi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo.
Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện đối với các loại thực vật không có khả năng
nhân giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc
tính giống như cây mẹ. Từ một cụm tế bào mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc
nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên mức độ biến dị tế bào
soma lại cao hơn.
• Nuôi cấy tế bào đơn
Khối mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đặt trên máy lắc
có tốc độ điều chỉnh thích hợp sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng rẽ gọi là tế bào
đơn. Tế bào đơn được lọc và nuôi cấy trên môi trường đặc biệt để tăng sinh khối.
Với các cơ chất thích hợp được bổ sung vào trong môi trường tế bào có khả
năng sản xuất các chất có hoạt tính sinh học.
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 5
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trường lỏng tế bào đơn được
tách ra và trải trên môi trường thạch.
- Khi môi trường thạch có bổ sung auxin, tế bào đơn phát triển thành từng
cụm tế bào mô sẹo.
- Khi môi trường thạch có tỷ lệ cytokinin auxin thích hợp, tế bào đơn có khả
năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh.
• Nuôi cấy protoplast – chuyển gen
Protoplast (tế bào trần) là tế bào đơn được tách lớp vỏ cellulose, có sức sống
và duy trì đầy đủ các chức năng sẵn có.
Trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, protoplast có khả năng tái sinh màng tế
bào, tiếp tục phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh (tính toàn thế ở thực vật).
Khi tế bào mất vách và tiến hành dung hợp, hai protoplast có khả năng dung
hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện giống cây trồng.
Quá trình dung hợp protoplast có thể được thực hiện trên hai đối tượng cùng loài
hay khác loài.
• Nuôi cấy hạt phấn đơn bội

chết.
Có một số phương pháp hạn chế quá trình hóa thủy tinh thể như sau:
- Giảm sự hút nước của cây trong in vitro bằng cách tăng nồng độ đường
trong môi trường cấy hoặc dùng các chất có áp suất thẩm thấu cao. Tuy
nhiên, điều này có thể làm giảm sự tổng hợp của diệp lục tố và ức chế sự
hình thành chồi.
- Tránh gây thương tổn trên mẫu cấy khi khử trùng và tiếp xúc với môi
trường cấy ít nhất.
- Ở một số loài có thể sử dụng chất ABA.
- Giảm nồng độ đạm trong môi trường cấy.
- Giảm C
2
H
2
trong bình nuôi cấy bằng cách thông gió tốt, tăng cường ánh
sáng và giảm nhiệt độ phòng cấy.
2.1.4. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 7
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật được ứng dụng trong một số lĩnh
vực như:
• Lai tạo giữa những loài xa nhau về di truyền bằng phương pháp dung hợp
(nuôi cấy tế bào trần).
• Nuôi cấy tế bào thực vật trong môi trường lỏng (nuôi cấy huyền phù tế bào)
trên quy mô lớn để sản xuất các hợp chất thứ cấp.
• Chọn lọc tế bào có những đặc điểm mong muốn, cho phát triển thành cây con
thay vì chọn lọc cây ngoài đồng ruộng (nuôi cấy tế bào đơn).
• Sản xuất dòng cây đồng hợp tử (nuôi cấy bao phấn và túi phấn).
• Vi nhân giống những giống cây có giá trị khoa học và thương mại.
• Bảo quản phôi và cơ quan trong điều kiện nhiệt độ thấp.

• Việc nhân giống cây in vitro tạo được những cây sạch bệnh do có sự chọn lọc
các đối tượng sạch bệnh để đưa vào nuôi cấy đồng thời cũng có thể xử lý mẫu
cấy của các cây có mang mầm bệnh trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy.
Các cây sạch bệnh này có thể được trao đổi dễ dàng giữa các nơi với nhau do
cây có kích thước nhỏ và không trồng trong đất.
• Trong nuôi cấy in vitro chỉ sử dụng những mẫu cấy ban đầu rất nhỏ cho nên
có thể chọn lọc kỹ lưỡng và dễ dàng.
• Việc nhân giống in vitro giúp làm giảm không gian sử dụng so với nhân giống
in vivo và giảm các chi phí về năng lượng đối với các trường hợp các loại cây
cần được nhân giống trong nhà kính.
• Do cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện hoàn toàn thích hợp (nguồn
dinh dưỡng và điều kiện môi trường) do đó có thể sản xuất cây con quanh
năm.
• Có thể sử dụng cây nhân giống in vitro để làm cây mẹ cho các bước nhân
giống kế tiếp.
• Có thể tạo ra các đột biến điểm trong quá trình nuôi cấy.
• Phương pháp nhân giống in vitro đặc biệt hữu dụng để tạo ra các ngân hàng
gen.
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 9
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
• Các tế bào trần và huyền phù tế bào là đối tượng hữu dụng trong việc lai
soma.
• Một số loại cây bị mất khả năng sinh sản hữu tính như các cây đơn bội, cây
bất thụ đực, cây bất thụ do đột biến,… có thể được duy trì và nhân giống bằng
phương pháp nhân giống in vitro.
• Những bất lợi của phương pháp nhân giống vô tính in vitro:
- Kiểu gen thực vật không được ổn định trong một số hệ thống nuôi cấy.
- Tạo ra những cây không hoàn toàn đúng như mong muốn: mọc um tùm vì
một số cây còn giữ được khả năng trẻ hóa trong quá trình nuôi cấy.
- Đặc biệt, đối với một số loài cây thân gỗ, việc cảm ứng rễ rất khó thực hiện.

cây trồng. Đối với những loài không có khả năng nhân giống, người ta thường
nhân giống bằng cách tạo cụm chồi từ callus (mô sẹo). Trong môi trường
nhân giống thường bổ sung cytokinin, GA
3
và các chất hữu cơ khác.
• Nhân giống in vitro
Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây trồng bằng phương pháp
nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống.
Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thường giống môi
trường tạo thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp
với quá trình nhân giống kéo dài. Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá
trình tăng sinh diễn ra nhanh. Cây nhân giống in vitro ở trạng thái trẻ hóa và
được duy trì trong thời gian dài.
• Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh
Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá và rễ để chuẩn
bị chuyển ra vườn ươm. Cây con phải khỏe mạnh để nâng cao sức sống khi ra
môi trường bình thường. Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào
đó là các chất kích thích quá trình tạo rễ. Điều kiện nuôi cấy gần với điều kiện
tự nhiên bên ngoài, một bước làm thích nghi trước khi tách ra khỏi điều kiện
in vitro. Sự ra rễ phụ thuộc vào nhiều yếu tố: hàm lượng auxin nội sinh, tỷ lệ
C/N, ánh sáng, sự trẻ hóa của mẫu, kiểu di truyền. Người ta thường bổ sung
auxin để kích thích quá trình ra rễ in vitro.
• Chuyển cây con in vitro ra vườn ươm
Cây con đã ra rễ được lấy khỏi ống nghiệm, rửa sạch agar và được đặt
trong chậu nơi có bóng râm, độ ẩm cao, cường độ ánh sáng thấp,… Sau
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 11
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
khoảng 2 tuần, cây đã bắt đầu thích nghi với điều kiện bên ngoài, lúc này có
thể tăng cường độ chiếu sáng và hạ độ ẩm. Đây là giai đoạn rất quan trọng
trong quy trình nhân giống vô tính vì cây con thường bị chết do sự khác biệt

quá trình nuôi cấy,…
Tất cả những nguyên nhân trên cho thấy quá trình tái sinh rất phức tạp, chúng ta
không thể đề cập hết những khía cạnh liên quan nhưng cần lưu ý một số vấn đề
sau:
• Quá trình tái sinh phức tạp do chịu sự tương tác của nhiều nhân tố khác nhau
(môi trường dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ và các chất điều hòa sinh trưởng,
…).
• Không thể khái quát chung quá trình tái sinh cho tất cả các loài vì mỗi loài
khác nhau cần điều kiện tái sinh khác nhau.
• Khó có thể điều hòa quá trình tái sinh vì khả năng tái sinh của mỗi loài khác
nhau: trong những trường hợp này các nhân tố nội sinh đóng vai trò quyết
định do đó các yếu tố ngoại sinh như chất điều hòa ảnh hưởng không nhiều.
• Sự hình thành rễ bất định thườn đối lập với sự hình thành chồi bất định. Nếu
cả hai quá trình này được thúc đẩy đồng thời, cây con tạo ra sẽ mang nhiều
thiếu sót. Để thu nhận một cây hoàn chỉnh tốt nhất chúng ta nên tạo chồi bất
định trước sau đó cảm ứng tạo rễ.
2.1.8.1. Sự hình thành chồi bất định
• Sự hình thành chồi bất định được xem là một trong những phương pháp nhân
giống sinh dưỡng trong nuôi cấy mô. Ngày nay một số loài như Saintpaulia,
Begonia, Achimenes, Streptocarpus, Lilium, Ferine đang được nhân giống
bằng phương pháp này.
• Có nhiều điểm giống nhau giữa sự hình thành chồi bất định và rễ bất định: các
nhân tố có ảnh hưởng tích cực lên sự hình thành rễ bất định cũng thúc đẩy sự
hình thành chồi bất định. Điều này được thể hiện qua một số điểm sau:
Sự hình thành chồi bất định ở cây hạt trần chỉ thành công khi sử dụng các
bộ phận của cây con (Anonymous, 1984).
Đường đóng vai trò rất quan trọng trong sự hình thành chồi và rễ.
Sự hình thành chồi hay rễ đều bị ức chế bởi gibberellin và acid abscisic.
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 13
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh

Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
thúc đẩy tạo chồi ở nhiều loài thực vật nhưng nếu sử dụng BA ở nồng độ cao
sẽ xuất hiện nhiều biến dị (chồi biến dạng).
• Trong một số trường hợp, sự kết hợp giữa cytokinin và adenine (sulphate) sẽ
tăng hiệu quả tạo chồi (Skoog và Miller, 1975; Nitsch và cộng sự, 1969).
Trong một số trường hợp, việc sử dụng một mình adenine cũng có thể cảm
ứng tạo chồi: Begonia (Ringle và Nitsch, 1968), cây Thuốc lá (Skoog và Tsui,
1948), Plumbago indica (Nitsch, 1968).
• Sự gia tăng nồng độ gibberellin ức chế quá trình tạo chồi: ở loài Begonia rex
(Schrandolf và Reinert, 1959), Plumbago indica (Nitsch, 1968)… Acid
abscisic ức chế sự hình thành chồi bất định mặc dù vẫn có trường hợp cảm
ứng sự hình thành chồi như ở cây Ipomoea batatas.
2.1.8.2. Sự hình thành rễ bất định
• Rễ bất định được hình thành trên các cơ quan khác nhau của cây, nơi mô của
chúng còn giữ khả năng phân sinh.
• Quá trình hình thành rễ rất quan trọng vì nó ảnh hưởng đến khả năng sống sót
của mẫu cấy khi cây in vitro được chuyển ra vườn ươm.
• Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành rễ bất định: đặc điểm di truyền
loài, tuổi của mẫu, vị trí mẫu cấy trên thân, kích thước mẫu cấy, vết thương,
số lần cấy chuyền, nguồn oxy, ánh sáng, nhiệt độ, chất điều hòa sinh trưởng,
than hoạt tính, đường, agar, pH,…
2.1.9. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái in vitro
2.1.9.1. Ảnh hưởng của mẫu cấy
Vật liệu nuôi cấy là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh
trưởng và phát triển in vitro:
• Kiểu di truyền
Khả năng tái sinh của thực vật rất đa dạng. Những cây hai lá mầm thông
thường có khả năng tái sinh mạnh hơn cây một lá mầm và cây hạt trần rất khó
tái sinh (trừ khi chúng còn non). Trong số các cây hai lá mầm, Solanaceae,
Begoniaceae, Crassulaceae, Gesneriaceae, Cruciferae là những họ thực vật dễ

• Tình trạng sinh lý
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 16
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
Tình trạng sinh lý ảnh hưởng mạnh đến khả năng tái sinh và phân chia tế
bào in vitro. Thông thường các bộ phận của cây trong giai đoạn sinh dưỡng dễ
tái sinh hơn trong giai đoạn sinh sản. Các mẫu cấy từ vảy của cây huệ tây ở
giai đoạn sinh dưỡng tái sinh tốt hơn những mẫu cấy ở giai đoạn sinh sản
(Robb, 1957). Các chồi của cây trong giai đoạn ngủ đông (cuối thu đầu đông)
khó nuôi cấy in vitro hơn chồi của những cây đã vượt qua được giai đoạn này
(vào mùa xuân trước khi chúng bắt đầu phát triển).
• Vị trí của mẫu cấy trên cây
Ever (1984) đã khảo sát sự ảnh hưởng của vị trí mẫu cấy lên sự sinh
trưởng và phát triển in vitro sau khi tách mẫu ở cây Pseudotsuga menziesii,
ông nhận thấy những chồi ban đầu được tách từ những vị trí thấp trên cây phát
triển trong môi trường in vitro tốt hơn, và chồi gốc tăng trưởng nhanh hơn
chồi nách. Sự hình thành các giả hành bất định của mẫu cấy lan dạ hương
được tách ra từ phần gốc của vảy hành tốt hơn từ phần đỉnh. Điều này cũng
xảy ra tương tự đối với lily (Robb, 1957). Điều đáng lưu ý là những mô sẹo
phát sinh từ những mẫu cấy có nguồn gốc từ các phần khác nhau của cây như
rễ, chồi, cuống lá đều có phản ứng in vitro giống nhau.
• Kích thước mẫu cấy
Các cấu trúc nhỏ như tế bào, cụm tế bào và mô phân sinh khó cảm ứng để
tăng trưởng hơn những cấu trúc lớn như thân, lá, củ. Các phần được tách rời
khỏi cây tự nó cung cấp chất dinh dưỡng và hormone, do đó mẫu cấy có kích
thước càng lớn càng dễ tái sinh và phát triển. Các bộ phận của cây có chứa
nhiều chất dinh dưỡng dự trữ như củ, thân hành thường dễ tái sinh trên môi
trường in vitro hơn những cơ quan ít chất dự trữ. Đối với những mẫu bị cắt,
phần trăm bề mặt bị tổn thương cũng ảnh hưởng đến khả năng tái sinh. Ảnh
hưởng của vết thương lên sự tái sinh của các mẫu cấy từ vảy hành lily đã được
Aartrijk (1984) chứng minh.

dung dịch dinh dưỡng không phải lúc nào cũng thích hợp cho sự sinh trưởng
và phát triển vì nồng độ muối khoáng trong dung dịch quá cao. Ví dụ cây
đồng tiền rất nhạy cảm với muối đa lượng in vitro (Pierik và Seger, 1972).
Lloyd và McCown (1980) đã tìm ra một môi trường thích hợp cho một số loài
thân gỗ nhạy cảm với muối gọi là môi trường WPM (woody plant medium).
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 18
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
• Ảnh hưởng của pH
pH của môi trường nuôi cấy thường được điều chỉnh từ 5.5 – 6. pH dưới
5.5 thì agar không đông thành dạng gel hoàn toàn và trên 6 thì gel lại quá
cứng. pH của môi trường thường giảm từ 0.6 – 1.3 đơn vị sau khi hấp khử
trùng. Có một số trường hợp, sau một thời gian nuôi cấy, pH của môi trường
giảm dần do sự hình thành một số acid hữu cơ trong môi trường.
Điều chỉnh pH bằng cách dùng HCl hay NaOH 1N hoặc 0.1N và nhỏ từng
giọt vào trong môi trường, khuấy đều môi trường rồi mới đo. Luôn nhớ phải
điều chỉnh pH trước khi thêm agar.
2.1.9.2. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên sự sinh trưởng và
phát triển của thực vật
• Chất điều hòa sinh trưởng hoạt động với liều lượng rất thấp, ở liều cao chúng
trở nên độc, điều này cho phép một vài chất kích thích tố được sử dụng như
các chất diệt cỏ dại.
• Các chất điều hòa nội sinh có thể được kiểm soát do cơ chế chuyển hóa của tế
bào nên chúng được kiểm soát hoặc đào thải khá nhanh. Trái lại các chất điều
hòa tổng hợp tồn tại lâu hơn nhiều nên thường được sử dụng cho các ứng
dụng trong thực tế.
• Auxin
Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng rất thường
xuyên trong nuôi cấy mô – tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các
thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy để kích thích sự tăng
trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc

loại auxin thích hợp trong nuôi cấy chồi. IAA và IBA nhạy cảm với nhiệt độ
và bị phân hủy trong quá trình hấp tiệt trùng và IAA không ổn định trong môi
trường nuôi cấy cho dù nó được lọc qua màng lọc vô trùng. Nồng độ của IAA
có thể giảm đi 10 lần trong 4 tuần nuôi cấy ở trong tối nếu không được bổ
sung thêm, tốc độ phân hủy của auxin ở ngoài sáng xảy ra nhanh hơn đặc biệt
trong môi trường MS. IBA ổn định trong môi trường hơn là IAA, mức độ
giảm của IBA thấp. Còn NAA và 2,4 – D không bị biến tính trong môi trường
nuôi cấy. Ngoài ra, còn có một số auxin khác nhưng chúng rất ít được sử dụng
như: 2,4,5 – T, 4 – CPA, MPCA, NOA, Dicamba, Picloram.
Auxin can thiệp vào nhiều hiện tượng sinh lý, hoạt động của nó tùy thuộc
vào nồng độ và tác động bổ trợ của chúng với các chất điều hòa tăng trưởng
khác.
Auxin tác động lên sự kéo dài tế bào. Hiệu quả này là sự nối tiếp cho sự
gia tăng tính đàn hồi của thành tế bào và cho sự xâm nhập của nước vào bên
trong tế bào, sức căng của thành tế bào giảm đi và tế bào tự kéo dài ra.
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 20
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
Auxin thay đổi tính thẩm thấu của màng tế bào, sự thay đổi này thể hiện
bằng một sự phóng thích ion H
+
. Ion này gây ra một hoạt tính acid chịu trách
nhiệm làm giảm tính đề kháng của thành tế bào bởi sự hấp thu ion K
+
.
Auxin tác động lên các quá trình chuyển hóa, đặc biệt nhất là trên sự tổng
hợp ARN ribosome.
Auxin kích thích sự phân chia tế bào một cách đặc biệt trong quá trình
hình thành mô sẹo và sự hình thành rễ bất định. Auxin cũng ức chế sự phát
triển của chồi nách và sự hình thành phôi sinh dưỡng trong môi trường nuôi
cấy mô sẹo.

sẹo xảy ra khi không có sự hiện diện của cytokinin trong môi trường nuôi cấy
là do tế bào đã tự tổng hợp được cytokinin cho nó
Cytokinin rất có hiệu quả trong vai trò kích thích sự tạo chồi trực tiếp hoặc
gián tiếp trên thực vật nguyên vẹn cũng như trên mô thực vật nuôi cấy in
vitro. Tác dụng này của cytokinin đôi khi trở nên hiệu quả hơn khi phối hợp
với auxin. Một tỉ lệ thích hợp giữa auxin và cytokinin sẽ có hiệu quả trên sự
phát sinh hình thái của mẫu cấy.
Cytokinin cũng có khả năng kích thích sự tăng trưởng của chồi bên và làm
giảm hiện tượng ưu tính ngọn trong nuôi cấy chồi của những loài cây lá rộng,
người ta thường bổ sung một hoặc vài loại cytokinin vào môi trường nuôi cấy.
Nồng độ cytokinin quá cao sẽ kích thích sự hình thành của nhiều chồi nhỏ
nhưng những chồi này không thể kéo dài hoặc làm cho lá bị biến dạng hoặc
làm cho chồi chứa nhiều nước.
Để kích thích sự tạo chồi bất định trực tiếp từ mẫu cấy hoặc gián tiếp qua
sự tạo mô sẹo thì người ta thường phối hợp cytokinin với auxin.
Cytokinin có vai trò trong sự tạo cơ quan thực vật, chúng kích thích mạnh
mẽ sự thành lập chồi non, trái lại ở nồng độ cytokinin cao chúng thường cản
hoặc làm chậm sự tạo rễ. Đôi khi người ta cũng nhận thấy rằng cytokinin
cũng cảm ứng sự tạo rễ hoặc kích thích sự tăng trưởng của rễ hoặc kích thích
sự tạo thành rễ bất định khi không có sự hiện diện của auxin. Trong hầu hết
các trường hợp, chỉ có nồng độ cytokinin thấp là có hiệu quả.
Người ta thường bổ sung cytokinin với nồng độ thấp vào môi trường nuôi
cấy để cảm ứng sự tạo mô sẹo có khả năng sinh phôi đặc biệt là những cây lá
rộng. Tuy nhiên, cũng có vài bằng chứng cho rằng cytokinin lại cản sự sinh
phôi ở cây một lá mầm ví dụ như: cytokinin ngoại sinh 0.001 µM đủ để ngăn
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 22
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
cản sự sinh phôi ở Dactylis glomerata. Cytokinin nội sinh cũng có thể ngăn
cản sự tạo phôi ở một số loài thực vật.
Cytokinin kích thích quá trình chuyển hóa, bảo vệ các chất chuyển hóa

Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
• Khi được nuôi cấy in vitro, thường thì các tế bào thực vật không có khả năng
quang hợp và do đó nó đòi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon cho các hoạt động
biến dưỡng của tế bào.
• Trong nuôi cấy protoplast (nuôi cấy tế bào trần) thì lượng đường sử dụng
thường thấp, ngược lại trong nuôi cấy phôi và bao phấn thì dùng đường nhiều
hơn.
• Đường có thể bị caramel hóa nếu bị hấp khử trùng quá lâu và sẽ ức chế phản
ứng với các hợp chất amino. Sự caramel hóa xảy ra khi đường bị đun nóng,
thoái biến và hình thành melanoidin, một chất sẫm màu và có phân tử lượng
cao, ức chế sự phát triển của tế bào.
2.1.10. Các chất khử trùng hóa học được sử dụng trong nuôi cấy mô
• Có thể nói, khó khăn lớn nhất khi tiến hành nuôi cấy mô là phải tạo được thể
nhân giống in vitro vô trùng. Có nhiều nguyên nhân gây ra sự nhiễm trùng,
trong quá trình nuôi cấy có thể bị nhiễm vi sinh vật từ: mẫu cấy, người cấy, hệ
thống lọc khí trong tủ cấy, côn trùng, dụng cụ hay bản thân môi trường nuôi
cấy.
• Mẫu cấy, các mảnh mô thực vật, dùng để nuôi cấy thường là nguồn nhiễm
chính vì có rất nhiều vi sinh vật bám trên bề mặt, trong các rãnh nhỏ hoặc
giữa các lớp vảy chồi, mầm chồi. Đối với một số loài thực vật được bao phủ
bên ngoài bởi một lớp sáp dày hoặc có lông tơ thì càng khó khử trùng vì đây
là nơi cư ngụ của rất nhiều vi sinh vật. Ngoài ra, những cây đã bị nhiễm ngay
trong hệ thống mô mạch thì xem như không thể dùng phương pháp khử trùng
thông thường để loại bỏ vi sinh vật được.
• Để giải quyết những vấn đề này, đầu tiên người ta sử dụng các chất khử trùng.
Để tăng cường hiệu quả khử trùng của các chất khử trùng, người ta thường
rửa sơ mô cấy với xà phòng để loại bỏ bụi đất và gia tăng sự tiếp xúc với các
chất khử trùng, ngoài ra có thể dùng dung dịch Tween-20 như là chất hoạt
động bề mặt. Sau khi khử trùng phải rửa sạch mẫu cấy bằng nước cất vô trùng
3 – 5 lần.

2
là rất độc đối với mô thực vật, do đó
phải rửa thật sạch.
Khí Clo (Cl
2
): thường sử dụng nhiều trong khử trùng hạt khô.
Sodium dichloroisocyanurate (NADCC): chất này ít độc đối với mô thực
vật, không cần rửa lại mẫu cấy bằng nước cất vô trùng sau khi xử lý bằng chất
này.
Chất kháng sinh: Gentamicine và Ampicilline: những kháng sinh này có
tác dụng hỗ trợ thêm cho việc sử dụng ethanol và thuốc tẩy. Dung dịch kháng
sinh 50 – 100 mg/l được dùng để ngâm mẫu trong 30 phút trước khi nuôi cấy.
Sodium dichloroiso cyanurate (dichloroiso cyanuric acid sodium salt)
(NADCC): chất này ít độc đối với mô thực vật, vốn rất dễ tổn thương bởi
Ca(OCl)
2
và NaOCl, không cần rửa lại mẫu cấy bằng nước vô trùng sau khi
xử lý bằng chất này.
Iso thiazolone biocide (PPM): là một loại sản phẩm được chào bán của
viện Plant Cell Technology (Washington DC.) và được quảng cáo là :”… có
khả năng ngăn chặn sự tạp nhiễm vi sinh trong nuôi cấy mô thực vật”. Cũng
đã có những thử nghiệm và khẳng định công dụng diệt trùng của chất này
nhưng nếu sử dụng với nồng độ cao sẽ gây độc cho tế bào thực vật.
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 25