GI I TRÌNH T GENẢ Ự
Các phơng pháp giải trình tự gen

Có 2 phơng pháp chính:

Phơng pháp hoá học Maxam Gilbert: đây là
phơng pháp đợc sử dụng đầu tiên để xác định
trình tự gen nhng hiện nay không còn đựơc sử
dụng phổ biến nữa.

Phơng pháp Enzyme Sanger
1. Ph¬ng ph¸p ho¸ häc Maxam - Gilbert
Walter Gilbert
Nguyên lý

Sử dụng các chất hoá học cắt đứt sợi DNA tại 1 loại
nucleotide đặc hiệu

Phân tử DNA kép đợc đánh dấu P
32
tại đầu 5

Tách rời 2 sợi đơn bằng nhiệt

Xử lý hoá học sao cho chỉ có 1 loại nucleotide bị phá
huỷ -> hàng loạt đoạn DNA có kích thớc khác nhau
đợc tạo thành (sử dụng các chất hoá học khác nhau
phá huỷ 4 loại nucleotide bằng 4 phản ứng riêng
biệt)

Tiến hành điện di các đoạn DNA thu đựơc trên gel

3’
G
C
A
T
T
C
C
A
T
A
G
G
5’
MAXAM-GILBERT CHEMICAL
SEQUENCING
Labeled strand (P32)
C
C
Sequence is read directly
autoradiograph of
dried sequencing gel
Phá huỷ các nucleotide
Trong phơng pháp này sử dụng 5 phản ứng cơ bản:

Dimethylsulfate ở pH 8.0 sẽ làm thay đổi Guanine
(G).

Piperidine formate ở pH 2.0 sẽ phá vỡ cầu nối
glycoside giữa deoxyribose với purine (G,A)

Hydrazine
T+C
Piperidine
formate
pH 2
G+A
Dimethyl
sulfate pH
8
G
Hydrazine in
1.5 M NaCl
C
X
X
X
X
X
X
5’ to 3’
Nhîc ®iÓm

Ho¸ chÊt ®éc

CÇn mét lîng lín chÊt phãng x¹

ThiÕu sù tù ®éng

§«i khi kÕt qu¶ thu ®ù¬c trªn gel kh«ng chÝnh
x¸c

Base
dNTP ddNTP
O
(P)-(P)-(P)-
H
H
Base
If a ddNTP is added
to a growing DNA
chain, the sequence
is terminated,
because another
base can not be
added
OH
ống phản
ống phảnứng A
ứng A
ống phản
ống phảnứng C
ứng C
ống phản
ống phản


ddNTP Reaction Mix
SANGER DIDEOXY SEQUENCING
Phóng xạ tự ghi sợi AND đơn tổng
hợp trong mỗi ống phản ứng.
Đoạn ADN cần giải trình tự
Đoạn ADN cần giải trình tự
3 CCTATGGAATGC-
3 CCTATGGAATGC-
5
5


.
.
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*


Giảm giá thành phản ứng

Tăng tốc độ phản ứng
=> Nhiều trung tâm giải trình tự gen đã sử dụng
phơng pháp này và họ có thể đọc đợc
hàng triệu bp mỗi ngày.