TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN TRẦN THANH PHÚ
PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN
Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT
TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)
NUÔI Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG


TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)
NUÔI Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
Ts. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH

2009
LỜI CẢM TẠ
Tôi xin chân thành gửi lời biết ơn sâu sắc đến cô Đặng Thị Hoàng Oanh,
cô Nguyễn Thị Thu Hằng và chị Nguyễn Hà Giang đã tận tình hướng dẫn
giúp đỡ tôi thực hiện đề tài nghiên cứu này.

LỜI CẢM TẠ ii
MỤC LỤC iii
DANH SÁCH BẢNG iv
DANH SÁCH HÌNH v
PHẦN I GIỚI THIỆU 1
PHẦN II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2
2.1 Tình hình nuôi cá tra ở Việt Nam và Đồng Bằng Sông Cửu Long 2
2.1.1 Ở Việt Nam 2
2.1.2 Ở Đồng Bằng Sông Cửu Long 2
2.2 Tình hình bệnh cá tra ở Đồng Bằng Sông Cửu Long 4
2.3 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila 6
PHẦN III PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 8
3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 8
3.2 Vật liệu nghiên cứu 8
3.2.1
Đối tượng nghiên cứu 8
3.2.2 Dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu 8
3.3 Hóa chất 8
3.3.1 Các hóa chất và môi trường dùng để phân lập vi khuẩn 8
3.3.2 Các hóa chất và môi trường dùng để định danh vi khuẩn bằng phương
pháp sinh hóa truyền thống và bộ kít API 20E 9
3.4 Phương pháp nghiên cứu 9
3.4.1 Thu mẫu, bảo quản và vận chuyển 9
3.4.2 Phân lập vi khuẩn 9
3.4.3 Nuôi tăng sinh vi khuẩn 10
3.5 Phương pháp định danh vi khuẩn 10
3.5.1 Định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống 10
3.5.2 Đị
nh danh vi khuẩn bằng bộ kít API 20E 11
PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 14

Hình 4.8 Kết quả định danh bằng bộ kít API 20E.v
PHẦN I
GIỚI THIỆU
Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) là vùng đất giàu tiềm năng được thiên
nhiên ưu đãi có lợi thế rất lớn để phát triển nuôi trồng thủy sản. Trong những năm
gần đây nuôi trồng thủy sản ở ĐBSCL đã có những bước phát triển vượt bậc
mang lại hiệu quả kinh tế cao, đặc biệt cá tra đang là đối tượng nuôi chiến lược,
thu lại nguồn ngoại tệ rất lớn. Đến tháng 08 năm 2007, toàn vùng ĐBSCL có tổng
diện tích nuôi cá tra, ba sa trên 5.600 ha, so với năm 2000, diện tích này tăng trên
10 lần và dự báo sẽ tiếp tục tăng nhanh trong những năm tới (Chu Thạch, 2007).
Tính đến ngày 14/11/2008, tổng kim ngạch xuất khẩu thuỷ sản của cả nước đạt
mức 4 tỷ USD (VASEP, 2008).
Tuy nhiên do sự gia tăng quá mức của phong trào nuôi cá tra trong khi trình độ kỹ
thuật của ng
ười nuôi chủ yếu chỉ dựa vào kinh nghiệm. Mặt khác do phát triển tự
phát thiếu qui hoạch, mật độ thả nuôi cao và công tác quản lý dịch bệnh còn hạn
chế nên dịch bệnh thường xuyên xảy ra gây thiệt hại cho người nuôi. Theo Từ
Thanh Dung (2005) tần số xuất hiện bệnh trên động vật thủy sản do vi khuẩn
chiếm tới 50,9%. Theo điều tra của Nguyễn Thanh Phương và ctv (2007) thì số
nông hộ nuôi cá tra ghi nhận b
ệnh xuất huyết xuất hiện vào mùa lũ chiếm tới
88%. Theo Đỗ Thị Hòa và ctv (2004) thì Aeromonas là tác nhân gây bệnh xuất
huyết trên nhiều loài cá, trong các loài vi khuẩn thuộc giống Aeromonas thì A.
hydrophila được xem là loài gây bệnh cho cá nước ngọt quan trọng nhất (Lewis
and Plumb, 1979).
Đề tài “Phân lập và định danh vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây
bệnh xuất huyết trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi ở Đồng

trầm do giá cả không ổn định, chịu tác động của nhiều vụ kiện bán phá giá, yêu
cầu về kỹ thuật an toàn vệ sinh thực phẩm ngày một khắc khe. Đặc biệt các thị
trường lớn như Mỹ, Nhật, EU đòi hỏi rất nghiêm ngặt về chất lượng sản phẩ
m.
Sản phẩm cá tra thịt trắng có nhu cầu ngày càng cao là những thách thức đặt ra
cho các nhà doanh nghiệp chế biến xuất khẩu và người nuôi.
Theo Bộ Thủy Sản (2007) sản lượng nuôi trồng thủy sản tăng từ 720.000 tấn ở
năm 2000 lên đến 1.256.938 tấn năm 2004. Năm 2005, sản lượng nuôi trồng thủy
sản đạt 1.437.355 tấn và giá trị xuất khẩu khoảng 1.627,3 triệu USD. Năm 2006,
sản lượng nuôi trồng th
ủy sản của cả nước đạt 1.694.271 tấn, trong đó sản lượng
cá tra chiếm 825.000 tấn.
2.1.2 Tình hình nuôi cá tra ở Đồng Bằng Sông Cửu Long
Đồng Bằng Sông Cửu Long là nơi có tiềm năng nuôi cá tra rất lớn, đã có truyền
thống nuôi cá tra từ lâu đời, cùng với lợi thế về diện tích mặt nước, hàng năm
vùng không ngừng nâng cao về mặt sản lượng cá tra, basa xuất khẩu. Tính từ năm
2006, sản lượng cá tra nuôi
ở ĐBSCL đạt 800.000 tấn, xuất khẩu được 292.800
Trang 2
tấn, thu về kim ngạch xuất khẩu 773,64 triệu USD, chiếm 23,4% so với xuất khẩu
thủy sản của cả nước.
Chỉ trong 6 tháng đầu năm 2007, diện tích nuôi cá tra toàn vùng ĐBSCL đã lên
đến 3.642 ha, tăng 1.256 ha so với năm trước, sản lượng cá tra đạt 380.489 tấn, số
lượng cá tra xuất khẩu được 173.100 tấn, đạt kim ngạch xuất khẩu 462,4 triệu
USD, tăng 32% về lượng và 38,9% kim ngạch so với năm 2006 (Quang Hải,
2008).
Theo số liệu đến tháng 08 năm 2007, toàn vùng ĐBSCL có tổng diện tích nuôi cá
tra, ba sa trên 5.600 ha. So với năm 2000, diện tích này đã tăng trên 10 lần và dự
báo sẽ tiếp tục tăng nhanh trong những năm tới (Chu Thạch, 2007).
An Giang là tỉnh có nghề nuôi cá tra phát triển nhất ở ĐBSCL, chiếm 90% tổng

Triển Nông Thôn, đến hết năm 2008 sản lượng cá tra công nghiệp ước tính đạt
khoảng 122.000 tấn (Mỹ Trung, 2008).
2.2 Tình hình bệnh trên cá tra ở ĐBSCL
Cá tra, basa cũng như nhiều loài cá nước ngọt khác, dễ bị nhiễm nhiều loại bệnh
phổ bi
ến, các tác nhân gây bệnh cho cá gồm 2 nhóm là các bệnh truyền nhiễm (do
virus, vi khuẩn và ký sinh trùng) và tác nhân không truyền nhiễm do môi trường,
dinh dưỡng. Theo Từ Thanh Dung (2005) thì tần số xuất hiện bệnh vi khuẩn trên
động vật thủy sản là cao nhất với 50,9%. Cũng theo điều tra của Lê Phú Khởi
(2006) tại An Giang đã ghi nhận được một số bệnh xuất hiện trên cá tra với tần
suất khác nhau từ năm 2004 trở lại đây là: bệnh đốm
đỏ, mủ gan, ký sinh trùng,
thối đuôi, vàng da, đường ruột, nổ mắt, tuột nhớt, rong bè (bỏ ăn), sưng thận,
nấm, thối mang. Trong đó bệnh mủ gan xảy ra với tần suất cao nhất.
Vi khuẩn E.ictaluri được Hawke (1979) phân lập đầu tiên trên cá Nheo nuôi tại
châu Mỹ (Ictalurus punctatus) và được xác định là nguyên nhân gây bệnh ESC
(Enteric septicaemia of catfish). Còn ở Việt Nam E.ictaluri gây bệnh trên cá tra
được gọi bệnh mủ gan. Bệnh được ghi nhận đầu tiên ở
ĐBSCL vào cuối năm
1998 trên cá tra nuôi bè với dấu hiệu bệnh có nhiều nốt trắng trên gan (Ferguson
và ctv, 2001).
Theo Từ Thanh Dung và ctv (2004) vùng ĐBSCL bệnh mủ gan xuất hiện đầu tiên
ở các tỉnh nuôi cá tra thâm canh phát triển mạnh như An Giang, Đồng Tháp và
Cần Thơ, sau đó bệnh lây lan sang các vùng lân cận. Đặc biệt những năm gần đây
bệnh cũng xuất hiện ở một số tỉnh mới phát triển nuôi cá tra như Trà Vinh, Bến
Tre và Sóc Trăng. Cá bị bệnh mủ gan không có dấu hiệu bất thường bên ngoài. Ở
giai đoạn mới chớm bệnh cá vẫn còn bắt mồi. Tuy nhiên ở giai đoạn này nếu
không phát hiện sớm và môi trường nuôi quá bẩn thì bệnh cá sẽ trở nên trầm
trọng hơn và rất khó khăn trong điều trị. Khi bị bệnh nặng hơn, cá có biểu hiện
gầy, bơi lờ đờ, da nhợt nhạt, có hi

theo những dấu hiệu khác như trương bụng hay lỡ loét ở gốc vi đuôi và vi hậu
môn (Phan Văn Ninh và ctv, 1993). Bệnh xuất huyết gây tổn thất cho người nuôi
về sản lượng và chất lượng sản phẩm khi xuất bán. Trường hợp cấp tính có thể
gây tử vong cao đến 80 - 90% những trường hợp mãn tính thịt cá có nhiều điểm
xuất huyết màu đỏ và sẽ bị loại bỏ hay hạ
phẩm cấp trong quá trình chế biến xuất
khẩu (Hứa Thị Phượng Liên, 1998).
Bệnh vàng da trên cá tra là một bệnh mới xuất hiện gần đây cũng gây thiệt hại lớn
cho ngành thủy sản. Tác nhân gây ra bệnh thì chưa được xác định rõ ràng. Phan
Thị Hừng (2004) cho biết cá tra vàng da lượng hồng cầu của máu cá chỉ còn 50%
so với cá khỏe. Phạm Thanh Hương (2006) cũng có kết luận tương tự khi đưa ra
tỷ lệ gi
ảm hồng cầu của cá tra vàng da là 20%. Đồng thời, Lê Thành Cường
(2006) cũng nhận xét trên cá tra bị vàng da thì lượng máu cá không có nhiều và
máu không có màu đỏ như cá khỏe, quan sát mẫu nhuộm máu thấy hồng cầu bị
biến dạng nhiều. Ngoài ra, một tác nhân khác cũng được đề cập đến là kí sinh
trùng, đặc biệt là giun tròn với đặc tính thích chui vào ống mật làm viêm nhiễm
đường mật, tắc ống mật gây vàng da. Tuy nhiên, tác giả Lê Thành Cường (2006)
Trang 5
thì cho rằng kí sinh trùng không phải là tác nhân gây bệnh vàng da ở cá tra tại
ĐBSCL.
2.3 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila
Vi khuẩn Aeromonas thuộc họ Aeromonadaceae, Aeromonas là vi khuẩn Gram
âm, di động, hình que, hiếu khí và yếm khí không bắt buộc, khử nitrate, có khả
năng lên men, oxidase dương tính, kháng với O/129 bao gồm A. hydrophila,
A.caviae, A.sorbia… (Từ Thanh Dung, 2005).
Bệnh xuất huyết còn gọi là bệnh đốm đỏ, bệnh nhiễm trùng máu hay bệnh
sởi…Nguyên nhân của bệnh là do vi khuẩn A. hydrophila gây ra (theo Bergey
1957, trích dẫn bởi Từ Thanh Dung, 2005).
Trong các loài vi khuẩ

C, khoảng nhiệt độ này cũng được cho là khoảng nhiệt
độ thích hợp cho vi khuẩn này phát triển (Esteve et al., 1993). Bên cạnh đó,
Groberg khi gây cảm nhiễm A. hydrophila trên cá hồi đã kết luận tỉ lệ chết thường
cao ở 20,5
o
C và 17
o
C, tỉ lệ chết thấp hơn ở 15
o
C và 12
o
C, ở 9
o
C hay thấp hơn nữa
thì cá chết rất ít hoặc không thấy cá chết (trích dẫn bởi Roselynn and Stevenson,
1988).
Trong báo cáo của Rahman et al., (2000) ông cho rằng vi khuẩn A. hydrophila có
độc lực cao nhất khi t
o
= 17
o
C (LD
50
=106.03 CFU/ml) và 25
o
C (LD
50
=106.53
CFU/ml) đối với thí nghiệm gây cảm nhiễm trên cá vàng (Carassius auratus).
Bên cạnh đó, Azad et al., (2001) gây cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila trên cá rô

).
Trang 7
PHẦN III
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu
- Thu mẫu cá tra từ các ao nuôi thâm canh ở Vĩnh Long, Đồng Tháp và Cần
Thơ.
- Phân tích mẫu tại các phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy sản
- Khoa Thủy Sản - Trường Đại Học Cần Thơ.
Thời gian nghiên cứu: từ tháng 12 năm 2008 đến tháng 05 năm 2009.
3.2 Vật liệu nghiên cứu
3.2.1 Ðối tượng nghiên cứu
- Cá tra có dấu hiệu xuất huyết được thu mẫu trong ao nuôi thâm canh ở Vĩnh
Long, Đồng Tháp và Cần Thơ.
3.2.2 Dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu
- Que cấy, bình xịt cồn, đèn cồn, bộ tiểu phẩu, khay nhựa.
- Pipet, ống nghiệm, ống đong.
- Lame, lamella, đĩa petri, giấy nhôm.
- Kính hiển vi, giấy lau kính hiển vi.
- Chai nấu môi trường, cá từ, bình tam giác, c
ốc thủy tinh.
- Đầu cole, ống hút, găng tay.
- Tủ sấy, tủ cấy, tủ ấm, tủ lạnh.
- Bếp nấu môi trường, nồi thanh trùng.
- Cân điện tử, lò viba, máy lắc.
- Các vật liệu khác …
3.3 Hóa chất
3.3.1 Các hóa chất và môi trường dùng để phân lập vi khuẩn
- Cồn 70

- Mẫu cá dùng để lấy mẫu vi khuẩn phải còn sống.
- Trước khi giải phẩu đặt cá trên khay sạch. Quan sát cá bằng mắt thường, ghi
nhận tất cả các biểu hiện bên ngoài: vết thương, điểm xuất huyết, mùi và các
triệu chứng c
ủa bệnh.
- Cá được tiệt trùng bên ngoài bằng cồn 70
o
và lau sạch. Sau đó, dùng dao kéo
đã tiệt trùng để mổ cá. Khi mổ tránh làm vỡ các cơ quan nội tạng.
- Hơ que cấy vi sinh trên ngọn đèn cồn cho đến khi nóng đỏ và để nguội.
- Quan sát và ghi nhận các dấu hiệu bên trong.
- Lấy mẫu vi sinh ở 3 cơ quan gan, thận, tỳ tạng cấy trên môi trường NA.
- Ủ đĩa trong tủ ấm 28
o
C sau 18 - 24 giờ. Ghi nhận màu sắc hình dạng khuẩn
lạc, tiến hành tách ròng cho đến khi đạt đĩa cấy thuần.
Các thao tác trên được thực hiện trong điều kiện vô trùng.
Trang 9
3.4.3 Nuôi tăng sinh vi khuẩn
- Trước khi nuôi tăng sinh các chỉ tiêu cơ bản gồm nhuộm Gram, tính di động,
oxidase, catalase và phản ứng O/F phải được kiểm tra.
- Sau đó chọn một khuẩn lạc từ đĩa cấy thuần cho vào ống nghiệm 5ml NB đã
tiệt trùng đặt trên máy lắc (200 vòng/phút) sau 18 - 24 giờ đọc kết quả.
3.5 Phương pháp định danh vi khuẩn
3.5.1 Định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống
Các chỉ tiêu sinh hóa
được xác định theo phương pháp của Barrow và Feltham
(1993). Cách tiến hành, thành phần môi trường và cách pha chế được trình bày ở
phụ lục 1. Các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn được xác định
bằng phương pháp sinh hóa truyền thống được trình bày ở bảng 3.1.

27 Mọc trên thạch TCBS
28 Kháng với O/129
Sử dụng
29 Arabinose
30 Cellobiose
31 Galactose
32 Glycerol
33 Lactose
34 Mannitol
35 Trehalose
36 Sucrose
37 Glucose
38 Salicin
39 Xylose

3.5.2 Định danh vi khuẩn bằng bộ kít API 20E
- Định danh theo hướng dẫn của nhà sản xuất (BioMerieux).
- Các chỉ tiêu định danh bằng bộ kít API 20E được trình bày ở bảng 3.2.
- Các chỉ tiêu nhuộm Gram, di động, oxidase, catalase và phản ứng O/F của vi
khuẩn được kiểm tra trước khi định danh bằng kít API 20E.
Phương pháp thực hiện
- Dùng que tiệt trùng lấy một ít khuẩn lạc cho vào 5ml nước muối sinh lý
hoặc nước cất tiệ
t trùng, lắc trộn đều.
- Cho một ít nước vào khay nhựa của bộ kít để giữ ẩm khi ủ trong tủ ấm.
- Dùng pipet với đầu cole tiệt trùng hút dung dịch vi khuẩn cho vào mỗi ô của
bộ kít. Nhỏ dung dịch vi khuẩn vừa đủ vào tất cả các ô ngoại trừ 3 ô CIT,
VP, GEL thì nhỏ đầy, 5 ô ADH, LDC, ODC, H
2
S và URE cho thêm parafin

g

Ghi chú:
- ONPG: ortho - nitrophenyl galactosidase - GEL: gelatin
- ADH: arginine dihydrolase - GLU: glucose
- LDC: lysine decarboxylase - MAN: mannitol
- ODC: ornithine decarboxylase - INO: inositol
- CIT: citrate - SOR: sorbitol
- H
2
S: sinh H
2
S - RHA: rhamnose
- URE: urea - SAC: sucrose
- TDA: tryptophane deaminase - MEL: melibiose
- IND: indole - AMY: amygdaline
- VP: phản ứng Voges - Proskauer - ARA: arabinnose
Đọc kết quả: sau 18 - 24h.
- Kiểm tra và ghi nhận tất cả các chỉ tiêu không cần cho thêm thuốc thử đọc kết
quả dựa vào bảng bên trên.
- Các chỉ tiêu cần sử dụng thuốc thử.
Trang 12
9 TDA: Nhỏ một giọt thuốc thử TDA. Một màu đen xuất hiện thì kết quả
phản ứng là dương tính (+), màu vàng thì kết quả phản ứng âm tính (-).
9 IND: Nhỏ một giọt thuốc thử IND. Đợi 2 phút. Một vòng màu đỏ xuất hiện
là phản ứng dương tính (+), màu vàng là phản ứng âm tính (-).
9 VP: Thêm một giọt lần lượt mỗi dung dịch thuốc thử VP
1
,VP
2

3 Cần Thơ 3 3 20
Tổng cộng 17 5 28

Cá bị bệnh xuất huyết có dấu hiệu thường gặp nhất là xuất huyết ở gốc các vi, da,
nắp mang, miệng hay xuất huyết quanh mắt và phù mắt. Cá bệnh nặng có thể có
nhiều vết loét trên cơ thể. Bên trong cá có thể bị xuất huyết ở thành bụng, nội
quan, mở và cơ (Hình 4.1). Xoang bụng thỉnh thoảng chứa nhiều chất dịch có mùi
hôi.
Kết quả phân tích vi sinh ở 5 ao cá bị bệnh xuất huyết đã phân lập được
tổng số 28 chủng vi khuẩn Aeromonas (Đồng Tháp: 4 chủng; Vĩnh Long: 4
chủng; Cần Thơ: 20 chủng). Dựa vào dấu hiệu bệnh lý của cá lúc phân tích và
hình thái khuẩn lạc đã chọn ra 8 chủng vi khuẩn đại diện (Đồng Tháp: 2 chủng;
Vĩnh Long: 2 chủng; Cần Thơ: 4 chủng) (Bảng phụ lục 3) để tiến hành định danh
bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và bằng bộ kít API 20E. Kết quả định
danh bằng 2 phương pháp cả 8 chủng vi khuẩn đều là A. hydrophila (Bảng 4.2 và
Bảng 4.3).
Trang 14 Hình 4.1 Cá bị xuất huyết

4.1.2 Định danh vi khuẩn phân lập bằng phương pháp sinh hóa truyền thống
Trong số 28 chủng vi khuẩn phân lập được dựa vào dấu hiệu bệnh lý của cá bệnh
và một số thông tin lúc thu mẫu cũng như trong quá trình phân lập chọn ra 8
chủng vi khuẩn, trong đó có 2 chủng ở Đồng Tháp (SĐ2.1T, SĐ2.2T), 2 chủng ở
Vĩnh Long (CA1.2T, CA1.3TT) và 4 chủng ở Cần Thơ (TN1.1T, TN2.4TT,
TN2.1G, CS2.3T) để tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa.

Mọc trên môi trường Aeromonas + + + + + + + + +
Sinh gas từ glucose + + + + + + + + +
Thuỷ phân aesculine + - + + + + - + +
Sinh ureaza - - - - - - - - -
Sử dụng citrate + + + + + + + + +
Sinh amylaza + + + + + + + + +
Sinh indole + - - - + - + - +
Phản ứng VP + - - - - - - - -
Thuỷ phân Tween 80 + - - - - - - - -
Tạo nitrit từ nitrat + + + + + + + + +
Mọc ở 0% NaCl + + + + + + + + +
Mọc ở 3% NaCl + + + + + + + + +
Mọc ở 6% NaCl + - - - - - - - -
Mọc ở 7% NaCl - - - - - - - - -
Mọc ở 10% NaCl - - - - - - - - -
Mọc trên thạch TCBS - - - - - - - - -
Kháng với O/129 - - - - - - - - -
Sử dụng

Arabinose + - - - - - - - -
Cellobiose - - - - - - - - -
Galactose + + + + + + + + +
Glycerol + + + + + + + + +
Lactose - + + + + + + + +
Mannitol + + + + + + + + +
Trehalose + + + + + + + + +
Sucrose + + + + + + + + +
Glucose + + + + + + + + +
Salicin + + + + + + + + +
Xylose - - - - - - - - -


Trang 18