TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN
TRƯƠNG THỊ MỸ DUYÊN
NGHIÊN CỨU KIỂU PLASMID VÀ TÍNH KHÁNG THUỐC
CỦA VI KHUẨN Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH XUẤT
HUYẾT TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN
HUYẾT TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
Ths. NGUYỄN THỊ THU HẰNG 2009
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
i
LỜI CẢM TẠ
Để hoàn thành tốt một Luận văn tốt nghiệp thì mỗi một sinh viên đều phải trãi
qua những khó khăn và vất vả. Tuy nhiên, những khó khăn đó không gây trở ngại
tối thiểu (MIC) của kháng sinh trên vi khuẩn A. hydrophila. Qua đó cho thấy, đa
phần các chủng cho kết quả mẫm cảm với streptomycin với giá trị MIC dao động
từ 4-16ppm. Chỉ duy nhất 1 chủng kháng với streptomycin ở nồng độ 256ppm.
Bên cạnh đó, để tìm hiểu với những kết quả kháng thuốc trên của A. hydrophila
thì chúng có kiểu plasmid như thế nào. Đề tài đã tiến hành ly trích và diện di
plasmid của 8 chủng A. hydrophila. Kết quả chỉ phát hiện được plasmid của 2
chủng: CA1.2T và CA1.3TT. Chúng có kiểu plasmid khác nhau, biểu hiện hai
vạch không tương đồng nhau.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
iii
MỤC LỤC
LỜI CẢM TẠ i
TÓM TẮT ii
MỤC LỤC iii
DANH SÁCH BẢNG VÀ HÌNH V
CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1
1.1 Giới thiệu 1
1.2 Mục tiêu đề tài 2
1.3 Nội dung đề tài 2
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Sơ lược tình hình dịch bệnh trên cá tra ở Đồng Bằng Sông Cửu Long 3
2.2 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila (A. hydrophila) 5
2.3 Tình hình sử dụng thuốc và hóa chất trong nuôi trồng thủy sản ở ĐBSCL .
6
2.4 Hình thành hệ vi khuẩn kháng thuốc 8
2.5 Thuốc, hóa chất dùng trong nuôi trồng thủy sản 9
2.5.1 Khái niệm thuốc, hóa chất dùng trong nuôi trồng thủy sản 9
2.5.2 Khái niệm kháng sinh 9
PHỤ LỤC 38
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
v
DANH SÁCH BẢNG VÀ HÌNH
Bảng 3.1: Các kháng sinh dùng trong nghiên cứu kháng sinh đồ 18
Bảng 3.2: Nuôi vi khuẩn ở các hàm lượng thuốc khác nhau (cho một chủng) 20
Bảng 4.1: Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ 23
Hình 4.1: Vi khuẩn Aeromonas hydrophila trên môi trường NA 22
Hình 4.2: Kết quả nhuộm Gram vi khuẩn Aeromonas hydrophila 22
Hình 4.3: Kết quả kháng sinh đồ trên vi khuẩn Aeromonas hydrophila 23
Hình 4.4: Kết quả MIC của streptomycin với vi khuẩn Aeromonas hydrophila
27
Hình 4.5: Kết quả MIC ở nồng độ 256ppm (mũi tên) 28
Hình 4.6: Kết quả điện di trên 8 chủng Aeromonas hydrophila 29
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
1
CHƯƠNG 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1 Giới thiệu
Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là một trong các loài cá da trơn có kích
thước lớn nhất trong họ Pangasiidae phân bố ở hạ lưu sông Mê Kông. Vùng Đồng
Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) có truyền thống nuôi cá tra ở quy mô nông hộ từ
lâu đời. Những thành công trong sản xuất giống nhân tạo vào những năm 1990 đã
thúc đẩy sự phát triển mạnh mẽ nghề nuôi cá tra, trở thành nghề công nghiệp ở
nhiều nơi như An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Vĩnh Long v.v… (Dương Nhựt
Long, 2003).
thành plasmid kháng kháng sinh ở vi khuẩn gây bệnh trên động vật thuỷ sản ở
ĐBSCL còn cần nhiều nghiên cứu để góp phần tìm hiểu rõ hơn những plasmid
kháng thuốc ở vi khuẩn.
Từ những vấn đề trên đề tài “Nghiên cứu kiểu plasmid và tính kháng thuốc
của vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra
(Pangasianodon hypophthalmus)” được thực hiện.
1.2 Mục tiêu đề tài
Nhằm tìm hiểu kiểu plasmid và tính kháng thuốc của vi khuẩn Aeromonas
hydrophila
1.3 Nội dung đề tài
− Lập kháng sinh đồ và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của vi khuẩn
Aeromonas hydrophila.
− Xác định kiểu plasmid của vi khuẩn Aeromonas hydrophila.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
3
CHƯƠNG 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Sơ lược tình hình dịch bệnh trên cá tra ở Đồng Bằng sông Cửu Long
Cá tra là loài có khả năng sống tốt trong điều kiện ao tù nước đọng, nhiều chất
hữu cơ, mật độ nuôi cao và oxy hòa tan thấp (Dương Nhựt Long, 2003). Tuy
nhiên, chúng vẫn bị một số bệnh do vi khuẩn, nấm và ký sinh trùng… Sự hiện
diện của những bệnh này đã làm giảm năng xuất và sản lượng cá nuôi rất lớn, gây
nhiều thiệt hại cho người nuôi cá tra thâm canh ở ĐBSCL.
Những năm 1999-2000, 2002-2003 cá tra bị bệnh, chết nhiều với các biểu hiện:
xuất huyết ở miệng và hầu, nổ mắt, thận sưng và có những đốm trắng (Nguyễn
Chung, 2008). Đặc biệt vào đầu năm 2006 trên sông Tiền và sông Hậu xảy ra
hiện tượng cá tra chết hàng loạt, với đa số có biểu hiện xuất huyết và gan thận có
nhiều đốn trắng (Hà Văn và Bình Nguyên, 2006). Trước đây, bệnh do vi khuẩn
vào năm 2007 ở các tỉnh ĐBSCL: Gan thận mủ 52,80%, xuất huyết 42,50%, phù
đầu, phù mắt 20,70% và vàng da 21,60% (Trích dẫn bởi Nguyễn Trọng Bình,
2008).
Từ kết quả điều tra của Huỳnh Văn Quang (2008), cũng cho thấy có hai loại bệnh
thường xuyên xuất hiện và gây thiệt hại nghiêm trọng trong quá trình nuôi của
các hộ nuôi cá tra là bệnh gan thận mủ và xuất huyết. Theo thống kê cho thấy, hai
loại bệnh này xuất hiện hầu như quanh năm. Mức độ thiệt hại của bệnh gan thận
mủ thường cao hơn bệnh xuất huyết, bình quân mức thiệt hại của gan thận mủ là
33,4% tuyến sông Tiền và 43,9% tuyến sông Hậu; trong khi đó, mức thiệt hại
bình quân của bệnh xuất huyết là 8% tuyến sông Tiền và 25,1% tuyến sông Hậu
(Sở Nông nghiệp Vĩnh Long, 2008).
Bên cạnh đó từ kết quả khảo sát của Trần Kiều Lan Phương (2008), cho thấy dịch
bệnh trên cá tra ở Cần Thơ cũng bao gồm: xuất huyết chiếm 35,2%, chiếm tỉ lệ
cao nhất là gan thận mủ 94,4%, và các bệnh như trắng gan trắng mang, đốm đỏ,
vàng da chiếm tỉ lệ thấp khoảng trên 20%. Ngoài ra thì cá tra còn bị ảnh hưởng
bởi bệnh ký sinh trùng chiếm 11,3% và bệnh đỏ mỏ đỏ kỳ và bệnh phù đầu chiếm
không quá 7%.
Hầu như các tỉnh nuôi cá tra ở ĐBSCL đều phải đương đầu với bệnh xuất huyết,
gan thận mủ, vàng da, ký sinh trùng… Nhưng bệnh trên cá tra thường xuất hiện
nhiều ở những vùng có diện tích nuôi cá tra lớn như An Giang, huyện Thốt Nốt,
Phụng Hiệp của tỉnh Cần Thơ… (Từ Thanh Dung và ctv, 2004). Tổng diện tích
nuôi cá tra ở ĐBSCL là rất lớn, thêm vào đó thì con cá tra là loài rất dễ nuôi lại
mau lớn. Cho nên, những người dân không cần trình độ chuyên môn vẫn có thể
nuôi tốt loài cá này. Trước đây nuôi cá tra đa phần là nuôi tự phát, không có quy
hoạch và phần lớn thì cũng chỉ dựa vào kinh nghiệm. Vì vậy việc quản lý tốt môi
trường nuôi cũng như khống chế dịch bệnh thì cũng là một chuyện khó khăn. Bên
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
5
cạnh đó, đa phần người nông dân nuôi cá cũng không có nhận thức tốt về sự ô
nhiễm của nước thải từ ao nuôi khi cho thải trực tiếp ra môi trường ngoài, trong
S, cho phản ứng dương tính
với MR-VP, lysine, arginine, và ornithine. Đặc biệt chúng có khả năng phát triển
được ở nồng độ muối 6%, nên đã thể hiện được đặc tính phân bố rộng muối
(Nguyễn Thị Thu Hằng, 2005).
B. Austin và D. Austin (1986), cho rằng A. hydrophila là nguyên nhân của một
vài tình trạng bệnh khác nhau như thối vây, bệnh đốm đỏ và thường liên kết với
mầm bệnh khác như A. salmonisida. Bệnh đốm đỏ là biểu hiện sự có mặt của
những vết thương trên da, đặc biệt xuất huyết ở mang và hậu môn, loét, ung mủ,
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
6
lồi mắt, phình bụng. Bên trong xoang bụng tích tụ dịch loãng, gây thiếu máu và
tổn thương các cơ quan như gan, thận.
Đặc điểm bệnh do Aeromonas gây ra là làm cho động vật mắc bệnh xuất huyết,
hình thành các vết đỏ trên cơ thể, lở loét ở da và các vết loét này ngày càng lan
rộng ra trên bề mặt da, các cơ quan hoặc ăn sâu vào bên trong cấu trúc mô. Tùy
vào đối tượng nuôi, nhóm vi khuẩn gây bệnh và giai đoạn bệnh mà có những biểu
hiện bệnh lý khác nhau (Inglis et al., 1993).
Nhóm gây bệnh thường gặp là A. hydrophila, A. sobria và A. caviae, được phát
hiện đầu tiên trên cá chình trong báo cáo dịch bùng phát bệnh của Sanarelli
(1891). Kế đến trong các nghiên cứu sau này trên cá chép của Schaperclaus
(1930), phân lập được vi khuẩn A. hydrophila và cho đây là tác nhân gây bệnh
cho cá (Trích dẫn bởi Inglis et al., 1993).
Ngoài ra, A. hydrophila còn là tác nhân thứ cấp gây bệnh tuột nhớt trên cá bống
tượng và gây chết cao vào mùa nước đổ ở ĐBSCL (Nguyễn Thị Như Ngọc,
1997). Đến năm 1998, Phạm Hoàng Sanh đã phân lập được 3 giống vi khuẩn trên
cá bệnh xuất huyết là Streptococcus, Aeromonas, Pseudomonas. Đây cũng là
bệnh gây thiệt hại nhiều ở cá bè nuôi thịt, bệnh xuất hiện vào mùa khô (tháng 11
đến tháng 4 dương lịch) và rất thường xảy ra đối với cá nuôi bè, chiếm 33% trong
64,84% số bè bị bệnh, làm giảm đáng kể sản lượng cá basa (Nguyễn Minh Nhí,
2007). Bên cạnh đó thì Aeromonas sp còn được phân lập cả trên tôm càng xanh
trong danh mục hạn chế sử dụng, nhiều loại ở dạng nguyên liệu và nguồn gốc
không rõ ràng, riêng chất Malachite Green là chất nằm trong danh mục Bộ Thủy
sản cấm sử dụng nhưng vẫn được người nuôi sử dụng trong nuôi cá ở đây (Phạm
Thanh Tuấn, 2004).
Ngoài ra, từ kết quả khảo sát của Nguyễn Chính (2005) ở An Giang và Cần Thơ,
cho thấy có 394 loại thuốc, hóa chất do 75 nhà sản xuất đang được kinh doanh
trong khu vực. Trong đó có 16% sản phẩm kháng sinh phối trộn từ 3 kháng sinh
trở lên, vi phạm qui định về phối trộn kháng sinh: theo quyết định 07/2005 của
Bộ Thủy sản. Thuốc, hóa chất nguyên liệu được bán lẻ công khai mà không cần
toa nhãn cho người sử dụng. Đối với nhóm kháng sinh, các nhà sản xuất đưa ra
những khuyến cáo chưa tuân thủ đúng qui định cũng như thời gian ngưng sử dụng
trước khi thu hoạch.
Qua khảo sát của Châu Hồng Thúy, (2008) có 100% người nuôi xác nhận có sử
dụng kháng sinh, hóa chất để phòng trị bệnh cho cá nuôi. Trong đó các loại kháng
sinh thuộc nhóm Quinolone được sử dụng nhiều nhất, kế đến là các chất thuộc
nhóm Aminoside. Nhóm Lactam có Amoxicillin và Ampicillin cũng được sử
dụng rộng rãi. Nhóm Tetracyclin có Oxytetracyclin cũng được sử dụng nhưng
không nhiều lắm còn các nhóm kháng sinh còn lại có mặt nhiều trên thị trường
nhưng người nuôi cho là không quen nên rất ít sử dụng. Và các kháng sinh
florfenicol, doxycycline, norfloxacin, enrofloxacin được hầu hết cá hộ nuôi cá
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
8
được khảo sát ở Trà Vinh sử dụng. Bên cạnh đó, khảo sát của Nguyễn Chính
(2005) cũng cho thấy kháng sinh ở hầu hết các nhóm đều được người nuôi cá sử
dụng. Trong đó, các kháng sinh thuộc nhóm quinolones là được sử dụng với tần
suất cao.
Riêng nhóm Sulfonamide và Colistin thường được sản xuất như là một dạng
kháng sinh kết hợp nên có mặt trong nhiều sản phẩm thuốc điều trị bệnh và
đương nhiên cũng được sử dụng với tỷ lệ cao. Về liều lượng sử dụng, qua tìm
hiểu thì để chắc ăn, thực tế liều lượng sử dụng để điều trị bệnh là cao hơn liều
thể tự đột biến và kháng được nhiều thuốc, có thể thừa hưởng về đặc điểm di
truyền, cấu trúc hoặc trạng thái sinh lý mà cho chúng sự thuận lợi để đề kháng
thuốc… (Claudia Harper, 2002. Trích dẫn bởi Nguyễn Chính, 2005).
Vài nhóm nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy các điều kiện trung bình cho việc
phát triển vi khuẩn kháng thuốc ở nuôi trồng thủy sản là nước, bùn đáy và cả cá
nuôi (Schmidt, 2000; Sorum, 1998), bùn đáy ở rần một số trại nuôi có sử dụng
nhiều kháng sinh thường chứa nhiều vi khuẩn kháng thuốc hơn những trại chung
quanh ít hoặc không sử dụng thuốc kháng sinh, mà những vi khuẩn này phần lớn
kháng một hoặc nhiều thuốc (Schmidt et al., 2000; Gonzalez et al., 1999; Herwig
et al., 1997). Tuy nhiên (theo Herwig et al., 1997) nếu điều kiện nuôi trồng thủy
sản tốt, sử dụng kháng sinh một cách hợp lý thì ít khi gặp phải vi khuẩn kháng
thuốc (Trích dẫn bởi Nguyễn Chính, 2005).
2.5 Thuốc, hóa chất dùng trong nuôi trồng thủy sản
2.5.1 Khái niệm thuốc, hóa chất dùng trong nuôi trồng thủy sản
Theo Bộ Thủy Sản (2002), thuốc là chế phẩm có nguồn gốc động vật, thực vật,
khoáng chất, hóa chất, vắc-xin và các chế phẩm sinh học khác dùng để phòng và
trị bệnh; điều chỉnh sinh trưởng, phát triển và sinh sản của thủy sản; xử lý và cải
tạo môi trường nuôi. Và hóa chất là sản phẩm hóa học dùng để xử lý, cải tạo môi
trường, phòng và trị bệnh cho thuỷ sản nuôi trồng (Lê Thị Kim Liên và ctv, 2007).
2.5.2 Khái niệm kháng sinh
Kháng sinh là các chất hữu cơ có cấu tạo hóa học phức tạp, có nguồn gốc sinh học
(do xạ khuẩn, vi khuẩn và nấm sản sinh ra) hay do con người tổng hợp nên, có tác
động một cách chuyên biệt trên một giai đoạn chính yếu của sự biến dưỡng của
các vi khuẩn (tác nhân kháng khuẩn), của các nấm (tác nhân kháng nấm), của các
siêu vi (tác nhân kháng virus) (Lê Thị Kim Liên, 2007).
2.5.3 Các loại kháng sinh thường dùng trong nuôi trồng thủy sản
Nhóm ß-lactamin
Là nhóm kháng sinh có phổ kháng khuẩn hẹp chủ yếu có tác dụng trên vi khuẩn
Gram dương và một số ít vi khuẩn Gram âm, là kháng sinh diệt khuẩn tác dụng ức
chế tổng hợp thành tế bào vi khuẩn. Nhưng theo Nguyễn Khang (2005) thì ngoài
dùng phổ biến trong nuôi thủy sản nước lợ, mặn, tetracycline và doxycyclin dùng
trong nuôi thủy sản nước ngọt. Các kháng sinh này thường dùng để trị bệnh đường
ruột, bệnh nhiễm khuẩn máu, xuất huyết của các loài cá nước ngọt: cá tra, basa,
trắm cỏ. Theo Lê Thị Kim Liên và Nguyễn Thị Như Ngọc (2006), các kháng sinh
này dùng để điều trị đỏ mỏ, đỏ kỳ, trắng da, lở loét, chướng hơi ngửa bụng trên cá,
trầy da của ếch, bệnh phồng cổ của baba (Huỳnh Chí Thanh, 2007).
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
11
Nhóm Aminosid
Là kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng đối với hầu hết vi khuẩn Gram âm và một
số vi khuẩn Gram dương hiếu khí, ít tác dụng đối với vi khuẩn kỵ khí vì aminosid
thấm qua màng tế bào vi khuẩn một phần nhờ hệ thống vận chuyển hoạt động phụ
thuộc vào oxygen nên vi khuẩn kỵ khí tuyệt đối không chịu tác động. Amonisid là
kháng sinh diệt khuẩn, chúng ức chế tổng hợp protein, thường được dùng để trị
bệnh phát sáng, giảm nhầy, hầu như kháng sinh này không hấp thu qua ruột. Do
chúng không hấp thu qua ruột nên không nên dùng bằng đường miệng để trị nhiễm
khuẩn toàn thân. Mặt khác, kháng sinh này gây hại tạp khuẩn ruột vì thế cũng
không nên dùng để trị các bệnh viêm ruột (Lê Thị Kim Liên và ctv, 2007).
Các kháng sinh thuốc nhóm aminosid thường được dùng trong nuôi thủy sản là:
streptomycin, kanamycin, gentamycin, neomycin. Đối với cá bệnh trướng bụng,
đầy hơi do nhiễm ở cá, ếch, baba, tôm có thể dùng chộn vào thức ăn cho ăn (Lê
Thị Kim Liên và ctv, 2007). Ngoài ra, từ kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Như
ngọc (1997) đã sử dụng gentamycin trị bệnh tuột nhớt trên cá bống tượng cũng
mang lại hiệu quả khả quan.
Nhóm Quinolones
Là nhóm những kháng sinh được tổng hợp hoàn toàn bằng phương pháp hóa học,
chúng có tác dụng diệt khuẩn, gồm hai nhóm: thế hệ I gọi là quinolon kinh điển,
và thế hệ II hay fluoro quinolon. Quinolon thế hệ I có phổ kháng khuẩn hẹp, tác
động chủ yếu trên các vi khuẩn Gram âm, không có hiệu lực trên vi khuẩn Gram
dương. Quinolon thế hệ II có hoạt tính kháng khuẩn vừa nhanh, vừa mạnh, đặc
Ở tế bào Prokaryote, mà cụ thể là ở vi khuẩn qua kính hiển vi điện tử có thể quan
sát được chất nhân là phân tử DNA nguyên vẹn có dạng vòng tròn hình chiếc
nhẫn. Đấy là nhiễm sắc thể của vi khuẩn−nơi chứa nguyên liệu di truyền của tế
bào. Đồng thời bên cạnh nhiễm sắc thể, người ta còn quan sát thấy những cấu trúc
dạng hình nhẫn nhỏ hơn gọi là plasmid. Đặc điểm nổi bật của plasmid là có cấu
tạo từ DNA, có khả năng tự nhân đôi một cách độc lập, có khả năng tồn tại một
cách độc lập với bộ gen của vi khuẩn cũng như có thể gắn vào bộ gen của vi
khuẩn. Người ta xem plasmid là phần tử di truyền nằm ngoài bộ máy di truyền của
vi khuẩn (Trần Thị Thanh, 2000).
Theo Nguyễn Ngọc Hải (2007) plasmid là phân tử ADN có khả năng mang đoạn
ADN ngoại lai vào trong tế bào chủ (E.Coli hoặc nấm men Saccharomyces
cerevsiae) và đảm bảo sự nhân lên của đoạn ADN này trong tế bào chủ. Là phân
tử ADN ngoài nhiễm sắc thể có khả năng tự nhân đôi, mang những đoạn gen đặc
hiệu (kháng kháng sinh hoặc độc lực). Với những ưu điểm: kích thước nhỏ, dễ sử
dụng để tuyển lựa (tính kháng kháng sinh), với cấu trúc gen khởi động có thể sử
dụng để thể hiện chức năng của gen. Tuy nhiên, chúng lại có kích thước đoạn
AND mang không lớn hơn 12 kbp.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
13
2.6.1 Các loại plasmid
Plasmid được phân loại theo hai nhóm chính gồm (Trần Thị Thanh, 2000 và
Nguyễn Lân Dũng và ctv, 2007):
Dựa vào khả năng truyền vào vi khuẩn khác:
v Plasmid tiếp hợp (conjugative) chứa các gen giúp thực hiện một quá trình
phức tạp gọi là tiếp hợp, chuyển một plasmid sang vi khuẩn khác.
v Plasmid không tiếp hợp là những plasmid không có khả năng thực hiện
quá trình tiếp hợp, vì thế chúng chỉ có thể được chuyển sang một vi khuẩn
khác khi có sự trợ giúp của plasmid tiếp hợp.
v Nhóm plasmid trung gian gọi là nhóm plasmid di chuyển được. Chúng chỉ
mang các gen cần thiết cho việc di chuyển. Những plasmid này có thể
thể khác, các plasmid còn truyền cho các tế bào nhận những đặc điểm quan trọng
của mình như: tính đề kháng với các chất kháng sinh, kim loại nặng (Hg, Cd…) và
tia cực tím. Đặc tính tham gia trực tiếp hoặc gián tiếp vào quá trình sinh tổng hợp
một số chất kháng sinh, trong đó có cả những kháng sinh bị đề kháng bởi chính vi
khuẩn đó. Đặc điểm sử dụng nguồn cacbon khó đồng hóa như: Campor, octane,
cồn octane… làm nguồn dinh dưỡng (Trần Thị Thanh, 2000).
2.6.4 Ý nghĩa sinh học của plasmid
Các tính trạng đọc mã bởi plasmid thường cung cấp cho tế bào chủ ưu thế sinh
trưởng và nhờ đó mà các tế bào này thu được ưu thế chọn lọc.
Plasmid kháng: Đáng chú ý là các vi khuẩn thể hiện tính đa kháng thuốc được
truyền từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác qua tiếp xúc tế bào đơn giản. Ngày nay
ta đã biết các gen của plasmid-R giúp cho vi khuẩn chủ kháng với sunphonamit,
streptomixin, chloramphenicol, kanamixin và tetraxiclin. Một số plasmid-R cho
tính kháng với 8 kháng sinh, số khác kháng với kim loại nặng, độc. Các plasmid-R
thường là tiếp hợp hoặc có thể huy động. Có 2 cơ chế kháng kháng sinh: kháng do
plasmid đọc mã và kháng do nhiễm sắc thể đọc mã. Chẳng hạn, tính kháng
streptomycin do nhiễm sắc thể dựa vào sự thay đổi của hạt riboxom 30S. Trái lại,
tính kháng streptomycin do plasmid lại dựa vào sự biến đổi chất kháng sinh này
nhờ enzim (streptomycin bị adenyl hóa). Một đặc tính khác của vi khuẩn cũng do
plasmid đọc mã là vi khuẩn có thể tạo thành các protein có khả năng giết chết hoặc
kìm hãm sinh trưởng của các loài thân thuộc, các protein có tác dụng đặc biệt này
được gọi là bacterioxin (Nguyễn Lân Dũng và ctv, 2007).
2.7 Plasmid và sự kháng thuốc của vi khuẩn Aeromonas hydrophila
Majumdar et al (2007), cho biết việc tồn tại của R-plasmid trong A. hydrophila sẽ
ảnh hưởng rất lớn đến cấu trúc bề mặt, sự phát triển và tính độc của chúng khi
được cảm nhiễm vào vật chủ. Và R-plasmid này quyết định đến sự phát sinh dịch
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
15
bệnh do A. hydrophila. Ngoài ra, sự hiện hiện hay không R-plasmid của A.
hydrophila còn quyết định tính kháng hay mẫn cảm với một loại kháng sinh mà
al,1994).
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
16
CHƯƠNG 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 05/2009 đến tháng 07/2009
Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy sản – Khoa Thủy sản –
Đại học Cần Thơ.
3.2 Vật liệu nghiên cứu
3.2.1 Đối tượng nghiên cứu
Vi khuẩn Aeromonas hydrophila được phân lập trên cá tra bệnh xuyết huyết, tất
cả vi khuẩn đều đã được định danh tới loài và được trữ ở điều kiện -80
0
C trong
glycerol 25% gồm các chủng: TN1.1T, TN2.1G, CA1.3TT, CA1.2T, TN2.4TT,
CAF2, SĐ2.1T, CS2.3T.
3.2.2 Dụng cụ
− Đĩa petri, chai nấu môi trường 500ml, que trãi thủy tinh, cốc thủy tinh 100ml.
− Micropipet 1ml và 5ml, ống nghiệm, hộp đầu col, ống eppendorf, que cấy, đèn
cồn, bình xịch cồn, hộp quẹt, lame, lamella, viết lông dầu, găng tay, v.v….
3.2.3 Thiết bị
− Cân điện tử, máy khuấy từ, nồi khử trùng áp suất (autoclave), kính hiển vi.
− Tủ sấy khô, tủ cấy vi khuẩn, tủ lạnh, tủ ấm, tủ đông, máy so màu quang phổ.
− Máy vortex, bồn điện di, máy li tâm, lò vi sóng…
3.2.4 Hóa chất và môi trường
Hóa chất
C, rã đông. Sau đó được phục hồi trên môi trường
NA và ủ sau 24 giờ ở 28-39
0
C. Quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc, nếu khuẩn
lạc đã rời rạc và đồng nhất thì tiến hành nhuộm gram vi khuẩn để kiểm tra tính
thuần. Kết quả nhuộm gram đã thuần thì tiến hành kiểm tra kháng sinh đồ cũng
như xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC và ly trích plasmids.
3.3.2 Phương pháp kiểm tra kháng sinh đồ
Theo tài liệu hướng dẫn thực tập chuyên đề bệnh học thủy sản, 2008.
Sử dụng ống McFarland số 3 (0,3 ml BaCl
2
1% + 9,7 ml H
2
SO
4
1%), khi đó mật
độ vi khuẩn tương đương 9x10
8
CFU/ml (Ống McFarland phải giữ trong bóng tối,
nhiệt độ 2−8
0
C và không quá 6 tháng).
Dùng que cấy tiệt trùng nhặt một ít khuẩn lạc cho vào ống nghiệm chứa 5ml nước
muối sinh lý tiệt trùng, lắc trộn đều. So sánh độ đục giữa ống nghiệm có chứa vi
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
18
khuẩn với ống nghiệm chuẩn, điều chỉnh độ đục bằng nước muối sinh lý cho bằng
với ống nghiệm chuẩn.
Dùng pipet tiệt trùng hút 0,1ml dung dịch vi khuẩn trong ống nghiệm cho lên đĩa
môi trường, dùng que trải thủy tinh tiệt trùng trải đều, đậy đĩa petri lại và ủ
17
≥18
Ciprofloxacin (CIP, 5µg)
≤15
16
−
20
≥21
Colistin (CS, 50µg)
≤8
9
−
10
≥11
Doxycycline (DO, 30µg)
≤12
1
3
−
15
≥17
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
Copyright: Tài liệu đại học ©