Chương 5
PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT TRONG NƯỚC
VÀ THỰC PHẨM
1. PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU THỰC PHẨM
1.1 Kế hoạch lấy mẫu
Mật độ các vi sinh vật trong thực phẩm được qui địnhgiới hạn với một số lượng nhật định
tuỳ theo từng nhóm vi sinh vật cần phân tích và yêu cầu của từng đối tượng thực phẩm cũng như
các luật về vệ sinh an toàn thực phẩm. Đối với các vi sinh vật gây bệnh thông thường yêu cầu
không được hiện diện trong một khối lượng thực phẩm xác định. Số lựơng vi sinh vật được xác
định trong thực phẩm có thể không bao giờ phản ánh chính xác số lượng vi sinh vật thực tế có
trong mẫu, vì thế một khoảng giới hạn theo thông lệ được thiết lập để nhận biết các mẫu thực
phẩm đạt hay không đạt yêu cầu vi sinh vật. Thông thường các khoảng giới hạn mật độ vi sinh vật
trong thực phẩm được xác định bằng các khoảng như sau: Khoảng chấp nhận khi mật độ vi sinh
vật nằm dưới một thông số chấp nhận (m), khoảng sát mép giới hạn khi mật độ vi sinh này lớn hơn
giới hạn chấp nhận nhưng nhỏ hơn giới hạn trên (M). Khoảng không chấp nhận khi mật độ này cao
hơn giới hạn trên M. Giới hạn M thường cao hơn ít nhất 10 lần so với thông số giới hạn m. Ví dụ
tổng số vi sinh vật trong sản phẩm trứng được thanh trùng Pasteur có yêu cầu như sau:
n = 5, c = 2, m = 5 x 10
4
, M = 10
6
Trong đó n là số mẫu thử nghiệm, c là số mẫu được phép nằm trong khoảng sát mép giữa m
và M.
Kế hoạch lấy mẫu loại 2 được dùng cho các thử nghiệm phân tích vi sinh vật gây bệnh.
Theo kế hoạch này, số mẫu được lấy có thể 5,10, 20, 25 hay nhiều hơn để phân tích định tính
nhằm phát hiện có hay không có sự hiện diện các vi sinh vật trong khối lượng mẫu thử nghiệm như
trên. Sẽ không chấp nhận nếu có một trong số các mẫu trên có sự hiện diện của các vi sinh vật gây
bệnh (n = 5,10,20 hay nhiều hơn, c = 0 và n = 0). Số lượng mẫu thử phụ thuộc vào mối nguy hiểm
của từng loại thực phẩm nếu có sự hiện diện của vi sinh vật gây bệnh. Thực phẩm có mối nguy
hiểm cao là những loại thực phẩm không qua gia nhiệt trước khi sử dụng hay những thực phẩm có
tính nhạy cảm cao, ví dụ thực phẩm dành cho người già và trẻ em …

trình sản xuất.
Dụng cụ lấy mẫu và thùng chứa mẫu: Thường sử dụng các bình nhựa có nắp bằng nhôm
hay bằng chất dẻo, báo bao nylon để chứa mẫu. Không nên sử dụng các bình bằng thuỷ tinh để
chứa mẫu bởi vì có thể bị vở gây nhiễm mẫu hay gây tại nạn cho người phân tích.
Dụng cụ lấy mẫu thường làm bằng các loại chất liệu khác khác nhau như vật dụng dùng để
lấy mẫu đông lạnh là các khoan tay đã được vô trùng, hay các dao được rửa trong các dung dịch
tẩy trùng. Không nên lấy vào các mảng băng. Sử dụng các thìa, kéo … để cho mẫu vào trong bình
chứa. Đối với các thực phẩm đã đóng gói, lấy mẫu từ các gói lớn từ đó lấy ra các đơn vị bao gói
nhỏ hơn.
Mẫu phải được lấy ít nhất khoảng 100-250g cho mỗi mẫu tuỳ theo các yêu cầu phân tích,
phải lấy tại nhiều vị trí trên sản phẩm hay trong cùng một công đoạn sao cho một khối lượng nhỏ
mẫu cũng đại diện cho sản phẩm đó.
Đối với các loại mẫu thịt hay cá, nơi nhiễm vi sinh chủ yếu là trên bể mặt, vì thế có thể sử
dụng các dụng cụ lấy mẫu bể mặt để quét trên bể mặt sản phẩm hay cắt mẫu trên bể mặt với độ dày
khoảng 2-3mm.
Vận chuyễn và bảo quản mẫu: Các mẫu sau khi lấy được bảo quản một các độc lập với
nhau trong các thùng bảo quản mẫu, làm lạnh bằng các bao nước đá. Nước đá phải không được tan
chảy trong suốt quá trình vận chuyển mẫu đến phòng thí nghiệm. Tại phòng thí nghiệm mẫu được
chuyển vào trong tủ đông hay được phân tích ngay trong thời gian có thể.
Nếu không thể phân tích ngay, mẫu phải được bảo quản ở –20
o
C cho đến khi phân tích.
Nếu các mẫu không thể bảo quản đông, thì phải bảo quản trong tủ lạnh 0-4
o
C không được quá 36
giờ. Các loại thực phẩm như đồ hộp, thực phẩm có độ ẩm thấp, hay thực phẩm khó hư hỏng có thể
bảo quản ở nhiệt độ phòng cho đến khi phân tích.
1.3 Rã đông trước khi phân tích
Phải sử dụng kỹ thuật rã đông trong điểu kiện vô trùng trước khi phân tích mẫu. Trong
trường hợp phải phối trộn mẫu trước khi phân tích, mẫu phải được rã đông trong các dụng cụ chứa

chlorin hay các halogen khác. Trong trường hợp không có các tác nhân khử trong các lọ lấy mẫu,
sau khi thu những mẫu nước có chứa chlorin các chai lọ lấy mẫu không được đóng nắp. Nhân tố
khử thường được sử dụng đế khử chlorin trong nước là sodium thiosulphate, chất này trung hoà và
khử các các haologen trong nước nhằm ngăn cản sự tác động của chúng lên các vi sinh vật trong
mẫu trong thời gian vận chuyển. Sự loại bỏ các nhân tố tác động lên vi sinh vật trong quá trình vận
vận chuyển và bảo quản mẫu để sau khi phân tích quả số lượng vi sinh vật phản ánh đúng mật độ
của chúng ngay khi lấy mẫu.
Hàm lượng sodium thiocianate được cho vào trong các lọ sao cho sau khi lấy mẫu chúng
phòng thích vào trong nước với nồng độ 100mg/l. Trong chai lấy mẫu có thể tích 120ml thêm vào
0,1ml dung dịch Na
2
S
2
O
3
10% sẽ trung hoà hết chlorin trong mẫu với nồng độ 15mg/l. đối với
nước uống hàm lượng chất khử chlorin có thể sử dụng thấp hơn, khoảng 0,1ml dung dịch Na
2
S
2
O
3
nồng độ 3% trong lọ chứa 120ml mẫu. Nồng độ chất khử này phóng thích vào trong mẫu nước là
18ml/l sẽ trung hoà nổng độ chlorin trong mẫu là 5ml/l. Trong trường hợp mẫu nước được khử
trùng với hàm lượng chlorin cao, nồng độ các chất cho vào trong các lọ lấy mẫu phải đạt 100ml/l.
Các tác nhân khử chlorin được cho vào trong các lọ lấy mẫu trước khi khử trùng. Có thể sử dụng
phương pháp khử trùng ướt hay khử trùng khô đối với các dụng cụ lấy mẫu. Ngày nay có các túi
lấy mẫu chứa sằn các tác nhân khử chlorin được bán tại các của hàng vật tư phòng thí nghiệm.
Trong trường hợp mẫu nước chứa các kim loại như đồng, kẽm và các kim loại nặng … với
hàm lượng cao hay nước thải, trong các dụng cụ lấy mẫu phải cho vào các tác nhân khử độc tính

chứa. Mở vòi nước thật lớn và để chảy ra ngoài từ 2-3 phút, trong thời gian này nhằm đề rửa sạch
hệ thống vòi nước trước khi lấy mẫu, giảm vòi nước để lấy mẫu vào trong các bình chứa. Trong
một số trường hợp cần phải làm sạch vòi trước khi lấy mẫu, dung dịch sodium hypochorite được
cho chảy qua vòi trước khi lấy mẫu, sau khi khử trùng, phải mở nước vòi cho chảy khoàng 2-3
phút trước khi lấy mẫu vài chai. Không lấy mẫu từ các dòng nước chảy tràng bên ngoài vòi. Để
ngăn ngừa các dòng nước chảy tràn từ bên ngoài vòi vào trong mẫu, có thể dùng dụng cụ phễu lọc
để ngăn ngừa các dòng nước tràn từ bên ngoài vào trong bình chứa mẫu. Cũng có thể loại bỏ sự
nhiễm từ bên ngoài do các dòng nước chảy tràn, cho nước nóng chảy qua vòi khoảng hai phút, làm
lạnh từ 2-3 phút sau đó lấy mẫu vào bình.
Nếu lấy mẫu nước từ các giếng bơm tay, bơm nước để rửa vòi giếng khoảng 5 phút trước
khi lấy mẫu. Nếu giếng đào được trang bị máy bơm, cũng trực hiện tương tự như trên sau khi khời
động máy. Trong trường hợp các giếng đào không có trang bị máy bơm, mẫu được lấy trực tiếp từ
giếng bằng cách buộc chai lấy mẫu vào một vật nặng ở bên dưới đáy. Phải thật cẩn thận để tránh
sự nhiễm bẩn từ vật nặng hay nước trên bề mặt giếng.
Trong trường hợp lấy mẫu nước uống, phải lấy mẫu ở giai đoạn cuối của quá trình sản xuất,
các vị trí phân phối mẫu nước uống phải được chọn lọc để đảm bảo sự tích lũy có hệ thống trong
suối mỗi tháng. Phải xem xét thật kỹ càng vị trí của hệ thống phân bổ mẫu, ngay cả tại các điểm
chiết để đảm bảo chất lượng vi sinh vật thông qua toàn bộ hệ thống để đảm bào rằng không có các
vị trính nhiểm vi sinh vật hay nhiểm chéo do qua trình tiên tục của hệ thống như hiện tượng bể ống
hay giảm áp lực trong qua trình khử trùng hay một nguyên nhân nào đó khác. Vị trí lấy mẫu có thể
56
là vòi nước công cộng, các nơi kinh doanh ngành thực phẩm, nhà hàng hay giếng nước các nhân
… Nhưng đặc biệt quan trọng khi lấy mẫu tại các mạng lưới cung cấp nước cho cộng đồng. Sự lấy
mẫu, kế hoạch cũng như tầng suất và vị trí lấy mẫu phải được lên chương trình có sự tham vấn của
các chuyên gia vệ sinh y tế công cộng, và ngành cấp nước.
- Lấy mẫu tại các nguồn cấp nước: Mẫu được lấy trực tiếp từ các từ sông, suối, lạch, ao,
các giếng hay các hồ chứa sao cho chúng đại diện cho nguồn nước cung cấp cho con người sử
dụng. Mẫu không nên lấy quá gần bờ hay quá xa nơi đặt ống bơm nước, cũng không nên lấy mẫu
quá sâu hay quá cạn so với vòi ống bơm. Mẫu được lấy càng gần miệng ống bơm, càng đại diện
cho nguồn chất lượng của nguồn cấp nước.

định. Chuyển một thể tích xác định các độ pha loãng đã đồng nhất vào trong môi trường nuôi cấy.
Các khuẩn lạc được hình thành trong môi trường sau khi ủ được xem như là chúng hình thành từ
một tế bào đơn lẻ.
Tuỳ theo các yêu cầu cụ thể trong việc phân tích, các đĩa môi trường sau khi cấy mẫu được
ủ ở các điều kiện nhiệt độ và thời gian khác nhau. Theo yêu cầu của các tiêu chuẩn của nhiều quốc
57
gia, chỉ tiêu này được ủ ở 30
o
C trong khoảng thời gian khoảng 3 ngày. Tuy nhiên một số yêu cầu
khác có thể ủ ở nhiệt độ 20 - 22
o
C trong cùng thời gian trên.
Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa, căn cứ vào độ pha loãng cũng như thể tích cấy
để qui về tổng số vi sinh vật trong một đơn vị khối lượng mẫu thực phẩm. Chỉ tiêu tổng số vi sinh
vật hiếu khí được dùng để đánh giá chất lượng của mẫu về khía cạnh vi sinh vật, qua đó đánh giá
khả năng hư hỏng, cũng như thời hạn bảo quản các sản phẩm thực phẩm. Tổng số vi sinh vật hiếu
khí còn là chỉ tiêu đánh giá mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản thực phẩm, nước
uống hay các sản phẩm khác.
3.3. Môi trườnng và vật liệu phân tích
- Môi trừơng Plate Count Agar có pH 7.0 ± 0.2. Môi trường được phân phối vào trong các bình
thuỷ tinh hay trong các ống nghiệm. Hấp khử trùng ở 121
o
C trong 15 phút. Bảo quản ở trong tủ
lạnh từ 2–8
o
C. Trước khi sử dụng môi trường phải được đun chảy và làm nguội ở 45
o
C trong
bể điều nhiệt.
- Dung dịch pha loãng saline pepton water: gồm 8.5 gam NaCl và 1.0gam pepton. Dung dịch

o
C (hay yêu cầu nhiệt độ khác) trong thời gian 72 giờ.
Trong một số yêu cầu, nhiệt độ ủ đĩa và thời gian ủ có thể thay đổi.3.6. Đếm kết quả
Đếm tất cả số các khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ. Chọn các đĩa có số đếm từ 25
đến 250 để tính kết quả. Số lượng tổng số vi sinh vật trong 1 gam mẫu được tính như sau:
N
A = (cfu/g)
n
1
x V
1
x f
1
+ … + n
i
x V
i
x f
i
Trong đó: A: số lượng vi sinh vật trong 1 gam mẫu
N: tất cả các khuẩn kạc đếm được trên các đĩa đã chọn.
n
i
: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i
V: thể tích dịch mẫu cấy vào trong 1 đĩa.
58
f
i
: độ pha loãng tương ứng.
Ví dụ trong một trường hợp phân tích mẫu cụ thể nhận được kết quả như sau:

4. XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ COLIFORMS VÀ COLIFORM PHÂN BĂNG PHƯƠNG PHÁP
ĐẾM KHUẨN LẠC
4.1. Định nghĩa
Coliforms là nhóm vi sinh vật chỉ thị vì số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm,
nước hay các loại mẫu môi trường được dùng như dấu hiệu chỉ thị khả năng hiện diện của các vi
sinh vật gây bệnh khác. Các nhà nghiên cứu đều cho thấy rằng với số lượng cao của coliform trong
thực phẩm thì khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác cao. Tuy nhiên mối liên hệ
giữa vi sinh vật gây bệnh và vi sinh vật chỉ thị còn có nhiều tranh cãi.
Coliform tổng số là nhóm vi sinh vật hiếu khí tuỳ nghi, thuộc nhóm vi khuẩn gram âm,
không sinh bào tử, có hình que, lên men lactose và sinh hơi từ nguồn carbon này trong vòng 24-48
giờ ờ nhiệt độ 37
o
C.
Khi nâng cao nhiệt độ nuôi cấy lên 44
o
C có thể phân biệt Coliform phân với nhóm
Coliform tổng số và nhóm không phải Coliform. Coliform được định nghĩa như sau: Coliform
phân là nhóm vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tuỳ ý, thuộc nhóm vi sinh vật gram âm, không sinh bào
tử và có khả năng lên men lactose và sinh hơi trong khoảng thời gian nuôi cấy 24-48 giờ ở nhiệt
độ 44
o
C.
Nhóm Coliform phân là một phần của hệ vi sinh ruột đường ở người và các động vật máu
nóng khác, các nhóm vi sinh vật sau được liệt vào nhóm Coliform phân: Escherichia; Klebsiella,
Citrobacter và Enterobacter. Nhóm vi sinh vật này được sử dụng như yếu tố chỉ thị mức độ vệ sinh
trong quá trình chế biến, bảo quản và vận chuyển thực phẩm, nước uống và môi trường. Các đặc
điểm sinh hoá khác nhau để phân biệt các thành viên trong nhóm coliform phân như sau:
4.3. Nguyên tắc
Cấy một lượng mẫu xác định trên môi trường thạch chọn lọc. Sau khi ủ ở 37,0 + 1,0
o

C trong 15 phút bằng nồi hấp. Bảo quản ở nhiệt độ 4-8
o
C. Trước khi sử dụng, môi
trường được đun chảy và làm nguội ở 45
o
C trong bể điều nhiệt.
- Violet Red Bile Agar (VRB) được chuẩn bị vô trùng trong các chai thuỷ tinh,đun chảy và làm
nguội ở nhiệt độ 45
o
C trong bể điều nhiệt trước khi sử dụng. Có thể sử dụng các môi trường khác
như Desoxycholate agar cũng được chuẩn bị như trên.
- Brilliant Green Bile Lactose Broth (BGBL) được phân phối vào trong các ống nghiệm, mỗi
ống 10ml và có ống Durham đặt ngược bên trong. Khử trùng ở 121
o
C trong 15 phút. Sau khi khử
trùng phải đảm bảo không có bọt khí trong các ống Durham ngược.
- E.C broth: được chuẩn bị tương tự như môi trường BGBL.
- Canh trypton: được phân phối vào trong các ống nghiệm, mỗi ống 5ml. Môi trường khử
trùng ở 121
o
C trong 15 phút.
- Thuốc thử Kovac’s hay Ehrlish
4. 5. Qui trình phân tích
Chuẩn bị mẫu:
Quá trình chuẩn bị mẫu tương tự như phần định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí. Nhưng
quá trình pha loãng mẫu sao cho trong 1ml dung dịch pha loãng chứa khoảng <100 tế bào
Coliform.
Cấy mẫu và đổ môi trường
Cấy chuyển 1 ml dịch pha loãng mẫu đã chọn vào đĩa petri, mỗi nồng độ cấy ít nhất vào hai
đĩa petri, chọn 2 nồng độ pha loãng liên tiếp để cấy sao cho sau khi ủ mỗi đĩa xuất hiện dưới 100

Trong trng hp khng nh Coliform phõn, cỏc khun lc sinh hi trong mụi trng E.C
broth c th nghim indol 44
o
C. T l dng tớnh ch c tớnh cho cỏc khun lc cú kh nng
sinh hi v phn ng indol dng tớnh.
Bỏo cỏo kt qu
N
A(coliform/coliform phõn) = x R (cfu/g(ml))
n
1
v
1
f
1
+ + n
i
v
i
f
i
Trong ú: N : tng s khun lc m c
n
i
: s a cú s khun lc c chn ti mi pha loóng
v : Th tớch cy vo mi a
f
i
: pha loóng cú s khun lc c chn ti cỏc a m
R : T l xỏc nhn
Kt qu coliform hay coliform phõn c lm trũn chn chc v c biu din di dng

- Thuc th Kovacs
5.5. Thit bị chính
- T m 37.0 + 1.0
0
C.
- T m 44.0 + 0.5
0
C.
5.6. Quy trình
Chun bị mu:
Chun bị mu và pha loãng tơng t nh định lng Coliforms
Tăng sinh:
Cy 1ml dịch mu c nng đ 10
-1
vào ng nghim c cha 10ml môi trng tăng sinh (BGBL),
44.0 + 0.5
0
C/24 gi.
Phân lp
Sau 24 gi, chn ng nghim c phản ng dơng tính (làm đc môi trng và sinh hơi), cy sang
môi trng phân lp (EMB), 37.0 + 1.0
0
C/24 gi.
Nhn dạng khun lạc E.coli: Trên môi trng EMB: khun lạc màu tím, ánh kim, tròn, b đu, đng
kính khoảng 0.5mm.
Khẳng định
Những khun lạc nghi ng đc thc hin qua các th nghim sinh ha (thc hin nghim pháp
IMViC)
Chn ít nht 2 khun lạc đin hình hay nghi ng môi trng phân lp, cy chuyn sang môi trng
rắn không chn lc (TSA) , 37.0 1.0

citrate nh ngun car bon duy nht.
Trong mt s phng phỏp kim nghim thc phm, cú nhng nh ngha phõn bit s
lng E.coli khng nh v s lng E.coli gi nh. S lng E.coli gi nh c coi l nhng
62
Coliform phân, chúng có phản ứng Indol dương tính, không tiến hành khẳng định các phản ứng
khác.
E.coli còn được gọi là faecal coli, chúng hiện diện thường xuyên trong ruột người và các
loài động vật. Chúng phân bố rộng khắp trong tự nhiên, mặt dù có nguồn gốc từ phân, nhưng sự
hiện diện của chúng với một số lượng nhỏ trong thực phẩm không có nghĩa là thực phẩm đó bị
nhiễm phân. Sự hiện diện của vi sinh vật trong thực phẩm, nước uống là dấu hiệu chỉ thị sự kém
chất lượng về mặt vệ sinh.
Khi xâm nhiễm một liều lượng lớn vào trong cơ thể ngưới và động vật, E.coli là loài phổ
biến nhất gây viêm nhiễm đường tiểu, thỉnh thoảng có thể tìm thấy chúng gây lở loét và tạo mủ,
nhiễm trùng máu và có thể tìm thấy vi sinh vật này gây viêm não.
Cho đến nay người các nhà khoa học đã tìm được ít nhất 4 loài gây bệnh đường ruột cho
người. Theo phân loại của Gorbach chúng được chia thành: enterobathogenic (EPEC);
enterotoxigenic (ETEC), enteroinvasive (EIEC), và verotoxigenic (ETEC). Các kiểu huyết thanh
của các dòng E.coli gây bệnh được liệt trong bảng 26.3
6.2 Nguyên tắc
Cấy một thể tích xác định các nồng độ pha loãng thích hợp lên môi trường chọn lọc. Sau
khi ủ ở 44
o
C trong khoảng thời gian 24 giờ, đếm các khuẩn lạc có hình dạng đặc trưng của
Coliform. Xác nhận các khuẩn lạc đã đếm bằng các phản ưng sinh hoá. E. coli có các phản ứng
sinh hoá đặc trưng như sau: indol dương tính, methyl red dương tính; Vogesproskauer âm tính và
citrat âm tính.
6.3Môi trường
Tryptone soya agar ( TSA ) (chuẩn bị tương tự phần coliform)
Violet red bile agar ( VRB ) (chuẩn bị tương tự phần coliform)
Escherichia coli broth (EC broth): được phân phối trong các nghiệm, mỗi ống chứa 10ml,

63
khoảng 24 giờ. Thử phản ứng indol, methylred; vogesposkauer, citrate (xem phần thử nghiệm các
phản ứng sinh hoá). Tỉ lệ xác nhận số lượng khuẩn lạc thử nghiệm cho kết quả đúng là E.coli bằng
tỉ số giữa số lượng khuẩn lạc xác nhận ban đầu và số lượng khuẩn lạc cho kết quả là E.coli.
Số lượng E.coli được tính như sau:
N
Số CFU E.coli = x R
n x V x f
Trong đó: N: số lượng khuẩn lạc coliform đã đếm
V: thể tích mẫu cấy vào đĩa
n: số lượng đĩa cấy cho một mẫu
f: độ pha loãng của mẫu
R: tỉ lệ xác nhận của E.coli
Có thể tính số lượng E.coli giả định bằng cách tính tỉ lệ số lượng khuẩn lạc cho phản ứng
indol dương tính, công thức tính tương tự như trên.
Báo cáo kết quả: Kết quả E.coli được thể hiện bằng số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc
E.coli trong một gram hay mililitre mẫu.
Các phương pháp khác dùng trong định lượng E. coli:
Ngoài phương pháp nuôi cấy theo qui trình như trên, E.coli còn được định lượng bằng
phương phương pháp màng lọc nuôi cấy trên các môi trường chuyên biệt hay phương pháp MPN.
Đến nay có những phương pháp màng lọc có thể phân biệt được số lượng E.coli trong tổng số
coliform. Các phương pháp miễn dịch học hay sinh học phân tử có thể phân biệt các loài E.coli gây
bệnh với các loài không gây bệnh khác.
7. ĐỊNH LƯỢNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS BẰNG
PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC
7.1Định nghĩa
Staphylococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kỵ khí tuỳ nghi, có hình cầu, gram dương,
có phản ứng đông huyết tương dương tính do chúng tiết ra enzyme coagulase. Ngoài ra còn các
đặc điểm như có phản ứng Dnase, phosphatease dương tính, có khả năng lên men và sinh acid từ
mannitol, trehalose, sucrose. Tất cả các dòng S. aureus đều nhạy với novobiocine, có khả năng

o
C trong 15 phút. Làm nguội môi trường
đến 45-50
o
C trong bể điểu nhiệt. Thêm vào 5% thể tích máu cừu hay bê non dưới 5 tháng tuổi đã
được loại bỏ các sợi máu hay máu được thêm chất chống đông citrat. Hoàn tan đều máu vào trong
môi trường. Phân phối vào trong đĩa petri. Môi trường phải được pha chế trước ít nhất 2 ngày
trước khi sử dụng để kiểm tra khả năng bị nhiễm. Môi trường thạch máu không nên đổ quá dày để
có thể nhận rỏ các vòng tan máu.
Môi trưìơng thạch Baird Parker:
Môi trường này có chứa lòng đỏ trứng tươi và potassium tellurite, đây là hai thành phần
không chịu nhiệt, vì thể phải bổ sung vào môi trường sau khi khử trùng và làm nguội đến khoảng
60
o
C. Sau khi bổ sung đầy đủ các thành phần, môi trường được phân phối vào trong đĩa petri. Sau
khi pha chế đĩa môi trường phải có màu vàng đục.
Huyết tương thỏ (thử phản ứng đông huyết tương)
Huyết tương thỏ được cố định với 0.1% EDTA hay cố định trong sodium oxalate. Phân
phối vào trong các ông nghiệm nhỏ, mỗi ống 0,.3 ml. Có thể thử phản ứng này trên lam kính.
7.4 Tiến hành
Xử lý và pha loãng mẫu: Cân 10,0± 0,1 gram mẫu trong túi vô trùng, thêm 90 ml dung
dịch pha loãng, đồng nhất bằng máy dập mẫu khoảng 30 giây. Chuẩn bị dãy pha loãng thích hợp
tùy theo mức nhiễm của từng loại mẫu sao cho khi cấy một thể tích xác định lên đĩa BP sau khi ủ
có khoảng <100 khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa.
Cấy mẫu: Cấy 0,1ml mẫu nguyên hoặc đã pha loãng vào đĩa môi trường Baird Paker Agar,
nếu mật độ S.aureus trong mẫu thấp có thể cấy 1ml dung dịch pha loãng phân phối vào 3 đĩa môi
trường BP, dùng que cấy tam giác trang đều trên bề mặt cho đến khi khô mặt. Thực hiện tương tự
như trên với môi trường thạch máu. Lật ngược đĩa, ủ ở 37.0
o
C± 1.0

- Âm tính: Không có khối đông, hỗn dịch vẫn đồng nhất như ống không cấy.
Ngoài S. aureus, chỉ có S. intermedius và một số ít S. hyicus cho phản ứng đông huyết
tương dương tính. Không giống như S. aureus và S. intermedius, đa số loài S. hyicus subsp hyius
cho phản ứng dương tính chậm và yếu. S. intermedius và S. hyius subsp hyius có phản ứng dương
tính nhưng có khuẩn lạc nhỏ không đặc trưng trên môi trường Baird Parker Agar, không có vòng
tan máu và không sinh sắc tố trên môi trường thạch máu.
7.6Tính kết quả
Số lượng S.aureus trong mẫu được tính như sau:
10
Số S. aureus [CFU/g(ml)] = (N
t
x H
t
+N
a
x H
a
)
F
1
+ F
2

Trong đó: F: độ pha loãng
N
t
: tổng số khuẩn lạc đặc trưng
N
a
: tổng số khuẩn lạc không đặc trưmg

-2
5 ống mổi ống cấy 1ml dung dịch pha loãng 10
-3
66
Môi trường canh được sử dụng là Mannitol Salt Broth hay Tryptose Soy Broth có 10%
muối NaCl. Sau khi cấy, ủ ở nhiệt độ 37
o
C trong 48±2 giờ. Chọn các ống dương tính, khi có các vi
sinh vật phát triển làm đục canh trường để phân lập trên môi trường BP, các đĩa môi trường BP
được ủ ở 37
o
C trong 48 giờ. Chọn các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường BP để xác nhận S.
aureus. Các đĩa cho kết quả S. aureus dương tính được đối chiếu với các ống nghiệm trong hệ
thống các dãy cấy ban đầu. Tra bảng MPN để có kết quả định lượng S. aureus trong mẫu.
9. PHÁT HIỆN SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM
9.1 Định nghĩa
Salmonella là trực trùng gram âm, hiếu khí và kỵ khí tùy nghi, có khả năng di động (trừ S.
gallinarum và S.pullorum ), sinh acid từ glucose và mannitol nhưng không lên men sacharose và
lactose, không sinh indole và không phân giải ure. Hầu hết các chủng đều sinh H
2
S ( trừ S. typhi).
Cho đến nay giống Salmonella có hơn được phát hiện có hơn 2300 serotypes. Các serotype
này được chia theo hệ thống của Kaffmann – White dựa trên công thức kháng nguyên O (kháng
nguyên somatic) và kháng nguyên lông H (flagella). Trong số các serotype trên, có một số
serotype được đặc tên như Enteritidis, Typhi, Paratyphi, Typhimurium … hầu hết serotype không
có tên được biểu diển dưới dạng công thức kháng nguyên.
9.2 Nguyên tắc
Phương pháp được mô tả sau đây nhằm định tính Salmonella, kết quả được báo cáo là có
hay không có Salmonella trên lượng mẫu được kiểm nghiệm. Để đạt hiệu quả cao, quy trình kiểm
tra Salmonella bắt buộc phải qua giai đoạn tiền tăng sinh. Điều này cần thiết vì Salmonella thường

chọn lọc Rappapport-vassliadis soya pepton. Trước khi cấy mẫu, canh thang tăng sinh phải được ủ
ấm đến nhiệt độ 42
o
C, nhiệt độ này là yếu tố quan trong cho việc tăng sinh tối ưu. U mẫu trong bể
điều nhiệt ở 42,0
o
C ±0,2
o
C trong18-24h (có thể kéo dài thời gian ủ thêm 24 giờ nữa nếu thấy cần
thiết).
Cấy và đọc kết quả trên đĩa
Dùng khuyên cấy tròn ria dịch mẫu từ canh thang tăng sinh lên đĩa thạch XLD và thạch
Brilliant green-phenol red để tạo những khuẩn lạc riêng rẽ. ủ ở 37.0
o
C±1.0
o
C trong khoảng 18-24
giờ.
Trên thạch XLD: Khuẩn lạc điển hình trong suốt, hơi nhuốm đỏ, tâm đen, thường có vùng
đỏ hồng bao quanh, đặc biệt khi Salmonella phát triển mạnh.
Trên thạch Brilliant green-phenol red: Khuẩn lạc điển hình trong, có vùng đỏ hồng bao
quanh.
Khẳng định
Khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella phải được kiểm tra sinh hóa và kháng huyết thanh. Từ
mỗi môi trường phân lập (XLD hay thạch Briliant green-phenol red) cấy chuyển ít nhất 5 khuẩn
lạc nghi ngờ sang môi trường không chọn lọc (TSA). ủ ở 37.0
o
C ±1.0
o
C trong khoảng 18-24 giờ.

urea (không chuyển sang màu đỏ).
Thử nghiệm trên môi trường Mannitol phenol red : Cấy vi sinh vật đã được làm thuần vào
canh Mannitol phenol red. Không nên vặn chặt nắp ống nghiệm. Nuôi ủ ở 37.0±1.0
o
C trong
khoảng 48 giờ, nhưng phải kiểm tra sau 24 giờ. Salmonella làm acid hóa môi trường qua sự xuất
hiện màu vàng (phản ứng dương tính).
Thử nghiệm Indol: Cấy một lượng nhỏ vi sinh vật đã được làm thuần vào ống canh
Tryptone. ủ ở 37.0±1.0
o
C /24 giờ. Chuyển 5 ml canh dịch sang 1 ống nghiệm khác. Thêm vào 0.2
- 0.3 ml thuốc thử Kovac’s. Hầu hết Salmonella cho phản ứng âm tính, không có sự xuất hiện màu
đỏ trên bề mặt môi trường nuôi cấy.
Thử nhiệm phản ứng Voges- Proskauer: Cấy vi sinh vật đã được làm thuần vào ống
nghiệm chứa canh MR-VP và ủ ở 37.0±1.0
o
C trong khoảng 24 giờ. Chuyển 1ml sang ống nghiệm
68
có kích cở 13x100 mm. Thêm 0.6 ml (-napthol và 0.2 ml KOH 40%, lắc đều. để yên trong hai giờ.
Salmonella cho phản ứng VP âm tính (không có sự xuất hiện màu đỏ hồng trong ống nghiệm).
Khẳng định bằng thử nghiệm kháng huyết thanh
Thử nghiệm kháng huyết thanh phải được tiến hành song song với mẫu trắng (dung dịch nước
muối sinh lý) nhằm loại trừ khả năng ngưng kết giả. Dùng kháng huyết thanh Salmonella
polyvalent O và Salmonella polyvalent H.
9.5 Trình bày kết quả: Không có (hoặc có) Salmonella được phát hiện trong 25g mẫu.
9.6 An toàn Salmonella là vi khuẩn gây bệnh.
Khi làm việc với các chủng chứng dương, kiểm nghiệm viên cần thận trọng và tuân thủ các
qui định về an toàn phòng thí nghiệm để tránh nhiễm bệnh hoặc làm lây lan mầm bệnh.
10. XÁC ĐỊNH SHIGELLA TRONG THỰC PHẨM
10.1 Định nghĩa

ngờ được kiểm tra bằng thử nghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh.
10. 3. Thuốc thử và môi trường
3 Môi trường chọn lọc và không chọn lọc:
- Canh Tryotose soya
69
- Canh Gram negative
Môi trường chọn lọc:
- Thạch MacConkey
- Thạch Xylose lysine desoxycholate
- Thạch Hektoen enteric
Môi trường và thuốc thử sinh hoá:
- Thuốc thử Oxidase
- Thuốc thử catalase
- Thạch Triple sugar iron
- Môi trường thử nghiệm tính di động
- Mannitol phenol red broth
- Duciltol phenol red broth
- Lisine decarboxylase broth
Kháng huyết thanh: bao gồm các loại huyết thanh như sau: polyvalent A; B; C; D
10.4 Qui trình phân tích tiến hành
Tiền tăng sinh
Lấy 25g mẫu cho vào túi dập mẫu, thêm 225ml canh Tryptone soya. Sau khi đồng nhất
mẫu, đo pH và nếu cần chỉnh về pH 7.0 ±0,2. Buộc chặt miệng túi và ủ ở 37.0
o
C trong khoảng
thời gian 16 - 20 giờ. Có thể cho mẫu vào trong các bình tam giác, sau khi chỉnh pH ủ các bình này
trong điều kiện kỵ khí ở nhiệt độ và thời gian như trên.
Tăng sinh chọn lọc
Chuyển 0,1ml dịch tiền tăng sinh sang 10ml canh thang tăng sinh GN. ủ ở 37.0
o

2
S
70
được tạo thành trong môi trường. Các dòng có phản ứng như trên được thử nghiệm để khẳng định
Shigella
Thử nghiệm khẳng định
Phản ứng đạc trưng của các dòng Shigella được thể hiện trong bảng sau:
TT Thử nghiệm sinh hoá Phản ứng
1
2
3
4
5
6
7
8
9
11
12
13
14
Simmon citrate
Arginine decarboxylase
Lisine decarboxylase
Urease
Malonate
MR
VP
Salicine
Xylose

- +/- +
Ornithin
decarboxylase
- - -1 +
Indol +/-
2
+/-
2
+/- -
Acid from
Dulcitol -
4
-
4
- -
Lactose - -
1
-
1
+
3
Mannitol - + + +
Raffinose - +/- - +
3
Saccharose - - - +
3
Xylose - - +/- -
1: Các dòng S.dysenteriae 1 và S.sonnei phản ứng dương tính
2: S.dysenteriae 1; S. flexneri 6 luôn cho phản ứng âm tính; S.dysenteriae 2 có phản ứng dương tính
3: Phản ưng dương tính chỉ biểu hiện khi thời gian nuôi cấy quá 24 giờ.

- Peptone kim c 1% NaCL
- Môi trng di đng
- TSA + 1,5% NaCl
- Thạch Triple sugar iron
- ONPG
- Thuc th Oxydase
- O/129 Vibriostaticum dics containing 150 and 10 àg 2,4-diamino-6,7-di- isopropylpteridine.
- Thuc th Cytochrome oxidase
- Arginine decarboxylase
- Lysine decarboxylase
- Fermentation: - Sucrose, lactose, mannitol
- Urea phenol red broth
- Na desoxycholate 5% (String test solution)
- KOH
11.4 Thit bị chính
- T m 37.0 1.0
o
C
11.5 Quy trình
Tăng sinh: Cân 25g mu cho vào ti vô trng, thêm vào 225ml APW. Dp mu trong 2 pht,
37.0 1.0
o
C trong 16 18 gi .
72
Đ đa và đc kt quả trên đa: T môi trng tăng sinh, cy ria lên môi trơng thạch TCBS, trong
18-24h 37.0 1.0
o
C.
Trên môi trngTCBS agar:
Khun lạc V.cholera tròn, lớn c đng kính 2-3mm, màu vàng

-
To Acid t :
Sucrose
Lactose
Maninitol
-
-
+
+
-
+
ONPG - +
ADH - -
LDC + +
Urease + +
Nhy cm vi:
10 àg O/129
150 àg O/129
R
S
S
S
Th nghim khỏng huyt thanh vi V. cholerae
V. cholerae a giỏ O1 v non O1
V. cholerae n giỏ: Inaba, Ogawa, Hikojima
non-O1 group:O139
12. NH TNH LISTERIA MONOCYTOGENES TRONG THC PHM
1.2 nh ngha
Listeria monocytogenes cú hỡnh gy ngn, mnh, gram dng trong la cy 20 gi, phn
ng catalase dng tớnh, oxidase õm tớnh, chuyn ng xoay trũn thnh t trong tiờu bn git treo

Listeria innocua
Staphylococcus aureus, dung huyết β yếu
Rodococcus equi.
12.3 Môi trường và thuốc thử
Giai đoạn tăng sinh:
Canh tăng sinh sơ cấp LBI (Listeria enrichment broth I): được chuẩn bị trong các bình chứa
lớn để đồng nhất với mẫu.
Canh tăng sinh thứ cấp LBII (Listeria enrichment broth II): được chuẩn bị trong các ống
nghiệm, mỗi ống 10ml.
Môi trường EB (enrichment broth): là môi trường cải biên từ môi trường LB được sử dụng
trong qui trình tăng sinh một giai đoạn.
Môi trường phân lập : Oxford agar được chuẩn bị trên các đĩa.
Các môi trường và thuốc thử dùng trong các thử nghiệm sinh hoá:
Thạch máu (Blood Agar): nên sử dụng máu cừu hay máu của bê non dưới 5 tháng tuổi để
pha chế môi trường.
Môi trường thạch mềm dùng trong thử tính di động: Môi trường BHI được bổ sung 3-5g
agar/lit. phân phối vào trong các ống nghiệm, mỗi ống 5ml.
Rhamnose phenol red broth và Xylose phenol red broth.
Thuốc thử catalase
Thuốc thử oxydase
12.4 Dụng cụ và thiết bị
74
Tủ ấm: 25
o
C, 30.0
o
C, và 37
o
C .
Phiến kính giọt treo.

Nhuộm gram:Listeria spp. Gram dương.
Thử khả năng di động phương pháp giọt treo: Listeria spp. chuyển động nhào lộn trong
canh trùng ủ ở 25
o
C.
Thử tính di động trong ống nghiệm: Cấy vi trùng bằng cách đâm sâu vào thạch mềm trong
ống nghiệm. ủ 25
o
C trong khoảng 40 giờ hoặc lâu hơn. Kiểm tra sự phát triển xung quanh đường
cấy đâm sâu. Listeria spp. di động tạo hình chiếc dù cách bề mặt thạch vài mm
Khả năng biến dưỡng đường: ủ các ống canh trùng thử khả năng lên men đường ở 37
o
C
trong vòng 7 ngày. Kết quả dương tính (màu vàng) thường quan sát được trong vòng 24 - 48 giờ.
L.monocytogenes lên men đường rhamnose nhưng không có khả năng lên men đường xylose.
75
S. aureus R. equi
L. monocytogenes
L. innocua
Chủng kiểm tra
Sơ đồ thử phản ứng CAMP
Thử phản ứng CAMP: Trên đĩa thạch dùng để thử phản ứng CAMP, cấy một đường cấy
mỏng chủng S.aureus song song và cách 4 cm với đường cấy của chủng R.equi. Cấy chủng nghi
ngờ Listeria ở giữa, gần nhưng không chạm vào hai đường cấy trên. Một đĩa có thể cấy một hoặc
nhiều dòng vi khuẩn nghi ngờ L.monocytogenes. Cấy chủng dương và L.innocua. ủ ở 37
o
C trong
khoảng 20-36 giờ. Phản ứng dương tính khi xuất hiện vùng cộng hưởng tan huyết ngay tại ranh
giới của chủng thử và S.aureus hoặc R.equi. Phản ứng CAMP dương tính với R.equi sẽ tạo vùng
dung huyết rộng (5 – 10 mm) và có hình dạng đầu mũi tên. Phản ứng dương tính giữa

Có khả năng sinh acid từ các nguồn carbohydrate
10
o
C 44
o
C Mannito
l
Sorbitol Sucrose arabinos
e
Adonotol
E.faecalis + + + + + + - -
E.faecicu
m
+ + + + v + + -
E.durans + + + - - - - -
76
E.avium v
*
+ - + + + v +
v: phản ứng không ổn định (variable)
E. faecalis: đây là vi sinh vật thường xuyên được tìm thấy trong ruột già của người, chúng
được coi là nhân tố chỉ thị ô nhiễm phân. Thỉnh thoảng tìm thấy vi sinh vật này trong ruột gà
nhưng ít khi tìm thấy trong động vật khác. Chúng có thể phát triển được trong môi trường có
0.03% potassium tellurite.
S. faecicum: chúng thường hiện diện trong ruột lợn và các vật khác. Đây là một trong
những vi sinh vật gây hư hỏng các sản phẩm như jambon và thịt nguội. Không thể phát triển trong
môi trường có có 0.03% potassium tellurite. Đây là loài vi sinh có khả năng kháng kháng sinh cao
nhất so với các loài khác trong nhóm Enterococcus.
S. durans: thường được tìm thấy trong sữa và các sản phẩm của sữa, không tìm thấy trong
các mẫu bệnh phẩm.

- Tủ ấm 44
o
C
13.6 Phương pháp thực hiện.
Chuẩn bị mẫu: Mẫu được chuẩn bị và pha loãng thành các nồng độ phù hợp bằng dung
dịch pha loãng sao cho sau khi cấy 0.1 ml vào đĩa sẽ xuất hiện 100-150 khuẩn lạc.
Cấy mẫu: cấy 0.1 ml lên bền mặt môi trường chọn lọc Enterococcus agar , trang đều khắp
bề mặt đĩa bằng que trang tam giác.
Trong trường hợp nghi ngờ các vi sinh vật trong mẫu bị yếu hay thương tổn do quá trình
chế biến và bảo quản, cấy 1ml mẫu vào trong đĩa petri trống, đổ 5-6ml môi trường tryptose soy
agar đã được làm nguội trong bể điều nhiệt đến 45
o
C, lắc để mẫu phân tán đều vào trong môi
trường, ủ ở 37
o
C trong khoảng 2 giờ. Đổ 10-12ml môi trường enterococcus agar lên trên mặt.
Lật ngược đĩa petri và ủ ở 44
o
C trong khoảng thới gian 2 ngày.
Đếm tất cả các khuẩn lạc có màu hồng đến màu đỏ đậm, có thể có một vòng không màu
xung quanh khuẩn lạc, kích thước các khuẩn lạc này khoảng 0.5-3mm, không đến các khuẩn lạc
không có màu.
77

Trích đoạn ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS, COLIFORMS CHỊU NHIỆT, E COLI GIẢ ĐỊNH VÀ E.

---