TCNCYH-2003
Bảo quản tinh trùng ngời bằng nitơ lỏng trong môi
trờng glycerol, GEYC và Sperm freeze
Trịnh Sinh Tiên, Trịnh Bình
Nguyễn Ngọc Hùng và Nguyễn Thị Bình
Đại học Y Hà Nội

Sử dụng ba loại môi trờng glycerol, GEYC và Sperm freeze để bảo quản tinh trùng ngời trong
nitơ lỏng (-196
0
C) cho kết quả: Chất lợng tinh trùng sau bảo quản bằng môi trờng GEYC tơng
đơng với môi trờng Sperm freeze và cao hơn có ý nghĩa thống kê so với bảo quản ở môi trờng
glycerol đơn thuần (p < 0,01); Bảo quản tinh trùng ngời bằng lạnh sâu dùng môi trờng GEYC và
Sperm freeze có hiệu quả với CSF 50%.
(Từ viết tắt: GEYC: Glycerol egg yolk citrat; CSF: Cryosurvival factor; TT: Tinh trùng)

I. Đặt vấn đề
Bảo quản đông lạnh tế bào và mô là một
nhánh của ngành sinh học nhiệt độ thấp, với
mục đích làm ngừng và bảo tồn đợc đời sống
tế bào trong suốt quá trình lu giữ kéo dài trong
tình trạng đóng băng ở nhiệt độ thấp. Nguyên
lý cơ bản của bảo quản lạnh sâu là kiểm soát
đợc chuyển động của các phân tử trong các
tế bào và mô. Quá trình sống luôn đòi hỏi
những biến đổi sinh học, có liên quan đến sự
chuyển động của các phân tử trong môi trờng
nớc. Khi nớc ở trong và quanh tế bào chuyển
thành dạng nớc đá đủ để ngăn cản sự chuyển
động của các phân tử, và sau đó nếu đợc làm
ấm lại, các hệ thống sinh học của tế bào không

quản Mô - Phôi, Trờng Đại học Y Hà Nội trong
thời gian từ tháng 5 đến tháng 8 năm 2002.
- Tiêu chuẩn chọn đối tợng nghiên cứu:
Nam giới trong độ tuổi sinh sản, không xuất
tinh từ 3 đến 5 ngày trớc ngày lấy tinh dịch,
không sốt, không dùng thuốc, không uống rợu
tại thời điểm lấy mẫu.
2. Phơng pháp nghiên cứu
áp dụng nghiên cứu can thiệp. So sánh
hiệu quả bảo quản của 3 loại môi trờng ở các
thời điểm 1, 2, 30 và 90 ngày sau bảo quản,
theo các chỉ số tinh trùng sống di động tiến tới
nhanh sau bảo quản (CSF
1
), chỉ số tinh trùng
sống di động tiến tới nhanh và chậm sau bảo
quản (CSF
2
), và chỉ số tinh trùng sống sau bảo
3
- Đề tài đợc thực hiện tại Lab bảo quản Mô - Phôi Đại học Y Hà Nội.

TCNCYH-2003
quản (CSF
3
).
2.1. Chuẩn bị và chọn mẫu tinh dịch.
Tinh dịch đợc lấy trong một phòng riêng,
nằm cạnh phòng xét nghiệm, bằng cách tự kích
thích và cho xuất tinh thẳng vào một cốc thuỷ

5 Glycocol Glycin 2 gam
6 Glucose

2,6 gam
7 Natri citrat PA 2,3 gam
8 Nớc cất 2
lần, khử ion
kim loại

130 ml
2.2.2. Quy trình bảo quản và tan đông.
Để làm rõ u điểm của môi trờng bảo quản
theo mục tiêu đã đề ra, một quy trình chung đã
đợc thực hiện ở tất cả các mẫu nghiên cứu.
- Chia mỗi mẫu tinh dịch thành ba phần
bằng nhau, cho vào 3 cốc thuỷ tinh đã ghi
nhãn: tên bệnh nhân, môi trờng pha. Mỗi
phần sử dụng một loại môi trờng, nhỏ từng
giọt môi tr
ờng lắc đều, theo tỉ lệ glycerol 2
giọt/1ml tinh dịch [5], môi trờng GEYC
1ml/1ml tinh dịch [1], Sperm freeze 0.7ml/1ml
tinh dịch. Sau khi cho môi trờng, để mẫu ở
nhiệt độ phòng thí nghiệm 15 phút.
- Nạp mỗi mẫu đã chuẩn bị để bảo quản
trong 4 cọng rạ (straw) bằng máy hút cầm tay.
Cọng rạ 0,25 ml, dài 13 cm, một đầu đợc nút
bởi bột dính. Khi nạp để lại 1 đoạn trống ở đầu
kia và hàn kín bằng máy ép nhiệt. In các thông
tin cá nhân và thời hạn bảo quản bằng máy in

(chỉ số tinh trùng di động tiến tới nhanh và chậm sau bảo quản)
Tỷ lệ % tinh trùng di động tiến tới nhanh và chậm sau bảo quản
CSF
2
=
Tỷ lệ % tinh trùng di động tiến tới nhanh và chậm trớc bảo quản
X 100`
CSF
3
(chỉ số tinh trùng sống sau bảo quản)
Tỷ lệ % tinh trùng sống sau bảo quản
CSF
3
=
Tỷ lệ % tinh trùng sống trớc bảo quản
X 100`
III. Kết quả
Chất lợng tinh trùng bảo quản bằng nitơ lỏng (-196
0
C) đợc đánh giá theo các chỉ số CSF
1
,
CSF
2
và CSF
3
ở các khoảng thời gian sau bảo quản 1, 2, 30 và 90 ngày. Kết quả đợc trình bày ở
các bảng sau.
Bảng 1. Chỉ số chất lợng tinh trùng (CSF
1,2,3

p
II,III
> 0,05

CSF
2
(DĐ nhanh & chậm)

40,0 18,6

69,0 15,2

62,3 16,5
p
I,II
< 0,01
p
I,III
< 0,01
p
II,III
> 0,05

CSF
3
(TT sống)

58,0 17,5

76,0 13,5

Glycerol
(I)
GEYC
(II)
Sperm freeze
(III)
So sánh
(p)
CSF
1
(Di động nhanh)

16,7 14,2

52,3 18,3

55,3 20,3
p
I,II
< 0,01
p
I,III
< 0,01
p
II,III
> 0,05

CSF
2
(DĐ nhanh &chậm)

< 0,05
p
II,III
> 0,05
Kết quả trên cho thấy, sau hai ngày bảo quản, chất lợng tinh trùng đợc đánh giá theo các chỉ
tiêu vẫn đợc duy trì tơng ứng nh sau một ngày.
5
TCNCYH-2003
Bảng 3. Chỉ số chất lợng tinh trùng (CSF
1,2,3
) ở khoảng thời gian bảo quản 30 ngày:

X

SD.
Môi trờng
Chỉ số %
Glycerol
(I)
GEYC
(II)
Sperm freeze
(III)
So sánh
(p)
CSF
1
(Di động nhanh)
17,7 15,5 55,7 23,0 50,0 20,3
p

65,7 14,5
p
I,II
< 0,01
p
I,III
< 0,05
p
II,III
< 0,05
Kết quả trên cho thấy sau 30 ngày bảo quản, chất lợng tinh trùng vẫn đợc duy trì với các chỉ
số đánh giá môi trờng GEYC vẫn cao hơn so với môi trờng Sperm freeze. Tuy nhiên chỉ số CSF
2
,
CSF
3
còn cao hơn với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05.
Bảng 4. Chỉ số chất lợng tinh trùng (CSF
1,2,3
) ở khoảng thời gian bảo quản 90 ngày: X

SD.
Môi trờng
Chỉ số %
Glycerol
(I)
GEYC
(II)
Sperm freeze
(III)

p
I,II
< 0,01
p
I,III
< 0.05
p
II,III
< 0,05

CSF
3
(TT sống)

54,0 15,9

73,7 13,8

67,3 15,3
p
I,II
< 0,01
p
I,III
< 0.05
p
II,III
> 0,05
Kết quả trên cho thấy sau 90 ngày bảo quản,
môi trờng GEYC vẫn duy trì đợc các chỉ số

đạt trên mức 50%, nhng không vợt quá 76%.
- Chỉ số CSF
1
và CSF
2
ở tất cả các giai
đoạn bảo quản khi dùng môi trờng đơn thuần
glycerol đều ở mức dới 50%.
- ở tất cả các giai đoạn bảo quản, dùng môi
trờng hỗn hợp GEYC và Sperm freeze, các
chỉ số CSF
1
, CSF
2
và CSF
3
đều cao hơn có ý
nghĩa thống kê so với dùng môi trờng glycerol.
- Có sự khác biệt nhng cha có ý nghĩa
thống kê về chỉ số CSF
1
, khi dùng môi trờng
GEYC và Sperm freeze ở tất cả các giai đoạn
bảo quản; trong khi đó chỉ số CSF
2
và CSF
3

6
TCNCYH-2003

tỉ lệ tinh trùng di động tiến tới trớc, tỉ lệ tinh
trùng có hình thái bình thờng. Chúng tôi cho
rằng với những mục tiêu nghiên cứu đã đặt ra,
việc chọn mẫu nghiên cứu nh vậy là phù hợp.
Về thời gian bảo quản (hay thời điểm lấy
mẫu sau bảo quản để đánh giá) ở công trình
này là 1, 2, 30 và 90 ngày. Đây là những mốc
thời gian bảo quản ngắn. Theo chúng tôi có thể
phù hợp với liệu trình điều trị cho các cặp vô
sinh mà các nhà lâm sàng áp dụng nh lọc rửa
tinh trùng bơm vào buồng tử cung, thụ tinh
trong ống nghiệm Những nghiên cứu bảo
quản tinh trùng dài ngày sẽ đợc thực hiện tiếp
tục sau công trình nghiên cứu này.
Theo tiêu chuẩn của Hiệp hội ngân hàng
Mô Hoa Kỳ [5], chỉ số tinh trùng di động sau
bảo quản CSF là từ 50% trở lên thì đợc coi là
mẫu tinh dịch đợc bảo quản thành công. Chỉ
số này tơng ứng với chỉ số CSF
1
và CSF
2
mà
chúng tôi đặt ra trong công trình nghiên cứu
này. Theo chúng tôi, chỉ số CSF
1
(tinh trùng di
động tiến tới trớc nhanh, sau bảo quản đông
lạnh) là chỉ số có giá trị thực tế nhất, cần đợc
đặt ra khi xác định chất lợng của một mẫu sau

- Căn cứ tiêu chuẩn của Hiệp hội ngân hàng
Mô Hoa Kỳ, cả 3 môi trờng đều đạt chỉ số CSF
3

trên 50%; riêng với môi trờng glycerol đơn thuần
ở giai đoạn bảo quản 30 ngày, chỉ số này chỉ đạt
49%. Nếu căn cứ vào chỉ số CSF
1
và CSF
2
, môi
trờng GEYC và Sperm freeze đều đạt mức trên
50% ở tất cả các giai đoạn bảo quản, trong khi
đó dùng môi trờng glycerol đơn thuần hai chỉ số
này chỉ đạt mức thấp dới 40%, sự khác biệt này
có ý nghĩa thống kê. Từ những nhận xét trên,
chúng tôi cho rằng dùng hai môi trờng GEYC và
Sperm freeze để bảo quản lạnh sâu tinh trùng rõ
ràng có hiệu quả hơn so với dùng môi trờng
glycerol đơn thuần.
7
TCNCYH-2003
2. Quy trình bảo quản tinh trùng ngời bằng
lạnh sâu dùng môi trờng GEYC và Sperm
freeze có hiệu quả với chỉ số CSF 50%.
- So sánh các chỉ số CSF
1
giữa 2 môi truờng
hỗn hợp ở cả 4 giai đoạn, tuy có khác biệt nhng
không có ý nhĩa thống kê. Đồng thời, sự khác biệt

tự pha, giá thành hạ, nhng muốn làm sạch môi
trờng để có tinh trùng cần phải ly tâm tách phần
nhằm tách hoàn toàn môi trờng, đặc biệt là các
hạt lòng đỏ trứng.
2. Hồ Mạnh Tờng, Nguyễn Thị Mai, Lại
Văn Tám (2000). Trữ lạnh tinh trùng ngời
trong thụ tinh nhân tạo. Thời sự Y dợc học. Bộ
V (1), tr: 8-10
3. Foote RH; McGonagle; Goldstein M;
Feldschuh J (2002). The influence of
cryoprotective media and processing
procedures on motility and migration of frozen
thawed human sperm. Asian J Androl, 4(2),
pp: 137 41.
4. Hollanders J.M., Carver Ward J.A.
(1996). Male Infertility from A to Z. Studies in
profertility series. The Parthenon publishing
Group, Vol. 4, p. 32-33.
III. kết luận:
Nghiên cứu bảo quản tinh trùng ngời, mẫu
có tinh dịch đồ trong giới hạn bình thờng bằng
nitơ lỏng (- 196
0
C) với 3 môi trờng glycerol,
GEYC và Sperm freeze, chúng tôi có những
kết luận sau:
5. J.K.Sherman (1990). Cryopreservation of
human semen. CRC Handbook of the
Laboratory Diagnosis and Treatment of
Infertility. pp: 229-258.