i
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN BÙI THỊ THU CÚC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CHẾ BIẾN THỦY SẢN
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CHẾ BIẾN THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
Th.S VƯƠNG THANH TÙNG

2009
MỨC ĐỘ TỒN LƯU CỦA MALACHITE GREEN
VÀ LEUCOMALACHITE TRONG NGUYÊN
LIỆU CÁ TRA

iii


Chân thành cảm ơn đến thầy cô giảng dạy bộ môn Dinh Dưỡng và Chế
Biến đã truyền đạt những kiến thức quý báu và bổ ích. Cảm ơn đến chị Lương
Diễm Trang học viên cao học K13 và anh Nguyễn Thanh Phong cán bộ phòng
thí nghiệm đã nhiệt tình giúp đỡ thực hiện các thao tác thực nghiệm cho tôi hoàn
thành đề tài.
Cám ơn cha mẹ và gia đình đã quan tâm, chăm sóc và tạo mọi điều kiện
thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập cũng như trong thời gian thực hiện đề tài
này.
Gởi lời cảm ơn và chúc thành công đến tất cả các bạn lớp Chế Biến Thủy
Sản K31, những người luôn giúp đỡ tôi trong khi thực hiện đề tài.
Cần Thơ, tháng 05 năm 2009
Sinh viên thực hiện

Bùi Thị Thu Cúc ii
TÓM TẮT
Trong tình hình hiện nay, xuất khẩu thủy sản của nước ta phải đối mặt với
một vấn đề khó khăn rất lớn, đó là vấn đề dịch bệnh và dư lượng hóa chất, kháng
sinh trong thủy sản. Dư lượng các hóa chất, kháng sinh còn tồn đọng trong thủy
sản rất có hại đối với sức khỏe con người và nền kinh tế nước nhà. Vì vậy, việc
xác định “mức độ tồn lưu của Malachite green và Leucomalachite trong nguyên
liệu cá tra” được thực hiện nhằm mục đích xác định thời gian tồn lưu của
Malachite green và Leucomalachite trong cá tra. Đề tài bao gồm hai thí nghiệm:
Thí nghiệm (1) Khảo sát các phương pháp kiểm tra dư lượng kháng sinh
MG trong cá tươi bằng sắc kí lỏng cao áp ghép khối phổ. Từ đó, có thể chọn ra

lượng tối đa của MG và LMG (không được vượt quá hai phần tỉ (ppb)) trong sản
phẩm thủy sản của các quốc gia trong khối Liên hiệp Âu Châu và Úc Châu
(Quyết định số 2002/657/EC ngày 22/12/2003). Sau 56 ngày sau gây nhiễm thì
nồng độ MG vẫn còn tồn lưu trên cá tra với nồng độ thấp (0,31-2,42 ppb).

iii
CÁC TỪ VIẾT TẮT
MG Malachite green
LMG Leucomalachite green
MW Molecular Weight
MF Chemical Formula
ppb Parts per billion
ppm Parts per million
ng Nanogram
µm Micrometer
HPLC High pressure Liquid chromatography
MS Mass spectrometry
LC-MS Liquid chromatography- Mass spectrometry
EU Thị trường Châu Âu
BTS Bộ Thủy Sản
GDP
Gross Domestic Product
v
DANH SÁCH BẢNG

Bảng 4.1: Tín hiệu trên máy LC-MS đọc được ứng với nồng độ chuẩn

33

Bảng 4.2: Kết quả phân tích các mẫu khi thêm chuẩn MG, LMG 39 ppb

34

Bảng 4.3: Kết quả phân tích các mẫu khi thêm chuẩn 39 ppb MG và LMG

35

Bảng 4.4: Kết quả phân tích các mẫu khi thêm chuẩn 39 ppb MG, LMG

36

Bảng 4.5: Sự tồn lưu của MG và LMG theo thời gian thí nghiệm

37

Bảng 4.6: Sự tồn lưu của MG theo thời gian thí nghiệm

39


1.3 Nội dung nghiên cứu

2

1.4 Thời gian thực hiện

2

CHƯƠNG 2 3
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
2.1 Tìm hiểu về malachite green

3

2.1.1 Sơ lược về malachite green

3

2.1.2 Tình hình sử dụng MG

4

2.1.3 Các ứng dụng của Malachite green

5

2.1.4 Tác hại của Malachite green

6



2.3.3 Phương pháp xác định dư lượng MG và LMG trong cá hồi Bắc Mỹ
bằng sắc ký lỏng và sắc ký lỏng ghép với phổ khối lượng

11

2.4 Mức độ tồn lưu của chất kháng sinh

11

2.5 Một số qui định của các quốc gia về việc cấm sử dụng một số loại thuốc
và hoá chất

12

CHƯƠNG 3 14
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 14
3.1 Phương tiện nghiên cứu

14

3.1.1 Địa điểm

14

3.1.2 Nguyên vật liệu

14

3.1.3 Thiết bị và dụng cụ

33

4.2 Khảo sát các phương pháp kiểm tra dư lượng kháng sinh MG trong cá tra
bằng sắc kí lỏng cao áp ghép khối phổ

33

4.2.1 Phương pháp 1: Xác định dư lượng MG và LMG trong nguyên liệu cá
tra bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép với phổ khối lượng (LC-MS)

34

4.2.2 Phương pháp 2: Xác định dư lượng MG và LMG trong nguyên liệu cá
tra bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép với phổ khối lượng (LC-MS)

35

4.2.3 Phương pháp 3: Xác định dư lượng MG và LMG trong nguyên liệu cá
tra bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép với phổ khối lượng (LC-MS)

36

4.3 Sự tồn lưu MG và LMG trên cá Tra giống

37

4.3.1 Sự tồn lưu của MG + LMG 37
4.3.2 Sự tồn lưu của MG 39
4.3.3 Sự tồn lưu của LMG 40
CHƯƠNG 5 42

cá da trơn, cá rô phi và cá trê xuất khẩu sang thị trường Châu Âu của các doanh
nghiệp ở An Giang, Đồng Tháp…bị trả về do phát hiện chất MG. Chỉ riêng năm
2005, EU đã phát hiện 12 lô hàng về dư lượng MG. Tất cả lô hàng bị phát hiện
đều bị trả lại Việt Nam. Điều này ảnh hưởng nghiêm trọng đến ngành xuất khẩu
thủy sản trong nước và đời sống của người dân lao động nước ta.
Việc xác định được dư lượng các chất kháng sinh còn tồn lưu trong các
loài động vật thủy sản cũng đã được nghiên cứu nhiều trong và ngoài nước,
nhưng sự tồn lưu MG trong cá tra, ứng với điều kiện nuôi ở Đồng Bằng Sông
Cửu Long thì ít được nghiên cứu. Nên những thông số về “mức độ tồn lưu
Malachite green và Leucomalachite green trong nguyên liệu cá tra” rất cần thiết
cho người nuôi cũng như nhà chế biến.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Thông qua việc phân tích dư luợng MG trong nguyên liệu cá tra sau các
giai đoạn lây nhiễm, đề tài nhằm xác định thời gian tồn lưu của hoá chất MG 2
trong nguyên liệu cá tra. Từ đó có thêm thông tin cho các nhà nuôi trồng và chế
biến trong việc hướng tới việc sử dụng hoá chất, kháng sinh hiệu quả và an toàn
để nâng cao chất lượng và độ an toàn nguyên liệu cá tra trước khi đưa vào chế
biến.
1.3 Nội dung nghiên cứu
Khảo sát các phương pháp kiểm tra dư lượng kháng sinh MG trong cá tươi
bằng sắc kí lỏng cao áp ghép khối phổ.
Thí nghiệm xác định thời gian tồn lưu của MG và LMG trong cá tra.
1.4 Thời gian thực hiện
Từ tháng 01/2009 đến tháng 05/2009.

0,002 mg/kg. Hoa Kỳ, Canada, cũng như hầu hết các quốc gia khác trên thế giới
trong đó có Trung Quốc và Việt Nam thì không chấp nhận sự hiện diện của bất kì
1 dư lượng nào dù thật thấp của MG và LMG.
2.1.1.1 Malachite green là gì?
Malachite green (còn gọi là xanh malachite) có tên khoa học là
Triphenylmethane. MG là một hoá chất thường ở dạng bột mịn, có màu xanh, hay
dùng để nhuộm các nguyên vật liệu như da, sợi và giấy trong ngành sản xuất công
nghiệp. Ngoài ra MG cũng được dùng trong phòng thí nghiệm để nhuộm vi khuẩn
và bào tử của nó. Từ lâu, MG đươc xem là chất diệt nấm (loại saprolegnia ssp) và
diệt kí sinh trùng nhóm nguyên sinh vật (protozoa).
Leuco malachite green được sinh ra từ sự khử malachite green bới các
enzyme trong cá, một hợp chất chuyển hoá rất bền của MG. LMG được tích luỹ
bên trong, vỗ béo cơ thịt, tồn trữ lâu dài trong cơ thịt của cá.
2.1.1.2. Công thức cấu tạo của Malachite green và Leucomalachite green.
N
CH
3
N CH
3
CH
3
H
3
C
N
CH
3
N CH
3
CH

IUPAC: 4-[(4-dimethylaminophenyl)-phenyl-methyl]-N,N-dimethyl-
aniline
MW: 330,466
MF: C
23
H
26
N
2

2.1.2 Tình hình sử dụng MG
2.1.2.1 Tình hình sử dụng MG trên thế giới
Trong các thập niên qua ngành nuôi trồng thủy sản trên thế giới có những
bước tiến vượt bậc. Do việc áp dụng kĩ thuật nuôi mới, nuôi thâm canh mật độ
cao để gia tăng năng suất, sản lượng, nạn dịch bùng phát, ô nhiễm môi trường làm
cho thủy sản chết hàng loạt, vì thế người nuôi luôn tìm biện pháp khắc phục và
việc sử dụng thuốc, hóa chất trong công việc phòng và trị bệnh là rất hữu hiệu.
Tháng 6/2005, các cơ quan chức năng Trung Quốc đã phát hiện thấy một
vài tỉnh vẫn còn sử dụng và chính các chuyên gia nước này thừa nhận, lâu nay
MG vẫn được sử dụng rộng rãi tại các cơ sở nuôi như 1 chất diệt nấm. Nguyên
nhân là do loại chất này có giá rẻ, khoảng 30 NDT/kg và rất dể mua.
(www.vietnam.net).
Theo bộ nghề cá và hàng hải Hàn Quốc (MMAF), MG đã được tìm thấy
trong các trại nuôi cá Hồi và cá Chép ở tám vùng của Hàn Quốc. Trong các ngày
từ 15/9 đến 3/10/2005, cục thanh tra chất lượng thủy sản quốc gia Hàn Quốc
(NEPQIS) đã tiến hành kiểm tra khắp các trại nuôi cá nước ngọt và nước lợ trên
cả nước và đây là lần đầu tiên Hàn Quốc phát hiện thấy MG trong các trại nuôi cá
ở nước này. Lượng hóa chất dao động từ 0,1-3 ppm (www.Intrafish.com)
2.1.2.2 Tình hình sử dụng MG ở Việt Nam
Sau khi hàng loạt lô hàng thủy sản của Việt Nam bị các nước nhập khẩu

Trong ngành công nghiệp MG hay dùng để nhuộm các nguyên vật liệu như
da, tơ, sợi và giấy. Ngoài ra MG cũng được dùng trong phòng thí nghiệm để làm
dung dịch nhuộm vi khuẩn, và bào tử của nó, làm chỉ thị màu pH, vàng (axit),
xanh lục (kiềm).
2.1.3.2 Trong thủy sản
Chất MG đã được giới nuôi trồng thủy sản trên thế giới sử dụng 1 cách
rộng rãi từ lâu và được dùng rất phổ biến trên thế giới để xử lý nước và để sát
nấm cũng như để sát kí sinh trùng nhóm nguyên sinh vật (protozoa) và các bệnh
nấm kí sinh trùng trên trứng cá, cá và các loại sò hến (loài nhuyễn thể) như phòng
trị các bệnh nấm mi, bệnh trùng quả dưa….Đó là một loại thuốc trừ nấm rất công
hiệu và thường được dùng để tẩy trùng trong các hồ gây cá giống và trong các mô
hình nuôi trồng thủy sản. 6
2.1.4 Tác hại của Malachite green
Khi vào cơ thể cá, MG sẽ bị phân hủy thành chất chuyển hóa (metabolite)
là Leucomalachite Green. Thời gian đào thải của MG nhanh, ngược lại chất LMG
có thể tồn tại trong thời gian rất lâu trong thịt và nhất là trong mỡ của cá đã bị
nhiễm MG.
Độc tính của MG có liên hệ tới nhiệt độ nước. Ở nhiệt độ thấp, cá có thể
chịu đựng được nồng độ thuốc cao hơn ở nhiệt độ cao, và thời gian tiếp xúc tăng
sẽ dẫn đến độ độc tăng lên một cách rõ rệt. Dĩ nhiên ở các nước nhiệt đới sử dụng
MG vào lúc sáng sớm khi nhiệt độ nước chưa tăng cao là tốt nhất. Đặc biệt trong
các tháng mùa hè nóng bức, thời gian tiếp xúc khi xử lý MG nên giảm xuống. (Lê
Kim Liên, Nguyễn Quốc Thịnh, 2004).
2.1.4.1 Tác hại đối với con người

nuôi trồng thuỷ sản từ năm 1936 (Foster and Woodurg, 1936). Nó được sử dụng
để trị bệnh ký sinh trùng ngoài da, nấm, những bệnh do các động vật nguyên sinh
gây ra ( bệnh protozoa) trong cá và trứng cá. Cho đến ngày nay, nó vẫn còn là
một trong những hoá chất có hiệu quả nhất cho mục đích này và được sử dụng
phổ biến trên toàn thế giới.
2.1.6 Chất thay thế malachite green
Để giải quyết tạm thời vấn đề cần phải có những chất khác thay thế MG
trong công tác phòng trị bệnh trên các loài thủy sản. BRONOPOL là chất có tác
dụng diệt kí sinh trùng trên cá thay thế MG. Đây là chất được EU cho phép sử
dụng trị bệnh cho cá từ năm 2001 và không qui định giới hạn về dư lượng. Theo
đánh giá của cơ quan bảo vệ Môi Trường Hoa Kì (EFA) thì Bronopol không là
chất gây ung thư, có thể làm chất tẩy trùng, diệt khuẩn.
Chất bronopol có công thức hóa học: C
3
H
6
BrNO
4
. Tên hóa học của chất
này là 2-Bromo-2-Nitropropane-1,3-Diol. Bronopol được cung cấp ra thị trường
với các tên thương mại như: Pyceze, Onyxide 500…. Nhằm mục tiêu phát triển
xuất khẩu thủy sản ổn định trong thời gian tới, thiết nghĩ các hộ nuôi thủy sản cần
tuân thủ nghiêm các qui định của nhà nước và các cơ quan chuyên môn trong việc
sử dụng hóa chất và kháng sinh trong thủy sản để đảm bảo uy tín, chất lượng và
giữ vững thương hiệu, đồng thời tránh ra các thiệt hại lớn về kinh tế do bị phát
hiện có dư lượng cá hóa chất và kháng sinh có hại trong các lô hàng thủy sản xuất
khẩu. (Sở Nông Nghiệp An Giang, 2/2/2005).
2.2 Nguyên liệu cá tra
2.2.1 Đặc điểm sinh học của cá tra
Cá Tra (Pangasius hypophthalmus) là một trong những đối tượng nuôi

Kích thước thu hoạch: 30 – 40 cm, lớn nhất 90 cm.
Sản phẩm xuất khẩu: dưới dạng nguyên con, philê đông lạnh, các mặt hàng
chế biến và hàng giá trị gia tăng.

2.2.2 Tình hình phát triển ngành nuôi cá tra
Trong họ cá tra có một số loài được nuôi trong hồ từ lâu đời, đặc biệt là cá
tra (cá tra nuôi). Ngày nay ngành cá nuôi trở thành một công nghiệp nuôi và chế
biến mà họ cá tra là trọng điểm. Trên đà nghiên cứu cho ngành cá nuôi có rất
nhiều báo cáo về môi trường sống, thức ăn của họ cá tra trong điều kiện thiên
nhiên và trong điều kiện "gia ngư hóa".
Hình thức nuôi: Nuôi thâm canh, bán thâm canh với các mô hình nuôi bè,
nuôi trong ao hầm.
Hình thức khai thác: Lưới, rùng, đăng, vó.
2.3 Các phương pháp xác định dư lượng Malachite green
MG là một thuốc sát trùng không đắt, được sử dụng có hiệu quả trong
ngành nuôi cá từ những năm 30, chủ yếu trong những nước Châu Á. Việc sử dụng 9
MG được xem là bất hợp pháp, bởi vì có liên quan đến những tác hại lâu dài đối
với con người.
Do đó, đã có rất nhiều phương pháp kiểm tra dư lượng MG và hợp chất
chuyển hóa của nó là LMG trong các sản phẩm cá. Nhưng theo sự quyết định của
Hội đồng Châu Âu EC / 657 / 2002, một phương pháp kiểm nghiệm có thể được
tiến hành, phải có độ phát hiện tổng hàm lượng MG và LMG trong thịt cá là 2
µg/kg. Theo Julie Kowalski, một nhà hóa học nhiều sáng kiến, đã đưa ra một
phương pháp đo sắc ký chung để xác định dư lượng MG và LMG. Đó là phương

3
H
3
C
Cl
-
Reduction
Oxidation
- HCl
Malachite green (MG)
Leucomalachite green (LMG)

LMG sau khi chuyển về dạng MG cũng được xác định trên sắc đồ, MG
này có thể được phân biệt với MG trước bởi thời gian lưu khác nhau. 10
Detector phát phổ huỳnh quang được gắn vào đường dẫn dung môi rửa
giải, để phát hiện ra LMG bởi sự kích thích phát xạ ở 265 nm và sự phát xạ ở 360
nm.
Với phép ghi phổ khối lượng cho phép phát hiện cả hai hợp chất mà không
sự oxi hóa hoặc sử dụng hai detector.
Sau đây, một vài phương pháp xác định dư lượng MG và chất chuyển hóa
của nó trong cá của nhiều nhóm tác giả:
∗ Phương pháp xác định dư lượng malachite green và leucomalachite
green trong nguyên liệu cá tra bằng sắc kí lỏng ghép với phổ khối lượng (LC-
MS/MS). Nhóm tác giả Van de Riet JM, Murphy CJ, Pearce JN, Potter RA,

với sự oxi hóa LMG
Một phương pháp sắc ký lỏng (LC) khác đã được tìm ra để xác định dư
lượng MG trong cá bởi nhóm tác giả: Andersen WC, Roybal JE, Turnipseed SB.
Dư lượng MG và LMG được trích từ thịt cá hồi bằng dung dịch đệm acetate và
acetonitrile. Tiếp theo, dịch trích được chiết tách lại bằng dichloromethane. LMG
sẽ bị oxi hóa trở về dạng MG bằng phản ứng với 2,3-dichloro-5,6-dicyano-1,4-
benzoquinone. Mẫu phân tích được làm sạch hơn bằng sự chiết với pha rắn gồm
alumina và propylsulfonic acid. Cuối cùng, dịch chiết được phân tích bằng LC
với bước sóng phát hiện ở 618 nm sử dụng cột rửa giải phân tách C18. Phương
pháp đã phân tích được 35 mẫu cá hồi nuôi với sự thêm chuẩn ở 1, 2, 4, và 10
ng/g (ppb) thì có được hiệu suất thu hồi trung bình là 95,4 %, độ sai số ± 11,1 %.
Với 5 mẫu cá hồi trong hộp với sự thêm chuẩn ở 10 ng/g thì hiệu suất thu hồi
trung bình là 88,9 %, độ sai số ± 2,6 %. Giới hạn phát hiện của phương pháp này
là 1 ng/g.
2.3.3 Phương pháp xác định dư lượng MG và LMG trong cá hồi Bắc Mỹ
bằng sắc ký lỏng và sắc ký lỏng ghép với phổ khối lượng
Phương pháp xác định dư lượng MG và LMG trong cá hồi Bắc Mỹ bằng
sắc ký lỏng được báo cáo bởi nhóm tác giả: Halme K, Lindfors E, Peltonen K , có
giới hạn phát hiện tương ứng là 0,8 và 0,6 µg/kg. Hai hợp chất trên được chiết với
một hỗn hợp dung dịch đệm acetate-acetonitrile và được chiết tách lại trong
methylene chloric. Sử dụng hệ thống chiết pha rắn tự động gồm những cột chiết
chứa pha rắn acid propylsufonic và alumina để làm sạch dịch chiết. Sự phân tách
MG và LMG hoàn toàn trên cột Chrompher 5B, sử dụng pha động là dung dịch
đệm acetate-acetonitrile. LMG được chuyển về dạng MG bằng phản ứng sau cột
trước khi đo phổ ở bước sóng 600 nm. Hiệu suất thu hồi của MG và LMG trong
một dãy mẫu kiểm soát có thêm chuẩn từ 2 đến 50 µg/kg tương ứng là 65 %
(trong dãy 63,4 – 65,9 %, độ sai số 3,9 – 16,1 %) và 74 % (trong dãy 58,3 – 82,6
%, độ sai số 3,3 – 11,4 %).
Việc xác định dư lượng các cặn bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép với
phép ghi phổ khối lượng, phương pháp này có giới hạn phát hiện là 2,5 và 1

tràn lan, Bộ Thủy Sản đã ra quyết định số 07/2005/QĐ-BTS ngày 24/2/2005 về
ban hành danh mục hoá chất, kháng sinh cấm và hạn chế sử dụng trong sản xuất,
kinh doanh thủy sản; Chỉ đạo các cơ quan Báo, Đài tại địa phương tuyên truyền
về tác hại của các loại thuốc thú y, hoá chất, kháng sinh trong danh mục hạn chế
sử dụng và cấm sử dụng theo quy định của Bộ Thủy sản, đặc biệt là MG
(http://www.fistenet.gov.vn cập nhật ngày 27/9/2006).
Khối EU có những qui định nghiêm ngặt cho phép sử dụng kháng sinh,
hoá chất trong nuôi trồng thủy sản, Theo chỉ thị EC số 2377/90 qui định danh
mục cấm sử dụng gồm 10 kháng sinh và 01 hoá chất Malachite green, 31chất hạn
chế sử dụng (Theo website:http://www.nafiqaved.gov.vn/ NAFIQAVED cập nhật
ngày 25/3/2006). 13
Mỹ là Quốc gia có qui định nghiêm ngặt về việc cho phép sử dụng thuốc,
hoá chất trong nuôi trồng thủy sản. Danh mục các chất cấm sử dụng là 11 chất
(http://www.nafiqaved.gov.vn. NAFIQAVED, cập nhật ngày 7/9/2006).
Theo qui định của Bộ Thủy sản (2001) thì thời gian ngưng sử dụng kháng
sinh trước khi thu hoạch 28 ngày trở lên. Nhiều tài liệu cho thấy chất MG tồn lưu
trong cá Chình nuôi sau khi trị bệnh không dưới 100 ngày, với cá Hồi chấm
không dưới 10 tháng. (Raoul et al, 2002). 14

Cá được chọn là sạch bệnh, không nhiễm MG. Tiến hành gây nhiễm bằng
cách cho trực tiếp MG và LMG với nồng độ 1 ppm vào mẫu cá sau khi chuẩn bị
mẫu xong để phân tích.
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí với 1 nhân tố với 2 lần lặp lại.
Nhân tố phương pháp kiểm tra dư lượng MG trong nguyên liệu cá tra.
M
1
: Phương pháp 1
M
2
: phương pháp 2
M
3
: phương pháp 3
Số nghiệm thức: 3 nghiệm thức.
Số mẫu thí nghiệm: 3 nghiệm thức × 3 lần lặp lại = 9 mẫu.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Cá tra

Chuẩn bị mẫu

Nghiền đồng nhất mẫu M
1