12
TCNCYH 34 (2) - 2005
Phát hiện một trờng hợp đột biến lặp đoạn exon 2
xảy ra trong quá trình sao chép gen dystrophin ở
bệnh nhân loạn dỡng cơ Duchenne.
Trần Vân Khánh
1
Và Tạ Thành Văn
2
1
, Viện Công nghệ sinh học, Trung tâm Khoa học tự
nhiên và Công nghệ Quốc gia
2
, Bộ môn Hóa-Hóa sinh, Trờng Đại học Y khoa Hà nội.
Gen dystrophin là một gen có cấu trúc rất dài, điều này đã làm cho quá trình phiên
mã của gen trở nên phức tạp hơn, đặc biệt là ở đầu gen 5. Trong nghiên cứu này chúng
tôi công bố một bệnh nhân loạn dỡng cơ Duchenne có đột biến lặp đoạn exon 2. Điều
rất đáng chú ý là đột biến này không xuất hiện ở ADN (genome). Chính vì vậy, chúng tôi
giả thiết rằng đây là kết quả của quá trình trans-splicing xảy ra trong quá trình sao chép
của gen dystrophin. Nguyên nhân và cơ chế của hiện tợng này cha đợc biết rõ ràng
và hiện đang đợc tiếp tục nghiên cứu.
I. Đặt vấn đề
Duchenne là một loại bệnh gây nên do
đột biến gen dystrophin. Đây là một gen
lớn có chiều dài khoảng 3000 kb, nằm
trên nhiễm sắc thể X, mã hóa 14 kb
mARN là hợp phần của 79 exon [1, 2].
Hơn 90% trình tự gen là tổ hợp các intron,
một vài intron có chiều dài rất lớn điển
hình là intron 2 (khoảng 157 kb). Tại đây

trình hoàn thiện các tiền mARN. Trong
nghiên cứu này chúng tôi công bố một
bệnh nhân loạn dỡng cơ Duchenne có
đột biến lặp đoạn exon 2. Điều rất đáng
chú ý là đột biến này không xuất hiện ở
ADN. Chính vì vậy, chúng tôi giả thiết
rằng đây là kết quả của quá trình trans-
splicing xảy ra trong quá trình sao chép
của gen dystrophin.

13
II. Đối tợng và phơng pháp
nghiên cứu
2.1. Đối tợng
Bệnh nhân DMD đợc chẩn đoán dựa
vào những triệu chứng lâm sàng và cận
lâm sàng điển hình: yếu cơ có tính chất
tiến triển, phì đại cơ cẳng chân, mất khả
năng đi lại ở tuổi 12, nồng độ CK tăng
cao trong máu ngoại vi và sinh thiết cơ có
hình ảnh điển hình của bệnh.
2.2. Phơng pháp nghiên cứu
ADN đợc tách chiết từ máu ngoại
biên theo qui trình phenol/chloroform
chuẩn. Để xác định đột biến xóa đoạn,
lặp đoạn hay thêm đoạn ở mức độ ADN,
phơng pháp Southern blot đã đợc tiến
hành dựa theo quy trình của một báo cáo
trớc đây [2]. mARN tổng số đợc tác
chiết từ máu ngoại biên và tổng hợp

ở vùng 5 của gen này có 2 vạch tơng
ứng với 2 sản phẩm PCR có kích thớc
lớn hơn bình thờng. Sự thay đổi này gợi
ý có sự đột biến thêm đoạn tại vùng gen
tại đầu 5. Với mục đích định vị chính xác
vùng đột biến, chúng tôi đã sử dụng thêm
một cặp mồi khác khuyếch đại vùng gen
nhỏ hơn kéo dài từ exon 1 đến exon 4,
sau đó chạy điện di trên gel với nồng độ
agarose cao (3%) nhằm mục đích phân
tách các sản phẩm PCR. Hai sản phẩm
PCR đợc xác định có kích thớc là 387
bp và 287 bp (hình 1a). Trình tự của các
nucleotide của sản phẩm PCR này đã
khẳng định rằng đầu 3 của exon 2 gắn
trực tiếp với đầu 5 của một exon 2 khác
gây ra hiện tợng lặp một đoạn của exon
này, bên cạnh đó 162 bp của exon X
cũng đợc xác định. Đoạn này nằm giữa
exon 1 và exon 2 (hình 1b). C P Mk
1c-c4r

Sản phẩm PCR
bình thờng
tơng ứng với
mẫu đối chứng.
} B
Exon X
Exon 1 Exon 2 Exon 2 13
Hình 1: A, Sản phẩm khuyếch đại của cADN kéo dài từ exon 1 đến exon 4. Hai sản phẩm
(387 và 287 bp) đợc khuyếch đại từ mẫu cADN của bệnh nhân (dòng P), cả 2 sản phẩm này
đều có kích thớc lớn hơn so với mẫu đối chứng ( 225 bp - dòng C); C, mẫu đối chứng của
ngời bình thờng; P, bệnh nhân. Mk: Marker Hae III-digested Ô 174 phage ADN. B, Trình tự
của vùng đột biến lặp đoạn exon 2 (gi:M18533) và exon X (gi: 306722) ở đầu 5 tận của gen
dystrophin. Hình bên trái: Trình tự đầu 3 của exon 1 gắn trực tiếp với đầu 5 của exon X;
Hình bên phải: Trình tự đầu 3 của exon 2 gắn trực tiếp với đầu 5 của một exon 2 khác.


13 Hình 2. A, Kết quả lai tạo của phản ứng Southern blot sử dụng đoạn dò Bgl II. Dòng 1: sản
phẩm lai tạo của bệnh nhân; Dòng 2: sản phẩm lai tạo của mẫu đối chứng. B, Quá trình
trans-splicing. Ba mô hình trans-splicing của gen dystrophin đợc chỉ dẫn bằng các dòng
kẻ khác nhau.

IV. Bàn luận
Việc phân tích khởi đầu bằng kỹ thuật
Southern blot. Tuy nhiên đột biến vẫn
cha đợc xác định cụ thể do kỹ thuật
này chỉ dừng ở mức độ phân tích ADN.
Theo nhiều báo cáo đợc tổng kết từ
trớc đến nay thì nhiều trờng hợp đột

Đây là một pseudoexon và đợc coi nh
là một hiện tợng bình thờng trong quá
1 2
Ex 4 (12.8 kb)
B
Ex 2 (6 kb)
Ex 3 (3 kb)
1
X
23
4
1
2
2
3
4
1
X
2
2 3
4
1
2
2 3
4
1
X
4
2 2 3
4

Hiện tợng trans-splicing của gen này
lần đầu tiên đã đợc tìm thấy trên loài
khuẩn trypanosomes [8] và nó đã đợc
coi nh là một hiện tợng khác thờng
của quá trình sao chép. Tiếp sau đó nó
đợc phát hiện trên một số loại giun tròn
(nematodes) và tế bào thực vật. Điều này
chứng tỏ rằng đây là một hiện tợng khá
phổ biến và xảy ra tại rất nhiều mô khác
nhau. ở thời điểm đó, một số nhà khoa
học đã nghĩ rằng quá trình trans-splicing
có thể cung cấp cho họ những ý tởng để
nghiên cứu một số liệu pháp điều trị mới
nếu hiện tợng này chỉ xảy ra ở một số tổ
chức nhất định, đặc biệt nếu không xảy ra
trên ngời và động vật có vú. Tuy nhiên
trans-splicing sau đó lại tiếp tục đợc
phát hiện ở tế bào gan chuột bởi
Caudevilla [3]. Tác giả này đã phát hiện
ra rằng rất nhiều dạng mARN khác nhau
của gen cartidine octanoyltransferase có
hiện tợng lặp đoạn của exon 2 hay exon
2 và 3 mà không xác định đợc ở ADN.
Cho đến nay hiện tợng này cũng đã
đợc tìm thấy trên gen của ng
ời, Fluriot
đã tìm thấy hiện tợng lặp đoạn của exon
1a ở vùng 5 của gen estrogen receptor-á
mà hiện tợng này cũng không đợc xác
định ở ADN bằng Southern blot [5]. Cho

14
anthropoid evolution. Biochem biophys
Res Commun 267, 321-328, (2000).
5. Fluriot, G. Natural trans-spliced
mARNs are generated from the human
estrogen receptor-alpha (hER alpha)
gene. J Biol Chem. 277, 26244-26251,
(2002).
6. Roberts, R. G., Bentley, D. R.,
Bobrow, M. Infidelity in the structure of
ectopic transcripts: a novel exon in
lymphocyte dystrophin transcripts: Hum
Mutat 2, 293-299, (1993).
7. Suminaga, R., Takeshima, Y.,
Adachi, K., Yagi, M., Nakamura, H.,
Matsuo, M. A novel cryptic exon in intron
3 of the dystrophin gene was
incorporated into dystrophin mARN with a
single nucleotide deletion in exon 5. J
Hum Genet 47, 196-201, (2002).
8. Sutton, R. E., Boothroyd, J. C.
Evidence for trans-splicing in
trypanosomes. Cell 47, 527-535, (1986).

Summary
Repeating exon 2 mutation caused by trans-splicing dystrophin
gene in Duchenne muscular dystrophin (DMD) patient
The Dystrophin gene is the largest human gene, mutations in this gene cause
Duchenne muscular dystrophin (DMD) disease. This is complex genomic unit exhibiting
many errors splicing during mARN process. More than 10 alternative splicing products