TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN
BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN

TRẦN QUỐC TRUNG TUẤN
KHẢO SÁT TÁC NHÂN GÂY BỆNH HPV
(Hepatopancreatic parvovirus) TRÊN TÔM SÚ
(Penaeus monodon) NUÔI Ở KHU VỰC
ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN



i

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
TÓM TẮT
Kết quả của quá trình nghiên cứu là xác định sự hiện diện của HPV trên tôm
giống và tôm thịt nuôi ở một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long. Trong 265
mẫu tôm giống thu ngẫu nhiên ở 3 tỉnh (Trà Vinh, Sóc Trăng và Bạc Liêu) có
25,3% nhiễm HPV, 60% nhiễm MBV và 22,26% nhiễm kép MBV-HPV.
Không giống như tỉ lệ cảm nhiễm tự nhiên của HPV trên tôm giống, thì trên
tôm thịt nuôi ở Trà Vinh và Sóc Trăng có tỉ lệ cảm nhiễm thấp, khoảng 4,43%
tôm thịt nhiễm HPV trong tổng số mẫu là 316. Nghiên cứu được thực hiện
bằng hai phương pháp: phết mẫu tươi-nhuộm Malachite Green và phương
pháp mô học truyền thống nhuộm H&E. Bằng phương pháp phết mẫu tươi -
nhuộm Malachite Green có thể chẩn đoán được 2 bệnh MBV và HPV trong
thời gian 5 phút nhưng đối với phương pháp mô học truyền thống cần 3-4
ngày mới có kết quả. Bên cạnh đó chi phí của phương pháp phết mẫu tươi rẻ
tiền hơn, độ chính xác không chênh lệch nhiều (16,67%) so với phương pháp
mô học truyền thống. Vì vậy có thể sử dụng phương pháp phết mẫu tươi -
nhuộm Malachite Green trong việc chẩn đoán HPV trên tôm giống trước khi
thả nuôi.

2.3.5 Bệnh nhiễm trùng vi-rút dưới da và hoại tử 7
2.4 Tôm nhiễm HPV 8
2.4.1 Đặc điểm tôm nhiễm HPV 8
2.4.2 Phân loại HPV 8
2.4.3 Hình thái học của HPV 8
2.4.4 Đặc tính sinh học của HPV 9
2.4.5 Phân bố của bệnh HPV 9
2.4.6 Con đường lây nhiễm, biện pháp phòng ngừa và kiểm soát sự
lây nhiễm của HPV 9

2.4.7 Tác hại của HPV đối với tôm nuôi 10
2.5 Lịch sử mô học 11
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚU……….13
3.1 Thời gian và địa điểm…………………………………………………13
3.2 Vật Liệu nghiên cứu………………………………………………… 13
3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 13
3.2.2 Dụng cụ dùng trong nghiên cứu 13
3.2.3 Hóa chất dùng trong nghiên cứu 13
3.3 Phương pháp nghiên cứu…………………………………………… 13
3.3.1 Phương pháp thu mẫu 13
3.3.2 Phương pháp phân tích mẫu 14
3.4 Phương pháp phân tích số liệu……………………………………… 17
3.4.1 Xác định tỉ lệ cảm nhiễm 17
3.4.2 Xác định cường độ cảm nhiễm/cá thể 17
3.4.3 Phương pháp xử lý số liệu 17
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN………………………………18
4.1 Cường độ cảm nhiễm và tỉ lệ cảm nhiễm tự nhiên của vi-rút trên tôm sú
giống thả nuôi ở ĐBSCL………………………………………………….18

iii
iv

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 4.1: Kết quả cường độ cảm nhiễm trên tôm giống thu ở ĐBSCL 18
Bảng 4.2: Bảng tổng kết qui ước xác định cường độ cảm nhiễm HPV trên
tôm giống 19
Bảng 4.3: Số lượng và tỉ lệ nhiễm kép HPV và MBV trong tổng số mẫu
phân tích 21
Bảng 4.4: Tỉ lệ cảm nhiễm HPV và MBV ở 3 tỉnh Sóc Trăng, Trà Vinh
và Bạc Liêu 23
Bảng 4.5: Khối lượng và chiều dài của tôm nuôi nhiễm HPV và tôm nuôi
không nhiễm HPV 25
Bảng 4.6: Đường kính thể vùi HPV trên tôm giống 27
trên tôm giống ở độ phóng đại 40X (H&E) 27
Hình 4.6: Gan tụy tôm giống nhiễm cả hai bệnh MBV và HPV ở độ
phóng đại 100X (H&E) 28
Hình 4.7: Gan tụy tôm giống nhiễm HPV 30
Hình 4.8: Gan tụy tôm giống nhiễm kép HPV và MBV 31

vi

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
CHƯƠNG 1
GIỚI THIỆU
Thủy sản là một trong những ngành mũi nhọn của nước ta, mang lại thu nhập
cao cho người nuôi và làm giàu cho đất nước. Nghề nuôi tôm ở nước ta có từ
nhiều năm trước với hình thức nuôi chủ yếu là quảng canh, quảng canh cải
tiến nhưng với sự phát triển của khoa học kĩ thuật thúc đẩy nghề nuôi tôm theo
hướng thâm canh hóa, diện tích nuôi tôm bán thâm canh, thâm canh ngày càng
được mở rộng. Bên cạnh việc nuôi tôm thâm canh có nảy sinh những vấn đề
liên quan đến môi trường, dịch bệnh và sức khỏe tôm nuôi.

Mục tiêu của đề tài:
Xác định sự hiện diện của HPV trên tôm sú nuôi ở khu vực ĐBSCL, từ đó làm
cơ sở cho việc quản lý giống đạt hiệu quả và nâng cao hiệu quả kinh tế cho
người nuôi.
Nội dung của đề tài:
− Khảo sát cường độ cảm nhiễm, tỉ lệ cảm nhiễm HPV và tỉ lệ đa nhiễm với
MBV trên tôm giống thả nuôi ở các tỉnh giống ở Trà Vinh, Sóc Trăng và
Bạc Liêu.
− Khảo sát cường độ cảm nhiễm và tỉ lệ cảm nhiễm HPV trên tôm thịt ở Trà
Vinh, Sóc Trăng.
− So sánh kết quả kiểm tra HPV giữa 2 phương pháp phết mẫu tươi - nhuộm
bằng Malachite Green và mô học truyền thống.

2

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
CHƯƠNG 2
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Sơ lược về tình hình nuôi tôm biển
2.1.1 Tình hình nuôi tôm biển trên thế giới
Trên thế giới nghề nuôi tôm biển hiện đang phát triển mạnh và mang lại hiệu

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
thì diện tích nuôi tôm bán thâm canh và thâm canh là 7.481 ha, tăng lên 3 lần
so với năm 2003. Năng suất bình quân của mô hình cải tiến là 580 kg/ha/vụ;
bán thâm canh là 1,63 tấn/ha/vụ và thâm canh là 3,24 tấn/ha/vụ. Bên cạnh việc
nuôi tôm thâm canh thì vấn đề dịch bệnh xảy ra làm ảnh hưởng đến sản lượng
nuôi một cách đáng kể, làm thiệt hại kinh tế cho người nuôi tôm. Năm 2002,
Sóc Trăng thả nuôi 30.000 ha thì có đến 740 ha tôm bị chết từ 60-90%. Đến
giữa tháng 4/2003 tỉnh thả nuôi tôm sú trên 35.000 ha, trong đó 4.000 ha tôm
bị bệnh, riêng huyện Mỹ Xuyên bị thiệt hại tới 3.280 ha (Tin tức - thông báo,,
2007).
2.2 Tình hình dịch bệnh và tác hại do vi-rút gây ra trên tôm
Có nhiều tác nhân gây bệnh cho tôm nuôi: nấm, kí sinh trùng, vi khuẩn, vi-rút,
do dinh dưỡng hay do môi trường, trong đó vi-rút có tác hại lớn và nghiêm
trọng cho nghề nuôi tôm. Vi-rút là phần tử có mang acid nucleic (ADN hoặc
ARN) nằm trong vỏ bọc protein, có khả năng sao chép trong tế bào chủ và lan
truyền từ tế bào này sang tế bào khác, chỉ có thể quan sát được vi-rút dưới
kính hiển vi điện tử (Trần Thị Tuyết Hoa, 2004).
Hiện nay có hơn 22 loài virut được ghi nhận và mô tả trên tôm biển. Một trong
số chúng gây thiệt hại nặng cho tôm nuôi: WSSV, YHV, TSV (Taura
syndrome virus), vi-rút gây hoại tử cơ quan tạo máu (IHHNV) (Nadala et al.,
1999. Trích dẫn bởi Phạm Trần Nguyên Thảo, 2003).
Theo Sindermann, năm 1960 là năm đầu tiên công bố vi-rút gây bệnh trên giáp
xác và năm 1990 xác định bệnh do vi-rút là trở ngại lớn cho nghề nuôi tôm.
Việc chữa trị bệnh do vi-rút không có hiệu quả vì hiện nay chưa có một loại
thuốc hay hóa chất nào có thể chữa bệnh vi-rút. Vi-rút gây tỉ lệ chết cao cho ấu
trùng và đối với tôm trưởng thành sự nhiễm ít nghiêm trọng hơn (Liao et al.,
1992. Trích dẫn bởi Nguyễn Văn Hảo, 2000).
Hiện tượng tôm nuôi chết hàng loạt ở Đài Loan năm 1986 được xác định là do
MBV gây ra. Dịch bệnh đã gây thiệt hại cho nghề nuôi tôm biển ở Đài Loan
vào năm 1987-1988 làm thất thoát 80% sản lượng tôm nuôi ở quốc gia này

Theo báo cáo của Bùi Quang Tề (2003), khi phân tích mô bệnh học gan tụy
của tôm sú ở Sóc Trăng thấy xuất hiện các thể vùi của IHHNV nhưng tỉ lệ cảm
nhiễm còn thấp.
Bệnh đỏ đuôi cũng xuất hiện ở các vùng nuôi tôm của Hải Phòng và gây chết
tôm vào năm 2002-2003. Khi phân tích mô học có biểu hiện nhiễm TSV (Bùi
Quang Tề, 2003).
Trong thời gian gần đây ở Việt Nam xuất hiện một loại bệnh mới nhưng tác
hại không kém được gọi là bệnh phân trắng. Bệnh phân trắng gây ra thiệt hại
không nhỏ cho bà con nuôi tôm ở một số tỉnh miền Trung như Ninh Thuận,
Phú Yên, Bình Thuận, Bình Định, Khánh Hòa và một số tỉnh thuộc miền Tây
Nam Bộ như Bến Tre, Tiền Giang, Sóc Trăng, Bạc Liêu. Bệnh phân trắng
5

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
không xảy ra thường, chỉ xuất hiện ở những ao nuôi thâm canh, qui trình ít
thay nước. Bệnh tùy thuộc vào mùa vụ, có thể xảy ra trên cả vùng tương đối
rộng. Năm 2002 ở huyện Tuy Hòa có khoảng 450 ha ao nuôi có xuất hiện
bệnh, Khánh Hòa là 300 ha, Bình Định là 600 ha. Năm 2003 bệnh tiếp tục
phát triển lan rộng cho nhiều tỉnh như Quảng Trị, Bình Thuận. Riêng đối với
Ninh Thuận trong năm 2003 diện tích bị phân trắng trong 2 vụ lên đến 600 ha.
Theo những nghiên cứu gần đây bệnh phân trắng có thể liên quan đến HPV. Ở
Ninh Thuận phát hiện sự có mặt của vi-rút HPV trên tôm nuôi với tỉ lệ nhiễm
là 36% (Nguyễn Khắc Lâm, 2007).
2.3 Một số bệnh vi-rút thường xảy trong nuôi tôm sú ở ĐBSCL
2.3.1 Bệnh đốm trắng
Bệnh đốm trắng được xem là một bệnh nguy hiểm nhất và gây ra thiệt hại lớn
nhất cho nghề nuôi tôm sú hiện nay. Tác nhân gây bệnh là vi-rút, thuộc giống
Whispovirus và họ Nimaviridae. Tôm bị nhiễm WSSV thường có những biểu
hiện đặc trưng như kém ăn, lờ đờ, bơi dọc theo bờ ao và đặc trưng nhất là có
những đốm trắng xuất hiện trong lớp biểu bì dưới vỏ. Các đốm trắng xuất hiện

xuất hiện dấu hiện bệnh lý đầu tiên và có thể xảy ra sau khi thả giống từ 20
ngày trở đi. Đặc trưng của bệnh là cơ thể tôm có màu nhạt ở mang và gan tụy
có màu vàng nhạt. Bệnh đầu vàng bùng phát thường đi đôi với điều kiện môi
trường nuôi xấu, vì vậy sẽ rất khó xác định nguyên nhân gây chết tôm là do
môi trường nuôi xấu hay do vi-rút (Chanratchakool et al., 2002. Trích dẫn bởi
Trần Thanh Tuấn, 2006).
2.3.4 Bệnh phân trắng
Bệnh phân trắng đầu tiên do trùng hai tế bào làm tổn thương thành ruột, dạ
dày của tôm kết hợp với môi trường ô nhiễm lượng Vibrio phát triển gia tăng,
tôm ăn thức ăn nhiễm Vibrio vào dạ dày ruột, vi khuẩn nhân cơ hội hoại tử
thành ruột làm phân có màu vàng hoặc màu trắng (Bùi Quang Tề, 2003).
Tuy nhiên theo một số nghiên cứu gần đây thì bệnh phân trắng có liên quan
đến HPV (Nguyễn Khắc Lâm, 2007).
2.3.5 Bệnh nhiễm trùng vi-rút dưới da và hoại tử
Bệnh do loài vi-rút thuộc giống Parvovirus gây ra. Vi-rút ký sinh trong tế bào
tuyến anten, tế bào hệ bạch huyết, tế bào mang, tế bào dây thần kinh, không có
thể ẩn chỉ có thể vùi, chúng làm hoại tử và sưng to nhân vật chủ. Tôm nhiễm
IHHNV thường hôn mê, hoạt động yếu, chũy biến dạng. Tôm sú (Penaeus
monodon) bị bệnh sắp chết thường chuyển màu xanh, cơ phần bụng có màu
đục. Kiểm tra mô bệnh học tế bào tuyến ăng-ten, tế bào dây thần kinh và tế
bào mang của tôm nhiễm IHHNV có thể vùi trong nhân tế bào. Thời kỳ đầu
thể vùi thường nhỏ nằm ở trung tâm của nhân, sau đó lớn nằm gần kín nhân.
Trong thể vùi có chứa nhiều vi-rút (Bùi Quang Tề, 2003).

7

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
2.4 Tôm nhiễm HPV
2.4.1 Đặc điểm tôm nhiễm HPV
Tôm bị nhiễm HPV thường bỏ ăn, chán ăn, chậm lớn, giảm nhiều hoạt động

8

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
2.4.4 Đặc tính sinh học của HPV
HPV lây nhiễm trên các loài tôm nuôi và tôm tự nhiên thuộc họ Penaeus bao
gồm Penaueus merguiensis, Penaueus monodon, Penaueus chinensis,
Penaueus japonicus, Penaueus penicillatus, Penaueus vannamei (Nguyễn Văn
Hảo, 2000) và tôm càng xanh Microbrachium rosenbergii (Lightner et al.,
1994). HPV có thể được che giấu do nhiễm cùng nhiều mầm bệnh khác
(Lightner et al., 1994).
Cơ quan tấn công chủ yếu của HPV là tế bào biểu mô của gan tụy. HPV tạo
thể vùi phì đại cùng với sự phình to của nhân. Vi-rút nhân lên trong tế bào, sau
đó phóng thích và lây lan từ tế bào bị nhiễm đến tế bào không bị nhiễm. HPV
rất ổn định khi tiếp xúc với các hoạt chất hóa học, nhiệt độ (Trần Thị Tuyết
Hoa, 2004).
Thường chỉ có một thể vùi trong nhân đôi khi có hai thể vùi trong nhân phì đại
của tế bào biểu mô gan tụy. Vi-rút HPV tấn công chủ yếu vào tế bào E, đoạn
đầu của ống tiểu quản. Thời kỳ đầu thể vùi nhỏ nằm ở trung tâm của nhân, sau
lớn dần chiếm gần hết nhân. Trong thể vùi có nhiều có chứa nhiều vi-rút
(Sindermann & Lightner, 1988).
2.4.5 Phân bố của bệnh HPV
HPV được mô tả đầu tiên từ nông dân nuôi tôm biển ở Singapore (Chong &
Loh, 1984. Trích dẫn bởi Flegel et al., 2004). Sau đó Lightner và Redman
(1985) trích dẫn bởi Flegel et al. (2004), dựa trên phân tích mô bệnh học báo
cáo HPV nhiễm trên 4 loài tôm: Penaeus chinensis nuôi ở Trung Quốc,
Penaeus merguiensis nuôi ở Singapore, Penaeus monodon nuôi ở Phillipin và
Penaeus semisulcatus nuôi ở Kuwait.
Loài vi-rút này lây nhiễm trên nhiều loài tôm khác nhau và lan rộng ở nhiều
nơi trên thế giới: Châu Á, Châu Phi, Châu Úc , Bắc Mĩ và Nam Mĩ (Fulks &
Main, 1992; Lightner & Redman, 1992).

có chiều dài ngắn hơn tôm bình thường và tôm chỉ nhiễm MBV. Báo cáo của
tỉnh Songkhla chiều dài của tôm nhiễm MBV không khác với chiều dài của
tôm không nhiễm MBV và không có sự liên quan giữa MBV và chiều dài của
tôm. Năm 1997 trong 80 mẫu kiểm tra ở hai ao nuôi tôm thuộc tỉnh Ratchaburi
chỉ có HPV và MBV được phát hiện giống như kết quả ban đầu của tỉnh
Songkhla, nhóm tôm nhiễm HPV và nhiễm kép HPV và MBV giống nhau về
chiều dài và ngắn nhất trong số mẫu kiểm tra. Báo cáo ở tỉnh Songkhla không
có mối liên quan giữa MBV và chiều dài của tôm. Tuy nhiên kết quả của tỉnh
Ratchaburi không giống với kết quả của tỉnh Songkhla: có sự liên quan giữa
MBV và chiều dài của tôm, tôm nhiễm MBV có chiều dài khác với tôm không
nhiễm. Năm 1998 trong 240 mẫu ở 6 ao từ tỉnh Chumpol chỉ có MBV duy
nhất được phát hiện. Kết quả có sự liên quan giữa MBV và kích cỡ của tôm và
có sự khác biệt giữa chiều dài giữa nhóm tôm nhiễm MBV và tôm không
10

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
nhiễm. Kết quả của sự nghiên cứu là MBV có ảnh hưởng đến sinh trưởng của
tôm ít hơn HPV và sự khác nhau về kích cỡ giữa tôm nhiễm HPV và không
nhiễm là một chứng cứ rõ ràng dẫn đến thời gian nuôi bị kéo dài thêm. Nhiễm
kép HPV-MBV thì chỉ có một số ít trường hợp làm tôm chết, còn đa số chỉ
gây chậm lớn cho tôm nuôi (Flegel et al., 2004).
Trước đây tỉ lệ cảm nhiễm HPV trên tôm giống là 60 % thì khi thả nuôi tỉ lệ
chết cũng là 60 % đối với tôm thịt trong ao nuôi. Tuy nhiên theo nghiên cứu
những năm gần đây nếu nhiễm HPV thì không làm chết tôm, mà chỉ làm tôm
tăng trưởng rất chậm. (Catap et al., 2003).
Ở Việt Nam tôm sú nuôi nhiễm HPV rất chậm lớn trong một số ao nuôi ở
Nghệ An (2002). Tháng 7 năm 2002 kiểm tra một lô tôm post 25-30 ngày ở
Quảng Ngãi kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm 100 % bệnh HPV, tôm có hiện tượng
đen thân và chết rất nhiều (Bùi Quang Tề, 2003).
2.5 Lịch sử mô học

tạo máu cũng có thể vùi lớn, hình cầu và bắt màu hồng của Eosin rất rõ. Và
phương pháp PCR hai bước của Lo và ctv (1996), để kiểm tra sự nhiễm vi-rút
gây bệnh đốm trắng (WSSV) từ các mẫu tôm mẹ và mẫu ấu trùng . Năm 2003
Phạm Trần Nguyên Thảo ứng dụng phương pháp mô học trong chẩn đoán
bệnh đốm trắng trên tôm sú (Penaeus monodon) có thể phát hiện được biểu
hiện đặc trưng của bệnh đốm trắng dưới vỏ, đặc biệt là giáp đầu ngực, dưới
mức độ vi thể là thể vùi trong nhân phì đại của các tế bào biểu mô dạ dày,
dưói da, mang, tế bào mô liên kết của các cơ quan khác nhau và một số tổn
thương khác như phá vỡ cấu trúc của tổ chức, tạo nhiều không bào trên mô,
mất liên kết giữa các mô. Trong đó những thể vùi có tính kiềm trong nhân phì
đại là biểu hiện bệnh lý đặc trưng dùng để chẩn đoán bệnh đốm trắng. So sánh
kết quả của phương pháp PCR và mô học truyền thống trong chẩn đoán bệnh
tôm giống và tôm thịt cho thấy sự khác biệt không đáng kể. Năm 2004 Phan
Thị Hừng sử dụng phương pháp mô học truyền thống nghiên cứu cấu trúc mô
và biến động số lượng hồng cầu trên cá tra (Pangasius hypophthalmus) bị
bệnh vàng da có thể thấy được cấu trúc mô học của các cơ quan nội tạng của
cá bị vàng da như gan, thận, tỳ tạng không thay đổi so với cá khỏe. Khi cá tra
bị bệnh vàng da thì số lượng tế bào hồng cầu giảm đi hơn 50% so với cá khỏe. 12

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
CHƯƠNG 3

Bạc Liêu. Tôm giống được chẩn đoán bằng phương pháp nhuộm Malachite
Green. Chọn 30 mẫu nhiễm HPV kiểm tra lại bằng phương pháp bằng phương
pháp mô học.
Mẫu tôm thịt:
Thu tại 2 địa điểm Sóc Trăng và Trà Vinh. Tỉnh Sóc Trăng thu 15 ao, mỗi ao
thu ngẫu nhiên 15 con, còn ở Trà Vinh thu 15 ao, mỗi ao thu 6 con. Do mật độ
tôm nuôi ở Trà Vinh thấp và tôm có cỡ lớn nên chỉ thu được trung bình 6
con/ao, còn ở Sóc Trăng đa số nông dân nuôi tôm thâm canh nên số lượng
mẫu nhiều 15 con/ao. Trong quá trình thu mẫu ghi nhận một số thông tin về kỹ
thuật quản lý ao nuôi, chế độ cho ăn, loại thức ăn sử dụng trong quá trình nuôi,
nguồn gốc giống thả nuôi. Tôm được chẩn đoán sơ bộ với phương pháp
nhuộm Malachite Green. Sau đó dùng phương pháp mô học truyền thống để
xác định sự hiện mầm bệnh trên tôm thịt.
3.3.2 Phương pháp phân tích mẫu
3.3.2.1 Phân tích tôm giống và tôm thịt bằng phương pháp nhuộm tươi
Malachite Green
Dùng dao mổ giáp đầu ngực của tôm (tôm thịt và tôm giống) lấy gan tụy đưa
lên lame. Nhuộm tươi bằng dung dịch cồn 0.05-0.1% Malachite green để phát
hiện thể vùi trong tế bào gan tụy do vi-rút HPV gây ra. Quan sát dưới kính
hiển vi quang học có độ phóng đại 400 lần có thể phát hiện thể vùi của HPV
trong nhân tế bào gan tụy bắt màu xanh của thuốc nhuộm Malachite Green.
Quan sát các thể vùi HPV dưới kính hiển vi ngay trong vòng 5 phút
3.3.2.2 Đo chiều dài và trọng lượng tôm trước khi phân tích mẫu
3.3.2.3 Phương pháp mô bệnh học truyền thống theo Lightner (1996)
Cố định mẫu
Tôm giống được cố định trong dung dịch Davidson’s AFA trong thời gian từ
12-24 giờ, sau đó chuyển sang dung dịch cồn 70% và trữ ở nhiệt độ phòng đến
khi phân tích. Tỉ lệ giữa dung dịch cố định và mẫu tôm giống là 10:1.
Tôm lớn thì thu cả con và cố định trong dung dịch Davidson’s AFA trong thời
gian là 48 giờ, sau đó chuyển sang cố định trong dung dịch cồn 70% và trữ ở

parafin nóng chảy vào khuôn. Để giữ mẫu được cố định đúng vị trí, quá trình
làm lạnh có thể được thực hiện trong quá trình đúc khối. Sau khi mẫu được vùi
15

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
vào trong parafin, làm rắn parafin bằng cách đặt khuôn đúc khối trên máy làm
lạnh, sau khi parafin đã rắn tốt thì tiến hành tách khối parafin ra khỏi khuôn.
Cắt mẫu
Trước khi tiến hành cắt lát mẫu thì phải gọt tỉa mẫu cho gọn, phải điều chỉnh
độ dày của lát cắt. Những lát cắt đầu có thể cắt ở độ dày từ 10-12 µm. Sau khi
đã cắt bằng mặt khối và đến vị trí cần, điều chỉnh độ dày về 4-6 µm. Giữ lạnh
khối parafin trong quá trình cắt mẫu. Để qua đêm cho parafin tan ra và mẫu
được khô.
Dán lát cắt vào lame
Sau khi đã chọn được lát cắt phù hợp thì tiến hành dán lát cắt vào lame. Cho
nước ấm khoảng 55
o
C trải đều trên lame, sau đó dùng pen gấp thật khéo lát cắt
đặt vào ngay giữa miếng lame, trong quá trình đặt lát cắt vào cần cẩn thận cho
lát cắt thật thẳng để đảm bảo mẫu mô đẹp. Cho miếng lame lên bàn sấy với
nhiệt độ từ 45-50
o
C.
Nhuộm mẫu
Mẫu được nhộm mẫu bằng thuốc nhuộm H&E (Theo Mayer’s có điều chỉnh)
(Lightner, 1996). Qui trình nhuộm gồm các bước
Xylen 1 5 phút
Xylen 2 5 phút
Xylen 3 5 phút
Cồn 100% 5 phút

3.4.2 Xác định cường độ cảm nhiễm/cá thể
Cường độ cảm nhiễm = Tế bào nhiễm HPV/ tổng số tế bào/thị trường x 100
Xác định cường độ cảm nhiễm từ mẫu phân tích, thống kê số liệu từ đó xác
đưa ra 3 mức độ cảm nhiễm: cảm nhiễm thấp (+), cảm nhiễm trung bình (++),
cảm nhiễm cao (+++).
3.4.3 Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được kiểm tra và phân tích bằng phầm mềm thống kê Excel.

17

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
CHƯƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Cường độ cảm nhiễm và tỉ lệ cảm nhiễm tự nhiên của vi-rút trên tôm
sú giống thả nuôi ở ĐBSCL
4.1.1 Cường độ cảm nhiễm HPV trên tôm giống thả nuôi ở ĐBSCL
Trong số 265 mẫu tôm giống được thu ở 3 tỉnh Trà Vinh, Sóc Trăng, Bạc Liêu
và được phân tích bằng phương pháp nhộm tươi bằng Malachite Green có 67
mẫu nhiễm HPV dương tính có cường độ cảm nhiễm khác nhau và được trình
bày trong bảng 1.
Bảng 1: Kết quả cường độ cảm nhiễm trên tôm giống thu ở ĐBSCL (40X)
TT Tổng số tế bào gan Tế bào nhiễm HPV Ic Qui ước
1 142 1 0,70 +
2 80 1 1,25 +
3 80 1 1,25 +
4 80 1 1,25 +
5 70 1 1,43 +

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu