1
BÀI GIẢNG
NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT
2

MỤC LỤC


- Môi trường nghèo chất dinh dưỡng: như môi trường White, Knop. Môi trường này
thích hợp vào các giai đoạn cuối của quy trình nuôi cấy mô thực vật khi chuẩn bị chuyển
cây từ ống nghiệm ra vườn ươm. Môi trường nghèo chất dinh dưỡng cũng có thể sử dụng
trong các sinh trắc nghiệm để kiểm tra đặc tính biến dưỡng của mô thực vật.
- Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: môi trường B5, Gamborg.
Loại môi trường này được sử dụng đối với một số loại cây có nhu cầu các chất dinh
dưỡng trong môi trường vừa phải hoặc cũng có thể sử dụng khi nuôi cấy mô thực vật dài
ngày.
- Môi trường giàu chất dinh dường: môi trường MS (Murashige – Skoog). Đây là
môi trường khởi đầu cho mọi quá trình nuôi cấy mô đối với mọi đối tượng nuôi cấy. Môi
trường MS là một môi trường thích hợp với nhiều loại cây, do giàu và cân bằng về chất
dinh dưỡng.
2 - NGUYÊN LIỆU - HOÁ CHẤT - DỤNG CỤ
2.1 - Hoá chất
- Saccharose (sucrose)
- Agar
- NH
4
NO
3

- KNO
3

- MgSO
4
.7H
2
O
- KH

4
.4H
2
O
- ZnSO
4
.7H
2
O
- CuSO
4
.5H
2
O
- Thiamine HCl
- Myo-inositol
- Glycine
- NAA
- BA (6-Benzyl aminopurin)
- Na
2
-Ethylen diamin tetraacetat (Na
2
EDTA
-Fe
2
(SO
4
)
3

mẹ Fe – EDTA (Skoog II), dung dịch mẹ khoáng vi lượng (Skoog III), dung dịch mẹ chất
điều hoà sinh trưởng
4 - THỰC HÀNH PHA CHẾ CÁC DUNG DỊCH MẸ (Stock) MÔI TRƯỜNG MS
(Murashige – Skoog)
4.1. Pha stock khoáng đa lượng môi trường MS nồng độ đậm đặc 20 lần (x20)
Cân chính xác bằng cân phân tích các muối khoáng đa lượng. Dùng ống đong, đong
khoảng 400 ml nước cất hai lần vào becher 1000 ml. Cho lần lượt các muối đa lượng vào
theo trình tự nhất định sau:

Tên hoá chất
Nồng độ môi trường
nuôi cấy (mg/lít)
Nồng độ dung dịch
stock (x20) (mg/lít)

- MgSO
4
.7H
2
O 370 7.400
- KH
2
PO
4
170 3.400
- KNO
3
1.900 38.000
- NH
4

4.2. Pha stock khoáng vi lượng nồng độ đậm đặc 1000 lần (x1000)
Do hàm lượng một số loại khoáng vi lượng trong stock khoáng vi lượng rất
nhỏ, khó có thể cân đong chính xác như một số các khoáng vi lượng khác. Vì vậy ở đây,
ta phải tiến hành pha riêng dung dịch các khoáng này (CuSO
4
.5H
2
O, CoCl
2
.6H
2
O) có
nồng độ đậm đặc hơn 100 lần so với dung dịch mẹ và gọi là dung dịch “bà ngoại”.
Sau khi pha song các dung dịch “bà ngoại”, tiến hành pha 100 ml stock
khoáng vi lượng X1000 tương tự như ở phần trên. Thành phần các khoáng như sau:

Tên hoá chất
Nồng độ môi
trường nuôi cấy
(mg/lít)
Nồng độ dung dịch
stock (x1000)
(mg/lít)
Nồng độ dung dịch
“bà ngoại “(x100)
(mg/lít)
H
3
PO
3

O 0,025 25 2500
4.3. Pha dung dịch mẹ Fe-EDTA nồng độ đậm đặc 200 lần (x200)
Sắt là yếu tố rất cần thiết cho thực vật. Tuy nhiên, nhu cầu của thực vật đối
với sắt rất nhỏ và lượng liên tục. Vì vậy, để cung cấp đủ lượng sắt cho thực vật ta thường
dùng sắt dưới dạng hợp chất Fe-DETA. Hợp chất Fe-EDTA được hình thành do sự ngậm
Fe của EDTA dưới tác dụng của nhiệt độ. Ở dưới dạng hợp chất này, sắt sẽ được phóng
thích ra môi trường tuỳ theo nhu cầu của thực vật. Phương pháp pha như sau:

Tên hoá chất
Nồng độ môi trường
nuôi cấy (mg/lít)
Nồng độ dung dịch stock
(x200) (mg/lít)
FeSO
4
.7H
2
O 27,8 5560
Na
2
EDTA 37,3 7460
Chuẩn bị hai becher 500 và 1000 ml. Cho vào mỗi becher 400 ml nước cất
hai lần. Đun nóng hai becher trong bể ổn nhiệt khoảng 80
oC
. Cân chính xác 5,56 g
FeSO
4
.7H
2
O cho vào becher 500 ml có 400 ml nước trên, khuấy tan hoàn toàn. Cân chính

176,19 g IAA pha trong 1000 ml nước 1000 ml dung dịch có nồng độ 1
mol/lít. Để pha dung dịch có nồng độ 1 mmol/lít cần 0,17619 g IAA. Như vậy, muốn có
100 ml dung dịch IAA nồng độ 1 mmol/lít cần 0,017619 g IAA. (MNAA: 186,2; M
2,4-D
:
221,04; MBA: 225,2)
+ Cách 2: pha theo hệ mg/lít: làm tương tự như cách pha khoáng.
Các dung dịch stock hormon sau khi pha song được bảo quản trong các
chai màu ở nhiệt độ lạnh 4-10
oC
.
4.5. Pha stock vitamin môi trường MS nồng độ đậm đặc 500 lần (x500)
Dùng ống đong, đong 50 ml nước cất hai lần vào một becher 100 ml. Bổ
sung các vitamin vào theo trình tự sau:

Tên hoá chất Nồng độ môi trường Nồng độ dung dịch stock
7

nuôi cấy (mg/lít) (x500) (mg/lít)
Acid nicotinic 0,5 250
Thiamin HCl 0,1 50
Pyridoxin HCl 0,5 250
Myo-inositol 100 50.000
Glycine 2 1.000
Cho tất cả dung dịch vào bình định mức, dùng nước cất bổ sung cho đủ 100 ml.
Như vậy, ta có 100 ml stock vitamin MS x500. Dung dịch này được bảo quả để dùng dần
trong chai màu ở nhiệt độ dưới 0
oC
, dùng 2ml cho một 1000 ml môi trường nuôi cấy.
4.6. Pha môi trường làm việc (môi trường nuôi cấy)


PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG MÔ THỰC VẬT
1 - NGUYÊN TẮC
Một thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật khác với một thí nghiệm nuôi cấy vi sinh
thường tiến hành trong một thời gian rất lâu dài. Với một thí nghiệm trường diễn như thế,
chỉ cần một tế bào vi khuẩn, một bào tử nấm mốc rơi vào môi trường nuôi cấy, sau một
thời gian ngắn sẽ sinh sôi làm hỏng môi trường, làm hỏng thí nghiệm và phải tiến hành
làm lại từ đầu. Do đó việc vô trùng tức loại bỏ hết nấm khuẩn trong nuôi cấy mô thực vật
vô cùng quan trọng.
Mô cấy có thể là hầu hết các bộ phận khác nhau của thực vật như hạt giống, phôi,
noãn, đế hoa, lá, đầu rễ, thân củ… tùy theo sự tiếp xúc với môi trường bên ngoài, các bộ
phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn và nấm. Để chuyển mô thực vật từ môi trường tự
nhiên vào môi trường nuôi cấy in vitro, mô thực vật phải trải qua giai đoạn khử trùng để
loại bỏ hết các mầm vi sinh vật. Tuy nhiên quá trình này phải đảm bảo là mô thực vật còn
sống, có khả năng tăng trưởng, phát triển tốt.
Phương pháp vô trùng mô cấy thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hóa học
có hoạt tính diệt nấm khuẩn. Hiệu lực diệt nấm khuẩn của các chất này phụ thuộc vào
thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẽ ngách lồi lõm trên
bề mặt mô cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô cấy. Để tăng tính linh
động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn, thông thường người ta lắc mô cấy với
cồn 70%, sau đó mới xử lý dung dịch diệt khuẩn.
Bảng 1. Một số tác nhân khử trùng dùng cho thực vật
Tác nhân vô trùng Nồng độ (%) Thời gian xử lý (phút) Hiệu quả
Canxi hypoclorid 9 – 10 5 – 30 Rất tốt
Natri hypoclorid 2 5 – 30 Rất tốt
Hydro peroxid 10 – 12 5 – 15 Tốt
Nước Brom 1 – 2 2 – 10 Rất tốt
HgCl
2
0,1 – 1 2 – 10 Trung bình

o
- Javel
- Ca(OCl)
2
(Caxi hypoclorid)
2.3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành
STT Tên dụng cụ, thiết bị
Đơn vị
tính
Số
lượng
Ghi chú
1 - Dao mổ cái 15
2 - Lưỡi dao mổ cái 15 Dùng lưỡi dao mổ nhọn
3 - Ống đong: 100 ml cái 12
4 - Ống đong 500 ml cái 3
5 - Đũa khuấy cái 15
6 - Cốc 500 ml cái 15
7 - Quả bóp cao su cái 15
8 - Cốc 1000 ml cái 5
9 - Cốc 100 ml cái 30
10 - Cốc 200 ml cái 15
11 - Pipett: 1 ml cái 5
12 - Pipett: 5 ml cái 5
13 - Pipett: 10 ml cái 5
14 - Erlen 250ml cái 60
10

STT Tên dụng cụ, thiết bị
Đơn vị

- Gạn bỏ nước.
4.2 - Khử trùng hạt thuốc lá
- Thực hiện trong phòng thí nghiệm, rửa hạt thuốc lá dưới vòi nước máy.
- Lắc hạt với nước có pha một ít xà phòng.
- Rửa lại nhiều lần bằng nước máy cho sạch xà phòng
- Thực hiện trong tủ cấy, lắc hạt với cồn 70
o
trong 1 phút.
- Chiết bỏ cồn, ngâm hạt trong dung dịch Caxi hypoclorid 10% trong 5 phút.
- Rửa sạch dung dịch khử trùng bằng nước cất vô trùng 5-6 lần.
- Gạn bỏ nước.
4.3 - Cách cấy mẫu
a. Mẫu cây Trầu bà
11

- Trong tủ cấy vô trùng, những đốt cây Trầu bà đã khử trùng, được đặt trên giấy cấy
vô trùng. Dùng dao mổ và kẹp tách các lá.
- Ở mỗi nách lá có mang một mầm ngủ. Dùng dao mổ cắt một đoạn mẫu có kích
thước khoảng 1x1 cm cấy vào môi trường MS đã hấp khử trùng trong các ống nghiệm.
- Khi cấy mẫu cần chú ý cấy đúng chiều của thân. Các ống nghiệm được đặt trong
phòng lạnh nhiệt độ 25
oC
, cường độ ánh sáng 2500-3000 lux.
b. Mẫu hạt thuốc lá
- Hạt thuốc lá sau khi khử trùng, dùng kẹp đặt đều trên bề mặt môi trường MS trong
các erlen. Khoảng cách giữa các hạt là 1cm.
- Các erlen được đặt ở nơi tối hoàn toàn.
5 - BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH
1. Trình bày phương pháp khử trùng đốt thân Trầu bà, hạt thuốc lá.
2. Vai trò và tác dụng của tác nhân khử trùng cồn, canxi hypoclorid.

chồi nách. Bên cạnh đó, việc tách chồi nách cũng có thể thực hiện từ những cây vô trùng
trong ống nghiệm được tạo ra do việc nuôi cấy hạt giống.
Trong bài thực hành này, sẽ đề cập tới phương pháp nhân giống vô tính thực vật qua
nuôi cấy chồi nách và tạo nguồn cây cho phương pháp nuôi cấy chồi nách từ hạt giống.
2- VẬT LIỆU –HOÁ CHẤT – DỤNG CỤ
2.1 - Vật liệu
- Cây hoa cúc
- Hạt cam
2.2 - Hoá chất
- Cồn 70
o
, 90
o
- Môi trường MS bổ sung 2,4 – D
- Xà phòng bột
- Cồn 70
o
, 90
o
- Javel
13

- NAA
- BA
2.3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành
STT Tên dụng cụ, thiết bị
Đơn vị
tính
Số
lượng

a. Khử trùng
14

- Lựa cây cúc còn tươi, non, lá ít bị dập. Dùng dao cắt bỏ hoa và gốc. Cắt lấy một
đoạn cách gốc 1015 cm.
- Rửa sạch đoạn thân cúc dưới vòi nước máy.
- Cắt thành những đoạn nhỏ. Cắt ở giữa hai chồi ngủ. Mỗi đoạn có một chồi ngủ.
- Lắc các đoạn trong nước xà phòng từ 1015 phút.
- Rửa sạch xà phòng dưới vòi nước máy.
- Lắc với cồn 70
o
trong 1 phút.
- Lắc với dung dịch javel/nước ở các tỷ lệ 1/9, 2/8, 3/7, 4/6, 1/1.
- Rửa sạch javel bằng nước cất vô trùng 56 lần.
b. Nuôi cấy
- Thân cúc sau khi khử trùng được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung BA và
NAA với tỷ lệ NAA/BA <1.
- Cắm thân cúc vào môi trường sao cho chồi ngủ vẫn nằm trên bề mặt môi trường .
4.2 - Khử trùng và nuôi cấy hạt cam
a. Khử trùng hạt
- Rửa hạt cam dưới vòi nước máy.
- Lắc hạt với nước xà phòng 1015 phút.
- Rửa sạch xà phòng bằng nước máy.
- Lắc với cồn 70
o
trong 30 giây.
- Rửa sạch cồn bằng nước cất vô trùng 56 lần.
b. Tách vỏ hạt
- Đặt hạt cam lên trên giấy cấy. Dùng kẹp giữ hạt.
- Dùng dao mổ cắt hai đường dọc theo chiều dài hạt. Hai đường này đối diện nhau.

như vảy cá hoặc hạt gạo nằm ép sát vào thân (lõi), có màu trắng. Mỗi chồi được tách
riêng để nuôi cấy để tạo thành cụm chồi.
2 - VẬT LIỆU – HOÁ CHẤT – DỤNG CỤ
2.1 - Vật liệu
Chồi ngủ được tách từ ngọn dứa dùng làm vật liệu nuôi cấy.
2.2 - Hoá chất
- Cồn 70
o
, 90
o

- Môi trường MS bổ sung NAA, BA
- Javel
- Xà phòng bột
2.3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành
STT Tên dụng cụ, thiết bị
Đơn vị
tính
Số
lượng
Ghi chú
1 - Dao mổ cái 15
2 - Lưỡi dao mổ cái 15 Dùng lưỡi dao mổ nhọn
3 - Ống đong: 100 ml cái 12
4 - Ống đong 500 ml cái 3
5 - Đũa khuấy cái 15
6 - Cốc 500 ml cái 15
7 - Quả bóp cao su cái 15
8 - Cốc 1000 ml cái 5
9 - Cốc 100 ml cái 30

- Rửa nhẹ nhàng cùi dứa dưới vòi nước máy, tránh làm tổ thương các chồi ngủ.
- Dùng dao cắt lấy bốn mặt của cùi dứa có mang chồi ngủ.
- Lắc nhẹ nhàng các mảnh có mang chồi ngủ này trong nước xà phòng trong 10
phút.
- Rửa sạch nước xà phòng dưới vòi nước máy.
- Lắc các mảnh mô dứa trong cồn 70
0
trong 2 phút.
- Khử trùng với nước javel (tỷ lệ 3:7) trong 7 phút.
- Rửa sạch lại bằng nước cất vô trùng 5÷6 lần. 17

Hình 1. Cắt các mặt có mang chồi ngủ từ cùi dứa
4.2 - Phương pháp nuôi cấy
- Dùng dao mổ cắt những đường dọc, ngang tách rời từng chồi ngủ muốn lấy.
- Cắt vát 4 cạnh dưới của miếng mô dứa có mang chồi ngủ tạo thành hình tháp.

19

BÀI 5

PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẠO MÔ SẸO THỰC VẬT
1 - NGUYÊN TẮC
Trong đặc tính sinh lý của cơ thể thực vật, khi bị những tổn thương về mặt vật lý
(những vết cắt trên cơ thể, những tổn thương do côn trùng tấn công) thực vật có khả năng
hình thành những tế bào mới để hàn kín những chỗ tổn thương đó. Những tế bào mới
được hình thành đó là tế bào mô sẹo.
Mô sẹo là một khối tế bào nhu mô phát triển vô tổ chức, hiện diện trong các giai
đoạn hoá lignin khác nhau của thực vật, thường do các tế bào trong vùng tượng tầng
(vùng phân sinh) như tượng tầng liber –mộc, tượng tầng vỏ ở gốc của đoạn cắt tạo thành.
Những tế bào mô sẹo thường có hình cầu, màu trắng hoặc nâu nhạt. Khối mô sẹo có khả
năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chất kích thích
sinh trưởng tạo mô sẹo.
Nuôi cấy tạo mô sẹo được thực hiện đối với các loài thực vật không có khả năng
nhân giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Những mô của thực vật có thể dùng
nuôi cấy tạo mô sẹo là: tượng tầng libe mộc, tượng tầng vỏ, phôi nhũ, tế bào diệp nhục,
lá, trụ bì rễ, tử diệp… Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ. Từ một cụm
tế bào mô sẹo có thể tái sinh cho cùng một lúc cho nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh
trưởng.
tính
Số
lượng
Ghi chú
1 - Dao mổ cái 15
2 - Lưỡi dao mổ cái 15 Dùng lưỡi dao mổ nhọn
3 - Ống đong: 100 ml cái 12
4 - Ống đong 500 ml cái 3
5 - Đũa khuấy cái 15
6 - Cốc 500 ml cái 15
7 - Quả bóp cao su cái 15
8 - Cốc 1000 ml cái 5
9 - Cốc 100 ml cái 30
10 - Cốc 200 ml cái 15
11 - Pipett: 1 ml cái 5
12 - Pipett: 5 ml cái 5
13 - Pipett: 10 ml cái 5
14 - Erlen 250ml cái 60
15 - Kẹp dài 25 cm Cái 15
16 - Bông mỡ g 200
17 - Ống nghiệm Þ25 cái 15
18 - Giá ống nghiệm lỗ lớn cái 15
19 - Đèn cồn cái 15
20 - Tủ cấy vô trùng cái 1
Tủ cấy có quạt thổi khí vô
trùng

21

3 - NỘI DUNG THỰC HÀNH

- Các mảnh lá này được nuôi cấy tạo mô sẹo.
c. Cắt đoạn rễ
- Sau khi cắt các đoạn thân, lá, phần rễ còn lại được rửa sạch agar trong nước cất vô
trùng.
- Dùng dao cắt rễ thành các đoạn nhỏ có kích thước 0,2 - 0,4 cm. Các đoạn này được
nuôi cấy tạo mô sẹo.
22

Hình 4. Phương pháp cắt mảnh lá (A), đốt thân (B), đoạn rễ (C)
4.3 - Nuôi cấy tạo mô sẹo
a. Nuôi cấy thân, lá
- Dùng kẹp gắp các đoạn thân mảnh lá cấy trên môi trường MS bổ sung 2,4-D.
- Khoảng cách giữa các đoạn thân, mảnh lá là 1cm. Tránh cấy quá dày.
- Sử dụng môi trường MS bổ sung 2,4-D có nồng độ là 1µmol/lít môi trường.
b. Nuôi cấy đoạn rễ

là hạt giống nhân tạo có cấu tạo là phôi được bao bọc bởi lớp áo bên ngoài thay cho nội
nhũ, vỏ và phôi ở hạt nhân tạo là phôi vô tính (phôi soma) (hình 1). Hạt giống nhân tạo
gồm 3 phần (hình 2):
- Phôi vô tính
- Vỏ bọc polymer như alginat
- Màng ngoài: được cấu tạo từ alginat canxi
Phôi soma ở hạt nhân tạo giống như phôi hợp tử ở hạt tự nhiên là có hai cực (đỉnh
chồi và đỉnh rễ), như thế có thể phát triển thành một cây hoàn chỉnh tương tự như hạt nảy
mầm. Cấu trúc phôi soma giống như phôi hợp tử nhưng phôi soma của hạt giống nhân
tạo không có vỏ bao hạt cũng như mô dự trữ. Hình 5 - So sánh cấu trúc hạt tự nhiên và hạt nhân tạo

24

5
H
7
O
4
COONa]
n
+ nCaCO
3
Alginat Ca Alginat Na
Alginat Na là dạng tan trong nước. Khi Alginat Na tiếp xúc với dung dịch CaCl
2
,
xảy ra phản ứng trao đổi ion giữa hai dung dịch này theo phản ứng:
2[C
5
H
7
O
4
COONa]
n
+ nCaCl
2
[(C
5
H
7
O
4

tạo
Vỏ
nhân
tạo
25

STT Tên hoá chất, phụ liệu
Đơn vị
tính
Số
lượng
Ghi chú
3 CaCl
2
2,5% ml 300
4 Nước cất ml 500
5 Giấy lọc gói 1
6 Phôi vô tính

2.2 - Dụng cụ, thiết bị cần cho một nhóm (30 sinh viên) thực hành

STT
Tên dụng cụ, thiết bị
Đơn vị
tính
Số
lượng
Ghi chú
1 Bình chiết 500ml cái 2 Tạo giọt nhỏ
2 Pipette 10 ml cái 2 Hút và chuyển phôi