Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
Phosphorus là khoáng chất đóng vai trò quan trọng trong dinh dưỡng thức ăn vật nuôi.
Phosphorus và cũng như các nguyên tố khoáng cần thiết khác được cung cấp chủ yếu qua con
đường thức ăn. Đa số thức ăn cho gia súc có nguồn gốc từ các hạt thực vật đặc biệt là ngũ cốc
và các loại hạt đều có chứa sẵn Phosphorus. Tuy nhiên, Phosphorus có chứa trong nguyên liệu
hạt này có tới 80% nằm dưới dạng phân tử phytate hoặc axit phytic. Phosphorus tồn tại ở
dạng này rất khó tiêu hoá đối với các loài động vật có dạ dày đơn như gia cầm, lợn, cá …
Axit phytic khi kết hợp với các ion kim loại như Fe
3+
, Mg
2+
, Ca
2+
, Zn
2+
… sẽ ngăn cản
khả năng kết hợp của các ion kim loại này với các axit béo không no làm giảm khả năng tiêu
hoá thức ăn của động vật, gây ra hiệu ứng kháng dinh dưỡng.
Ngoài ra do không hấp thu được lượng Phosphorus có sẵn trong axit phytic nên thức
ăn cho động vật dạ dày đơn (ví dụ: cá, gia cầm, heo…) thường phải bổ sung thêm Phosphorus
dẫn đến lượng Phosphorus thừa không được tiêu hoá bị thải ra ngoài theo phân của chúng đã
làm ô nhiễm môi trường gây nên hiện tượng tảo nở hoa bùng phát, ảnh hưởng đến sự phát
triển của các loài thuỷ sản…
Chính vì vậy, để tận dụng nguồn Phosphorus có sẵn trong thành phần của các nguyên
liệu thực vật, tăng hệ số sử dụng thức ăn của vật nuôi, giảm lượng axit phytic thải ra ngoài
môi trường thì việc các hợp chất Phosphorus ở dạng khó phân giải thành này thành các chất
đơn giản và dễ phân giải hơn là rất quan trọng. Để đạt được điều này, người ta đã sử dụng
phytase để thuỷ phân axit phytic.
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành khảo sát mức độ thuỷ phân của dịch
chiết enzyme tiêu hoá cá tra kết hợp với enzyme phytase trên thức ăn nuôi cá tra để nâng cao

pentosanase đối với khẩu phần lúa mì, phytase đối với phytate). Bổ sung đa enzyme có lợi
hơn bổ sung enzyme đơn.
Hàm lượng enzyme bổ sung tuỳ thuộc vào tuổi và thành phần khẩu phần. Theo
Schoner et al., (1993), gà broiler 44 ngày tuổi yêu cầu 570 U phytase để giải phóng 1g
Phosphorus; gà 70 ngày tuổi số lượng enzym yêu cầu là 850 U.
SVTH: Võ Thị Tố Nga 2
Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện
Gà mái đẻ có nhu cầu bổ sung phytase kém hơn gà broiler tuy nhiên cũng có những
tác dụng như tăng sản lượng trứng và hiệu quả chuyển hoá thức ăn thì cũng thấy rõ ở gà mái
đẻ [3].
2.1.2.2. Bổ sung enzyme vào khẩu phần thức ăn lợn
So với gia cầm, hiệu quả của enzyme thức ăn trong khẩu phần lợn giữa các nghiên cứu
không thống nhất [3].
Một tổng kết tập hợp kết quả 23 thí nghiệm bổ sung enzyme cho lợn tiến hành từ 1978
đến 1993 đã thấy rằng chỉ có 4 thí nghiệm trên lợn con là có kết quả rõ rệt (Officer, 1995);
còn đối với lợn sinh trưởng- vỗ béo thì kết quả không rõ rệt (Chu et al., 1998). NSP hoà tan
không làm giảm khả năng tiêu hoá thức ăn của lợn như ở gia cầm. Thacker et al. (1998) cho
biết rằng sự chuyển hoá thức ăn và tăng trọng của lợn 20 kg ăn khẩu phần đại mạch giàu
glucan không có sự khác nhau đáng kể nào khi bổ sung β- glucanase vào khẩu phần thức ăn.
Không giống như gia cầm, pentosanase không làm tăng khả năng hấp thụ thức ăn của lợn con.
Bổ sung pentosanase vào khẩu phần lúa mạch không cải thiện được sự tăng trưởng của lợn
20-25kg (Thacker et al. 1991). Bổ sung β-glucanase cho lợn 80kg làm tăng tỷ lệ tiêu hoá chất
khô và protein nhưng sự cải thiện này quá nhỏ để nâng cao hiệu quả chuyển hoá thức ăn và
tăng trọng.
Tuy nhiên, đối với lợn việc bổ sung phytase thì có hiệu quả rõ rệt, phytase đã làm tăng
tích luỹ khoáng và khả năng hấp thụ thức ăn của lợn, giảm được chi phí thức ăn.
Cần chú ý rằng không có mức tiêu chuẩn bổ sung phytase cho tất cả các khẩu phần,
mức phytase bổ sung phụ thuộc vào loài lợn và loại khẩu phần. Yi et al. (1996) cho thấy rằng
số lượng phytase để giải phóng 1g Phosphorus khác nhau từ 785 U (đối với khẩu phần ngô-đỗ
tương) đến 1146 U (đối với khẩu phần đỗ tương tinh chế). Mặt khác đối với Hoppe et al.

2.1.3. Giảm mùi hôi và cải thiện môi trường chăn nuôi [29]
Chất thải chăn nuôi có khả năng gây ô nhiễm môi trường không khí, đất, nước và đặc
biệt là tầng mặt nước. Ở nước ta, tình trạng này có phần nghiêm trọng do nơi chăn nuôi
thường nằm gần hoặc trong khu dân cư, đặc biệt là khi phần lớn các giếng cung cấp nước sinh
hoạt lại khai thác nước ở tầng nước mặt bị ô nhiễm.
Phosphorus thải ra trong phân của vật nuôi là chất gây ô nhiễm đất và nước ngầm.
Phytase có khả năng làm giảm 30 – 50% lượng phosphorus thải ra môi trường do nó giúp làm
giảm lượng Phosphorus bổ sung và hấp thu tối đa lượng Phosphorus sẵn có trong nguyên liệu.
Phytase cũng giúp giải phóng đạm và axit amin, khiến chúng được tiêu hoá và hấp thu tốt
hơn, qua đó làm giảm lượng thải nitơ và lưu huỳnh nên làm giảm mùi hôi và ô nhiễm nguồn
nước.
SVTH: Võ Thị Tố Nga 4
Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện
2.2. Sơ lược về axit phytic và enzym phytase
2.2.1. Sơ lược về axit phytic
2.2.1.1. Định nghĩa
Axit phytic là axit hữu cơ, phân tử của nó có chứa các gốc phosphate, tồn tại chủ yếu
trong hạt của các hạt ngũ cốc, đậu đỗ, hạt có dầu. Người ta đã xác định được rằng axit phytic
giữ vai trò nhất định và có những tác động ảnh hưởng đến tính chất dinh dưỡng của các loại
hạt trên.
Axit phytic công thức phân tử C
6
H
18
O
24
P
6
và phân tử lượng là 660,04. Danh pháp quốc
tế của axit phytic được gọi là myo – inositol 1,2,3,4,5,6 – hexakisdihydrogen phosphate.

các hạt thực vật khác nhau là không giống nhau. Ví dụ như trong các loại ngũ cốc, axit
phytic được tích luỹ nhiều trong hạt phấn còn đối với các loại đậu thì axit phytic được tích
luỹ nhiều trong các hạt tinh thể của chúng. Nghiên cứu cho thấy rằng, ở cây một lá mầm như
lúa, lúa mì… thì trong nội nhũ và nhân của hạt hầu như không chứa phytate mà lượng
phytate lại được tìm thấy chủ yếu ở phôi và lớp tế bào hạt phấn. Ngược lại, như Ferguson đã
chứng minh ở cây hai lá mầm thì lượng phytate chủ yếu lại nằm trong thành phần nội nhũ
chiếm 99% và chỉ có khoảng 1% là ở trong phôi hay mầm của hạt. Hàm lượng phytate cao
nhất ở hạt ngũ cốc được tìm thấy ở ngô (0,83-2,22%) và các hạt đậu là (5,92-9,1%).
2.2.1.4. Chức năng sinh lý của axit phytic
Phosphorus là một thành phần cấu tạo nên phân tử axit phytic chính vì vậy axit phytic
và các muối của chúng trong các hạt thực vật là một nguồn dự trữ Phosphorus khá dồi dào có
thể tận dụng nhằm cung cấp khoáng chất cho cơ thể. Ngoài ra axit phytic còn là một nguồn
dự trữ năng lượng, nguồn myo-inositol (thành phần cấu tạo nền vỏ ngoài của thành tế bào).
Đối với các hạt thực vật, axit phytic cũng có những ảnh hưởng nhất định đến đặc tính sinh lý
của hạt. Nó tác động đến trạng thái ngủ nghỉ của hạt do nó chống lại sự oxy hoá tự nhiên
SVTH: Võ Thị Tố Nga 6
Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện
(chống lại sự hô hấp) trong quá trình ngủ nghỉ của các hạt thực vật, vì vậy làm chậm sự phát
triển và có thể làm mất khả năng nảy mầm của các hạt này.
Vào cuối thập kỷ 80, đầu thập kỷ 90 người ta đã chứng minh được vai trò gián tiếp của
inositol phosphate trong quá trình vận chuyển vật chất trong tế bào, đặc biệt là vai trò của
inositol-triphosphate. Chúng là dấu hiệu của sự di truyền tính trạng và có liên quan rất lớn
đến sự biến đổi chức năng của tế bào đối với cả tế bào động vật và thực vật. Bên cạnh những
tác động sinh lý nêu trên, người ta dự đoán rằng axit phytic còn có thể có những chức năng
chưa biết khác
2.2.1.5. Hiệu ứng kháng dinh dưỡng của axit phytic
Một đặc tính bất lợi nổi bật nhất của axit phytic đối với cơ thể động vật là hiệu ứng
kháng dinh dưỡng. Hiệu ứng này tạo nên do cấu trúc bất thường của axit phytic. Khi phân tử
axit phytic ở dạng phân ly hoàn toàn, 6 nhóm phosphate của chúng sẽ mang tổng điện tích
âm 12. Vì vậy, chúng có nhiều khả năng thích hợp với các ion dương hoá trị I, II, III hoặc

SVTH: Võ Thị Tố Nga 7
Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện
axit, axit phytic liên kết chặt chẽ với các protein thực vật do đó điểm đẳng điện (pI) của các
protein thực vật lúc này nằm trong khoảng pH = 4 – 5, khoảng pH= 6 – 8 cả axit phytic và
protein thực vật đều mang điện tích âm. Tuy nhiên, ở điều kiện này vẫn có thể hình thành
phức chất giữa axit phytic và protein. Cơ chế xảy ra có thể là sự liên kết trực tiếp của axit
phytic với proton của các nhóm cuối cùng α – NH
2
và ε – NH
2
của gốc lysine tự do hoặc liên
kết qua nhân tố trung gian là một cation đa hoá trị. Cũng bởi liên kết với protein thực vật nên
axit phytic làm giảm khả năng hoà tan và khả năng tiêu hoá của các protein này do đó làm
giảm giá trị dinh dưỡng của chúng.
Ngoài việc tạo phức chất với các khoáng chất và các protein, axit phytic còn tác động
đến các enzyme như trypsine, pepsine, α – amylase, β – galactosidase và kết quả là làm giảm
hoạt tính của các enzyme tiêu hoá quan trọng này.
2.2.2. Sơ lược về enzyme phytase [24, 25, 26]
2.2.2.1. Định nghĩa
Phytase là enzyme xúc tác cho phản ứng thuỷ phân axit phytic (myo – inositol
hexakisphosphate) thành các myo – inositol phosphate phân tử thấp và các monophosphate vô
cơ. Khi phản ứng thuỷ phân xảy ra hoàn toàn sẽ giải phóng toàn bộ các gốc phosphate trong
phân tử axit phytic và tạo thành các myo – inositol tự do.
Phytase có tên gọi đầy đủ, theo quy ước quốc tế là: myo – inositol hexakisphosphat
phosphohydrolase. Uỷ ban danh pháp enzyme thuộc Hội hoá sinh Quốc tế đã chia phytase
thành hai loại là 3-phytase (EC 3.1.3.8) và 6-phytase (EC 3.1.3.26). Các định tên này dựa trên
cơ sở nhóm phosphat đầu tiên được giải phóng khi axit phytic (hay hợp chất phytate) bị tấn
công bởi enzyme.
SVTH: Võ Thị Tố Nga 8
Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện

gồm một tỷ lệ nhất định giữa đầu N của chuỗi manose và galactose. Các nghiên cứu đều cho
thấy rằng sự glycosyl hoá của phytase tái tổ hợp rất cao. Ngược với sự glycosyl hoá một
lượng vừa phải trong nấm mốc A.niger, chúng lại xảy ra rất đa dạng và với một lượng rất lớn
trong nấm men Hansenula polymorpha và Saccharomyces cerevisiae. Điều đáng ngạc nhiên
là hàm lượng glycosyl khác nhau không chỉ giữa các hệ được biểu hiện khác nhau mà còn
giữa các nhóm phytase trong cùng một hệ biểu hiện. Khi phân tích mô hình glycosyl của
phytase từ nấm mốc A.niger thì thấy rằng tính không đồng nhất của chúng đã dẫn đến sự thiếu
hụt 2 trong 10 vị trí N-glycosyl.
Nhìn chung hàm lượng glycosyl có thể có một vài tác động đến tính chất của enzyme.
Thứ nhất, nó có thể ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác hoặc tác động đến tính bền của
enzyme.Thứ hai, nó có thể ảnh hưởng đến tính đẳng điện (pI) của protein enzyme. Thứ ba, sự
tổng hợp năng lượng trao đổi chất có thể thấp hơn mức biểu hiện của protein. Nhưng theo
Wyss & đtg, có một điều đáng ngạc nhiên là glycosyl ở các mức độ khác nhau không ảnh
hưởng đến hoạt tính xúc tác, khả năng chịu nhiệt hay khả năng phục hồi của phytase ở loài
A.niger. Từ sự glycosyl hoá cấu trúc và chức năng của phytase đã dẫn đến câu hỏi liệu chỉ có
2 vị trí N-glycosyl hoá là bảo thủ ở phytase của nấm mốc hay còn ở vị trí nào khác. Han &
đtg đã nghiên cứu vai trò của glycosyl trong việc biểu hiện phytase chức năng của nấm mốc
A.niger trong nấm men Pichia pastoris. Các kết quả nghiên cứu trên đã cho thấy sự giống
nhau trong việc thuỷ phân axit phytic và khả năng chịu nhiệt được cải thiện nhưng không
đáng kể ở enzyme được glycosyl khi biểu hiện trong nấm men P. pastoris so với cùng với
enzyme đó nhưng biểu hiện trong nấm mốc A.niger. Việc khử glycosyl của phytase có thể
làm giảm 34 % khả năng chịu nhiệt của enzyme. Sự khử glycosyl bằng tunicamycin trong quá
trình biểu hiện đã dẫn tới kết quả làm giảm đáng kể sự sản sinh phytase, điều này cho thấy
rằng sự glycosyl hoá rất cần cho quá trình sinh tổng hợp của PhyA tái tổ hợp trong nấm P.
pastoris. Tuy nhiên tunicamycin cũng có thể làm hỏng quá trình sản xuất vì chúng không tích
luỹ phytase nội bào. Mặt khác những nghiên cứu của Wyss đã chỉ ra rằng sự glycosyl hoá
SVTH: Võ Thị Tố Nga 10
Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện
không tác động hoặc chỉ có một tác động nhỏ đến pI của phytase từ nấm mốc được kiểm tra.
Ngoại trừ một trường hợp là phytase được biểu hiện trong nấm men H. polymorpha có sự

động vật.
SVTH: Võ Thị Tố Nga 11
Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện
Năm 1997, Craxton đã tách dòng và biểu hiện inositol polyphosphat phosphatase
(MIPP) từ gan chuột thấy có hoạt tính phytase. Dạng ARN thông tin của MIPP có mặt trong
tất cả các mô của các con chuột đem làm thí nghiệm nhưng chủ yếu tập trung nhiều ở thận và
gan của loài động vật này. Một loại enzyme giống phytase cũng được tìm thấy ở loài động vật
nguyên sinh Paramecium.
2.3.3. Phytase từ nguồn vi sinh vật
Chúng ta đã biết rằng enzyme nói chung và phytase nói riêng đều có mặt trong tất cả
các cơ quan, mô của động vật, thực vật cũng như trong tế bào vi sinh vật. Nguồn vi sinh vật
lại vô cùng phong phú và đa dạng nên phytase cũng như các loại enzyme khác có thể được
sinh ra từ rất nhiều loài vi sinh vật khác nhau.
Những nghiên cứu gần đây của một số tác giả đã chỉ ra rằng phytase của vi sinh vật rất
hứa hẹn cho ứng dụng trong công nghệ sinh học. Shich & đtg đã phân lập được trên 2000 loài
vi sinh vật từ đất có khả năng sinh tổng hợp phytase. Người ta đã phát hiện và tách được
phytase ở một số loài vi khuẩn khác nhau như Aerobacter aerogenes, Pseudomonas sp,
Bacillus subtilis. Escherichia coli, Citrobacter braakii, Enterobacter sp 4, Raoultella sp., vi
khuẩn dạ cỏ kị khí Mitsuokella jalaludinii
Các vi khuẩn lactic cũng có khả năng sinh phytase, nhưng hầu hết trong chúng đều có
hoạt tính thấp. Ngoại trừ một chủng Lactobacillus sanfranciscensis phân lập từ bột ủ chua
được xem như chủng có khả năng sản xuất phytase tốt nhất.
Phytase của vi khuẩn hầu hết được tổng hợp nội bào, ngoại trừ B. subtilis,
Lactobacillus amylovorus và Enterobacter sp 4 là những vi khuẩn sinh tổng hợp phytase
ngoại bào. Hầu hết các chủng sản sinh phytase ngoại bào thuộc nấm sợi. Trong 28 chủng
thuộc chi Aspergillus có khả năng sinh tổng hợp phytase ngoại bào phân lập được có 21
chủng thuộc loài Aspergillus niger. Các nghiên cứu khác của các tác giả Howson và Volfova
còn khẳng định rằng chủng A. niger là nguồn thu phytase ngoại bào tốt nhất. Còn với nấm
men, các chủng là Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Torulopsis candida … cũng
có khả năng sinh phytase. Phytase ngoại bào được tìm thấy ở các chủng Schwanniomyces

K. terrigenes Nội bào
K. oxytoca Nội bào
Pseudomonas sp. Ngoại bào
Enterobacter sp. Ngoại bào
Citrobacter freundii Nội bào
Thực vật
Mầm ngô Nội bào
Hạt đậu tương và các loại đậu Nội bào
Typha latifolia pollen Nội bào
Động vật
Ruột của chuột Nội bào
Gan chuột M ạng lưới nội chất
SVTH: Võ Thị Tố Nga 13
Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện
2.2.2.4. Các tính chất ảnh hưởng đến hoạt tính của phytase [22,24,25,26]
2.2.2.4.1. Nhiệt độ tối ưu cho sự hoạt động của phytase
Khi thuỷ phân axit phytic, phytase có tác dụng cắt đứt các liên kết trong phân tử axit
phytic. Quá trình cắt đứt này xảy ra nhanh hay chậm và hoàn toàn hay không hoàn toàn phụ
thuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt độ phản ứng, pH phản ứng, lượng cơ chất và lượng enzyme.
Nhìn chung, vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác thường tăng lên theo nhiệt độ nhưng
chỉ tăng lên trong một giới hạn xác định, mà ở đó phân tử enzyme vẫn còn bền và chưa bị
biến tính. Nhiệt độ thích hợp cho sự hoạt động của mỗi enzyme thường tương đối rộng.
Nhưng nhiệt độ mà ứng với hoạt độ enzyme cao nhất thường chỉ tồn tại một điểm và nhiệt độ
đó gọi là nhiệt độ tối ưu của enzyme. Nhiệt độ tối ưu của phytase thu được từ các nguồn khác
nhau thì cũng rất khác nhau, dải nhiệt độ này rất rộng, từ 45 – 77
0
C. Tuy nhiên nhiệt độ tối
ưu của một enzyme thường không cố định mà thay đổi tuỳ theo cơ chất, pH môi trường, thời
gian phản ứng … Khi nhiệt độ nằm ngoài khoảng thích nghi, enzyme có thể bị vô hoạt tạm
thời hoặc vô hoạt hoàn toàn. Nhiệt độ mà ở đó enzyme bị mất hoạt tính xúc tác hoàn toàn gọi

0
C. Enzyme này có tính chịu nhiệt và bền với axit. Trong
số các nấm chịu nhiệt, phytase của nấm mốc Thermomycess lanuginosus có hoạt tính tối ưu ở
65
0
C. Ngoài ra người ta còn phân lập được phytase từ chủng nấm mốc Rhizopus oligosporus,
enzyme này có khả năng chịu được nhiệt độ 65
0
C và duy trì được 20% hoạt tính sau khi để ở
80
0
C trong 5 phút.
SVTH: Võ Thị Tố Nga 14
Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện
Năm 1998, Wyss & đtg đã nghiên cứu về tính bền nhiệt của phytase bằng phương pháp
quang phổ huỳnh quang và thiết bị xác định hoạt tính của enzyme, họ đã kết luận rằng
phytase từ nấm mốc A. niger không có tính bền nhiệt và cũng không có khả năng phục hồi
hoạt tính trở lại. Khi nhiệt độ mới chỉ ở 50 – 55
0
C, enzyme đã bị biến tính và chúng không
phục hồi lại được cấu hình, do đó enzyme bị mất tới 70 – 80% hoạt tính. Phytase từ nấm mốc
A. fumigatus tuy cũng không có khả năng chịu được nhiệt độ cao nhưng chúng lại có khả
năng phục hồi hoàn toàn hoạt tính khi đưa trở lại nhiệt độ tối ưu. Chúng có thể phục hồi hoàn
toàn hoạt tính sau 20 phút biến tính ở 90
0
C. Còn phytase của nấm A. niger van Teighem lại
hoạt động tốt ở nhiệt độ 50
0
C, và chúng có thể duy trì 90% hoạt tính sau 24 giờ ở 55
0

do tác nhân nhiệt độ và làm tăng tính bền của enzyme.
Ngoài ra, muối cũng đã được sử dụng để làm tăng tính chịu nhiệt của enzyme. Rượu làm
từ lúa miến khi bổ sung vào tinh bột cũng làm tăng khả năng chịu nhiệt của phytase. Ứng
dụng kỹ thuật protein để làm tăng tính chịu nhiệt của phytase như là thay thế axit amin prolin
và tạo cầu disulfit. Phytate cũng được báo cáo là tác nhân nâng cao hoạt tính của phytase từ
nấm A. adeninivorans. Sự cố định phytase của E. coli và sự đường hoá của phytase của nấm
A. niger biểu hiện trong nấm men S. cerevisiae đã giúp nâng cao tính chịu nhiệt của sản phẩm
enzyme.
2.2.2.4.2. pH tối ưu cho sự hoạt động của phytase
pH của môi trường ảnh hưởng rõ rệt đến phản ứng enzyme vì nó ảnh hưởng đến mức độ
ion hoá cơ chất, enzyme và độ bền của protein enzyme. Đa số các enzyme bền trong giới hạn
pH từ 5 – 9. Độ bền cả enzyme đối với pH môi trường cũng có thể tăng lên khi có cơ chất,
coenzyme và Ca
2+
… pH tối ưu cho hoạt động của phytase thu được từ các nguồn khác nhau
rất khác nhau. pH thích hợp cho hoạt động của chúng thường vào khoảng 2,2 đến 8. Hầu hết
SVTH: Võ Thị Tố Nga 15
Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện
các phytase từ vi sinh vật, đặc biệt của nấm mốc thường có pH tối ưu nằm trong khoảng từ
4,5 đến 5,6. Tuy nhiên trái ngược với phytase từ nấm mốc, phytase của nấm A. fumigatus lại
có khoảng pH tối ưu rộng đạt 80% hoạt tính khi ở pH giữa 4 và 7,3. Phytase của một vài vi
khuẩn, đặc biệt của Bacillus có pH tối ưu ở 6,5 đến 7,5, pH tối ưu của phytase từ hạt thực vật
ở phạm vi từ 4,0 đến 7,5 và hầu hết trong số chúng có pH tối ưu giữa 4,0 và 5,6.
Bảng 2.2: Các đặc tính sinh lý, sinh hoá của phytase từ các phytase từ các nguồn khác nhau
Vi sinh v tậ Nhi t t iệ độ ố
uư
pH Km (mM) Tr ng l ngọ ượ
phân tử
Vi khu nẩ
Bacillus sp. DS11 70 7,0 0,55 45

cứu cho thấy, trong cùng một điều kiện nhất định thì pH tối ưu của phytase ở các chủng được
tìm thấy hầu như chỉ ở một giá trị nhất định, riêng có 2 loại phytase từ A. niger NRRL 3135
và Citrobacter freundii khác với các phytase khác ở điểm là chúng có hai giá trị pH tối ưu
khác nhau. Phytase từ một số vi khuẩn thuộc chi Bacillus có pH tối ưu vào khoảng pH trung
tính (6,5 – 7,5). Còn phytase thu được từ thực vật như hạt đậu và phấn hoa (Hoa Huệ tây) lại
có pH tối ưu cao hơn thường khoảng 8,0.
2.2.2.4.3. Các yếu tố khác ảnh hưởng đến hoạt tính của phytase [24,25]
Các ion kim loại được coi là các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của phytase. Tuy nhiên
rất khó để xác định được liệu khả năng ức chế của các kim loại này do bám trực tiếp vào
enzyme hay là các ion kim loại tạo phức ít hoà tan với axit phytic và điều này đã làm giảm
nồng độ cơ chất hoạt động. Phytase từ Enterobacter sp.4 bị ức chế bởi các ion kim loại Zn
2+
,
Cd
2+
, Ba
2+
,
Cu
2+
và Al
3+
. Tương tự như vậy phytase của B. subtilis (natto) N-77 cũng bị ức chế
mạnh bởi các ion kim loại như là Zn
2+
, Cd
2+
, Ba
2+
, Cu

trong 10 phút khi bổ sung thêm 5mM CaCl
2
. Hoạt tính của enzyme không thể phục hồi khi
trong môi trường phản ứng không có mặt của ion Canxi. Tóm lại, phytase của Bacillus và
phytase của một số loại thực vật khác đều cần ion Ca
2+
cho hoạt tính tối ưu của mình.
Các chất khử như là 2-mercaptoethanol, dithiotreitol và glutathione không ảnh hưởng
lớn đến phytase của vi sinh vật. Người ta cho rằng, các enzyme này hoặc là không có các
nhóm sulhydryl tự do, hoặc các nhóm sulhydryl tự do không đóng vai trò đáng kể trong hoạt
tính và cấu trúc của enzyme. Giả thiết này đã được Kostrewa làm sáng tỏ bằng sự thật là hầu
như các phytase hoàn thiện có một số lượng gốc cystein, các gốc này liên kết với nhau bằng
các cầu nối disulfua như trong trường hợp của phytase từ nấm A. niger. Chức năng của liên
kết disulfua trong phytase của nấm A. ficuum được làm sáng tỏ bằng các nghiên cứu duỗi
xoẵn được thực hiện bởi Ullah và Mullaney. Các tác giả này kết luận rằng cầu disulfua rất cần
thiết cho cấu trúc và hoạt tính của enzyme và đóng một vai trò quan trọng trong việc gấp khúc
protein. Phytase hoàn thiện từ Bacillus dường như không có gốc cystein.
Một cấu trúc đồng đẳng của cơ chất là myo-inositol hexasulfate đã được xem như là một
chất ức chế cạnh tranh có hiệu quả của cả hai enzyme PhyA và Phy B từ nấm A.ficuum. Trị số
ức chế Ki đối với các enzyme PhyA và PhyB được ước lượng khoảng 4,6 và 0,2 M, lần lượt
theo thứ tự. Floride cũng được biết như là một chất ức chế của các phytase và phosphatase
khác. Phytase từ nấm đậu tương bị ức chế mạnh mẽ bởi floride, vanadate và phosphate vô cơ.
Còn đối với phytase của vi khuẩn và nấm mốc, phosphat vô cơ lại là nguyên nhân ức chế cạnh
tranh của phytate. Florua cũng ức chế phytase kiềm từ phấn hoa loa kèn và ức chế cạnh tranh
phytase từ K. terrigena. Phytase của K. terrigena cũng bị ức chế bởi phosphate, molybdate và
vanadate. Molybdate và vanadate cũng được biết là chất ức chế phosphatase.
Nồng độ cơ chất khoảng 300µM đã ức chế một enzyme giống phytase tách chiết từ
Paramecium. Phytase của Klebsiella sp.và Rhizopus oligosporus cũng bị ức chế bởi cơ chất
nhưng ở nồng độ cao hơn. Hoạt tính phytase của nấm mốc cũng bị ức chế bởi nồng độ cơ chất
vượt quá 1mM. Theo một số tác giả khác phytase từ rễ ngô và hạt đậu tương bị ức chế ở các

-1
S
-1
. Giá trị này là giá trị cao nhất
đã được đưa ra của phytase. Tính đặc hiệu của phytase từ nấm mốc đối với cơ chất là axit
phytic thay đổi gần 10 lần từ 23U/mg đến 198 U/mg đối với nấm A. fumigatus và A. terrus lần
lượt. Theo Wyss &đtg, khuôn mẫu và phạm vi khác của sự glycosil hoá không có ảnh hưởng
đáng kể đến tính đặc hiệu của phytase nấm mốc. Tính đặc hiệu của phytase từ vi khuẩn thay
đổi gần 100 lần từ 8,7 U/mg đến 811 U/mg đối với (B. subtilis và E.coli, lần lượt). Dựa vào
tính đặc hiệu cơ chất, phytase có thể phân chia thành hai lớp: lớp phytase có phổ đặc hiệu cơ
chất rộng như phytase của A. fumigatus, E. nidulans và M. thermophila và lớp phytase với
tính đặc hiệu cơ chất cao hơn đối với axit phytic. Phytase với tính đặc hiệu cơ chất rộng,
nhưng đối với axit phytic lại thể hiện tính đặc hiệu cơ chất thấp (23 đến 43 U/mg). Ngược lại,
phytase với tính đặc hiệu cơ chất hẹp nhưng lại thể hiện tính đặc hiệu cơ chất cao đối với axit
phytic (103 – 811 U/mg). Phytase của Bacillus không nằm trong phân lớp này. Loại phytase
từ vi khuẩn này dường như có tính đặc hiệu thấp đối với axit phytic. Tính đặc hiệu thấp này
đã gây trở ngại cho ứng dụng chúng trong công nghiệp.
2.2.2.6. Trung tâm hoạt động và cơ chế tác dụng
Phosphatase axit thuộc enzyme dạng khác mà có khả năng thuỷ phân ester photphate và
hoạt động tối ưu ở pH thấp. Một số photphatase axit từ tế bào eukaryot và prokaryot đều có
chung 2 vùng trình tự tương đồng, mỗi trình tự quay xung quanh một gốc histidin bảo thủ.
SVTH: Võ Thị Tố Nga 19
Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện
Khuôn mẫu thống nhất của 2 vùng được chỉ ra trong cơ sở dữ liệu protein SWISS-PROT là
[LIVM]-X(2)-[LIVMA]-X(2)-[LIVM]-X-R-H-[GN]-X-R-X-[PAS] và [LIVMF]-X-
[LIVMFFAG]-X(2)-[STAGI]-H-D-[STANQ]-X-[LIVM]-X(2)-[LIVMFY]-X(2)-[STA].Khi
so sánh trình tự các sản phẩm của gen pho3 và pho5 trong nấm men, tuyến tiền liệt của người
và phosphatase axit trong lysosom với PhyA và PhyB của nấm mốc A. niger NRRL 3135 cho
thấy vùng 7 axit amin có trình tự RHGXRXP là bảo thủ gần với tận cùng đầu N. Phosphatase
axít chứa trung tâm hoạt động trên được phân vào nhóm histidine axit phosphatase. Trung tâm

monophosphate nào được tạo thành.
Trên thực tế, sản phẩm cuối cùng của quá trình thuỷ phân axit phytic bởi các phytase
khác nhau không nhất thiết phải giống nhau mặc dù con đường thuỷ phân axit phytic là giống
nhau. Nhóm 3 – phytase bắt đầu thuỷ phân liên kết phosphate ở vị trí D-3 giải phóng ra D-
Ins-(1,2,4,5,6)P
5
như là sản phẩm trung gian đầu tiên. Nhóm 6-phytase bắt đầu thuỷ phân ở vị
trí l-6 hoặc D-4 và sản phẩm trung gian đầu tiên tạo ra là L-Ins(1,2,3,4,5)P
5
. Powar &đtg đã
cho biết myo-inositol monophosphate (vị trí của phosphat chưa được xác định) là sản phẩm
cuối cùng của phản ứng thuỷ phân axit phytic bằng phytase của B. subtilis. Động lực học,
phản ứng trung gian và con đường khử axit phytic bởi phytase từ B. subtilis chưa được biết và
cũng chưa xác định được chúng thuộc nhóm 3-phytase hay 6-phytase . Theo Barrientos, một
loại phytase kiềm được tách từ phấn hoa lily đã thuỷ phân axit phytic ở vị trí D5 bằng 2 bước
loại bỏ phosphat để tạo thành sản phẩm cuối cùng là Ins(1,2,3) P
3
. Inositol triphosphat cũng là
sản phẩm của quá trình thuỷ phân axit phytic bằng phytase của phấn hoa Typha latifolia.
Kerovue đã chứng minh rằng PhyC giải phóng 3 trong 6 nhóm phosphat của axit phytic.
Axit phytic (InsP
6
) bị thuỷ phân theo kiểu bậc thang bởi Phytase C để nhanh chóng bị thuỷ
phân thành myo-inositol pentaphosphate (InsP
5
) và sau đó thành myo-inositol tetraphosphate
(InsP
4
) cuối cùng thành myo-inositol triphosphate (InsP
3

ny. ng vt nhai li tiờu hoỏ phytate thụng qua hot ng ca enzym phytase tit ra t h vi
sinh vt trong d c. Phosphate vụ c c gii phúng t phytate bi phytase c c h vi
sinh vt d c v ng vt ch s dng. Tuy nhiờn, cỏc hot ng cú d dy mt ngn nh
ln, gia cm v cỏ li khụng th bin dng axit phytic v chỳng thiu phytase h rut v d
dy. Do ú, ngi ta thờm phosphate vụ c, bt u nnh v cỏc loi bt cú hm lng
phospho tng cao vo thc n gia sỳc ỏp ng yờu cu phosphate ca c th ng vt. Vic
ny lm tng chi phớ cho cỏc nh chn nuụi gia sỳc v tng ụ nhim phospho cho mụi trng.
Cỏc vn ny cú th c gii quyt bng cỏch b sung phytase vi sinh vt vo thc n gia
sỳc hoc dựng cỏc loi ng cc cú hm lng phytase cao lm thc n gia sỳc.
SVTH: Vừ Th T Nga 22
phytic
acid
D/L-Ins(1,2,4,5,6)P
5
D/L-Ins(2,3,4,5,6)P
5
D/L-Ins(1,2,3,4,5)P
5
D/L-Ins(1,2,3,5,6)P
5
Ins(2,4,5,6)P
4
Ins(2,4,6)P
3
Ins(1,2,3,5)P
4
Ins(1,3,5)P
3
OH
OH

Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện
2.2.2.8.2. Trong công nghiệp thực phẩm
Ngũ cốc, hạt có dầu và các loại đậu là các loại nguyên liệu phổ biến trong chế biến thực
phẩm. Điều này dẫn đến một lượng phytate lớn được tiêu thụ vào trong cơ thể con người.
Phytate trong hệ ruột không được tiêu hoá sẽ tác động xấu đến sự hấp thụ Kẽm, Canxi,
Magiê, Sắt. Hơn nữa, nó còn ức chế hoạt động của các enzym tiêu hoá. Do đó, việc bổ sung
phytase vào nguyên liệu trước khi chế biến có ý nghiã lớn. Phytase đã được bổ sung vào quá
trình chế biến bột mì để làm giảm lượng axit phytic trong các loại bánh dùng bột mì (trong
bánh mì , axit phytic chiếm 0,29 – 1,05%) phytase thích hợp cho quá trình này cần có pH tối
ưu ở 4,5 – 5, nhiệt độ tối ưu 30
0
C và không phụ thuộc vào ion Ca
2+
.
2.2.2.8.3. Trong tổng hợp myo – inositol phosphate
Các dẫn xuất myo – inositol phosphate dùng trong sản xuất inositol phosphate và
phospholipid cần cho quá trình vận chuyển các tín hiệu qua màng tế bào và vận chuyển Canxi
từ các nguồn dự trữ nội bào. Phytase chuyển đổi axit phytic thành các dẫn xuất myo – inositol
phosphate nhỏ hơn myo – inositol tự do và phosphate vô cơ, do đó có thể dùng phytase trong
công nghiệp sản xuất inositol hoặc inositol phosphate.
2.2.2.8.4. Trong nghành nuôi trồng thuỷ sản [9]
Trong nuôi trồng thuỷ sản, protein thức ăn đóng vai trò quyết định cho sự tăng trưởng và
phát triển vật nuôi. Thông thường, nguồn protein thức ăn dựa vào vào nguồn cá tạp hay bột cá
sẵn có. Tuy nhiên, ngày nay khuynh hướng giảm tỉ lệ sử dụng bột cá trong thức ăn thuỷ sản
và chăn nuôi ngày càng mạnh mẽ. Ngoài tác động do giá cả còn do tiến độ khoa học trong
dinh dưỡng cho phép thay thế bột cá bằng các protein thực vật sẵn có, rẻ tiền nhưng không
làm thay đổi sức tăng trưởng của vật nuôi. Tuy nhiên bên cạnh sự phát trưởng protein thực vật
trong thức ăn thuỷ sản, vấn đề trở ngại lớn nhất là khả năng tiêu hoá và hấp thụ các chất dinh
dưỡng trong thức ăn chứa nhiều protein thực vật.
Các protein thực vật như bã đậu nành, bã đậu phộng có chứa một số chất kháng dinh

2.3. Sơ lược về cá Tra [1, 2, 4, 7, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 21,24]
2.3.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tiêu hóa [4]
- Khối lượng thức ăn: lượng thức ăn càng nhiều thì sự tiêu hóa càng chậm trễ, mức sử
dụng thức ăn càng thấp. Khi lượng thức ăn nhỏ, tốc độ tiêu hóa nhanh hơn, triệt để hơn và
enzym tiêu hóa ngấm vào thức ăn nhanh hơn.
- Chất lượng thức ăn: khả năng tiêu hóa phụ thuộc vào loại thức ăn (thức ăn chứa đạm,
đường, xơ…)
- Nhiệt độ: mức độ tiêu hóa thức ăn ở những nhiệt độ khác nhau là khác nhau.
- Tuổi: trong thời kỳ tăng trưởng của cá, sự tiêu hóa thức ăn tăng lên theo mức độ
trưởng thành. Sự phụ thuộc của quá trình tiêu hóa vào tuổi cá rất phức tạp do nhiều
nguyên nhân, trước hết là do sự hoàn thiện hóa cơ quan tiêu hóa và hệ enzym tiêu hóa.
SVTH: Võ Thị Tố Nga 24
Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện
2.3.2. Nhu cầu phosphorus trong khẩu phần thức ăn của cá [12, 13, 14, 16, 17, 18, 19,
21]
Ngược lại với Canxi, Phosphorus có rất ít trong nước và phải được bổ sung vào khẩu
phần thức ăn để đáp ứng nhu cầu trao đổi chất của thuỷ sinh. Khoảng 80% phosphorus trong
cơ thể cá thì liên quan những phần mô cứng [19]. Phosphorus cũng là một thành phần của
dạng muối phospho hữu cơ như nucleotic, phospholipid, coenzyme, axit deoxyribonucleotic,
axit ribonucleotic. Muối phospho vô cơ cũng được dùng như là một chất đệm quan trọng để
duy trì pH ổn định của dung dịch nội bào và ngoại bào [19].
Những thông tin liên quan đến sự hấp thụ phosphorus của cá và các loài giáp xác thì khá
hạn chế. Sự hấp thụ phosphorus qua môi trường nước của cá đã được xác định [18] mặc dù số
lượng phosphorus đáng kể không được hấp thụ theo cách này bởi vì trong nước biển và nước
ngọt hàm lượng phosphorus thấp. Nhìn chung nồng độ phosphorus trong nước còn thấp bởi vì
sự hấp thu phosphorus thông qua thức ăn ở ruột thì rất là cần thiết để thoả mãn nhu cầu trao
đổi chất. Sự dự trữ và thu nhận thức ăn có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố mà điều đó có
thể điều khiển sự hấp thụ Canxi. Phosphorus chủ yếu được bài tiết ra khỏi cơ thể thông qua
nước tiểu mặc dù số lượng lớn phosphorus không hấp thụ được từ thức ăn bị mất trong phân
[18].