Bộ khoa học và công nghệ - Bộ Y tế

Trung tâm khoa học sản xuất văcxin sabin
================================================= Đề tài độc lập cấp nhà nớc
Bớc đầu nghiên cứu công nghệ sản xuất
văcxin sởi tại việt nam qui mô
phòng thí nghiệm


CN. Đặng Mai Dung
BS. Đoàn Văn Lu
TS. Nguyễn Thị Quỳ
BS. Nguyễn Anh Thu
CN. Trần văn Dụ
CN. Nguyễn Thanh Thuỷ
BS. Nguyễn Thị Thờng
BS. Nguyễn Thị Thắng

Các cơ quan tham gia:
Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng
3
Chữ viết tắt ADN Deoxyribonucleic Acid
(Axit deoxyribonucleic)
ARN Ribonucleic Acid
(Axit ribonucleic)
Bộ KHCN&MT Bộ Khoa học Công nghệ và Môi trờng
BTP Bán thành phẩm
CCID
50
Cell Culture Infective Dose 50%
(Liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy)
CEC Chicken Embryonate Cell
(Tế bào phôi gà)

(Tổ chức Y tế Thế giới) 5

mục lục Trang
Chơng 1: Mở đầu
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu của đề tài 2
1.3. Nội dung nghiên cứu 2
1.3.1. Sản xuất vắcxin sởi qui mô phòng thí nghiệm 2
1.3.2. Đánh giá chất lợng vắcxin 2

Chơng 2: Tổng quan tài liệu
2.1. Virút học 3

3.3.6. Thử nghiệm quan sát tế bào chứng 28
3.3.7. Thử nghiệm hấp phụ hồng cầu 29
3.3.8. Thử nghiệm tìm virút ngoại lai của mẻ gặt trên nuôi cấy tế bào 29
3.3.9. Thử nghiệm tìm virút ngoại lai của nớc nổi trên nuôi cấy tế bào.30
3.3.10. Thử nghiệm xác định hàm lợng Albumin bò tồn d 31
3.3.11. Thử nghiệm phát hiện Mycoplasma 31

Chơng 4: Kết quả và bàn luận
4.1. Kết quả sản xuất 33
4.1.1. Kết quả quá trình ấp trứng gà 33
4.1.2. Kết quả của quá trình tách và nuôi cấy tế bào 34
4.1.3. Kết quả quan sát tế bào 35
4.1.4. Kết quả đếm tế bào 36
4.1.5. Kết quả sử dụng tế bào 37
4.1.6. Kết quả tìm hiểu yếu tố ảnh hởng tới gây nhiễm virút 37
4.1.7. Vắcxin bán thành phẩm 39
4.1.8. Kết quả sản xuất vắcxin thành phẩm 41
4.2. Kết quả kiểm tra chất lợng 42
4.2.1. Kết quả kiểm tra nuôi cấy tế bào 42
4.2.2. Kết quả kiểm tra mẻ gặt đơn trớc lọc 44

7
4.2.3. KiÓm tra v¾cxin b¸n thµnh phÈm 46
4.2.4. KiÓm tra v¾cxin thµnh phÈm 49
Ch−¬ng 5: KÕt luËn
10 bệnh truyền nhiễm có tỷ lệ tử vong cao ở nớc ta.
Bệnh sởi phòng ngừa đợc bằng văcxin. Hiệu lực bảo vệ của văcxin sởi đạt trên
90%. Nhiều nớc trên thế giới đã khống chế đợc bệnh sởi nhờ sử dụng văcxin. ở
Việt Nam nhờ thực hiện tiêm phòng sởi cho trẻ dới một tuổi mà tỷ lệ mắc đã giảm đi
rõ rệt từ 30,9 trờng hợp/100.000 dân năm 1987 xuống còn 18,84/100.000 dân năm
1999. Văcxin sởi bất hoạt, kể từ khi ra đời những năm đầu thập kỷ 60 đã nhanh
chóng bị loại bỏ vì khả năng bảo vệ kém. Hiện nay tất cả các nhà sản xuất trên thế
giới đều sản xuất văcxin sởi sống giảm độc lực. Có nhiều chủng virut nổi tiếng đợc
sử dụng hiện nay nh AIK-C, CAM, Schwarz, TD97 đợc sử dụng ở Mỹ, Nhật, Pháp,
Bỉ; chủng L-16 đợc sử dụng ở Nga, Đức; chủng Hu191 đợc sử dụng ở Trung
Quốc Tất cả các chủng này đều có độ an toàn cao và khả năng bảo vệ tốt.

9
Việt Nam đã sản xuất đợc nhiều loại văcxin phục vụ cho công tác phòng bệnh.
Trong 10 loại vắcxin thiết yếu đợc dùng trong chơng trình TCMR hiện nay chúng
ta đã tự sản xuất đợc 9 trừ vắcxin sởi. Nhu cầu về văcxin sởi ở nớc ta rất cao, đặc
biệt khi thực hiện chơng trình khống chế bệnh sởi. Theo khuyến cáo của TCYTTG,
mỗi trẻ cần đợc tiêm 2 mũi văcxin sởi thay cho 1 mũi trớc đây. Nh vậy nhu cầu về
vắcxin sởi sẽ lên tới 6 - 7 triệu liều một năm. Để đáp ứng đợc nhu cầu này chúng ta
sẽ phải hoàn toàn nhập ngoại. Nh vậy là sẽ tốn kém và thụ động. Chính vì vậy mà
Bộ KH CN&MT và Bộ Y tế đã giao cho chúng tôi thực hiện đề tài này với nội dung
"Bớc đầu nghiên cứu công nghệ sản xuất vắcxin sởi tại Việt Nam qui mô phòng
thí nghiệm" để dần từng bớc chúng ta sẽ sản xuất đợc vắcxin và cung cấp đủ cho
nhu cầu trong nớc.
1.2. Mục tiêu của đề tài
1.2.1. Xây dựng qui trình và sản xuất ra vắcxin sởi qui mô phòng thí nghiệm
1.2.2. Thử nghiệm, đánh giá chất lợng vắcxin sởi ở mức độ phòng thí nghiệm.
1.3. Nội dung nghiên cứu
1.3.1. Sản xuất vắcxin sởi qui mô phòng thí nghiệm
- Nuôi cấy tế bào phôi gà một lớp


Hình 2-1: Sơ đồ cấu tạo của hạt virút sởi
H: Hemagglutinin protein ; F: Fusion protein; M: Matrix protein;
L: Large protein: NP: Nucleoprotein, P: Photphorynate protein
Lớ
p
Li
p
it
kép
H &F
M
ARN
L
P
N
P11

3' N P M F H L 5'
1688 1657 1473 2377 1949 6639 2 4 6 8 10 12 14
Kilobazơ
Các tính chất
khác
N 1688 523 58111 60000 Nucleo-
cápsit
Protein cấu
trúc của
nucleo-capsit
photpho
protein, nằm
sâu trong
ARN, chiếm
25% tổng số Pr
của hạt virút
P 1657 507 53900 68000 Nucleo-
cápsit
Thành phần
cấu trúc của
phức hợp men
polymeraza
Photpho
protein, có tính
axit, chiếm
10% tổng số Pr
của hạt virút
M 1473 335 37714 39000 Trong vỏ Liên kết giữa
vỏ và
nucleocapsit
có tính bazơ,

protein virút
2.2. Lâm sàng bệnh sởi
2.2.1. Đặc điểm của ban sởi
- Ban xuất hiện tuần tự từ sau tai lan ra đầu mặt cổ sau đó lan xuống thân mình
và tứ chi.
- Ban màu đỏ, một số có thể kết hợp lại xen kẽ với những nốt ban là các khoảng
da khoẻ mạnh.
- Ban mất đi cũng tuần tự theo nh lúc xuất hiện.
- Sau khi ban lặn xuất hiện các nốt thâm thẫm mầu trên da tạo nên hình vằn da
hổ.
2.2.2. Tiến triển điển hình của bệnh sởi
Ngày của bệnh 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
40
39
38
37
36
Nhiệt độ cơ thể
(
o
C) Giai đoạn tiền
triệu (xuất tiết)

Giai đoạn ngoại ban

Giai đoạn lui bệnh
Hạt Koplik

(M) sẽ có ái lực với vỏ và nucleocapsit để hình thành nên hạt virút. Còn theo cách thứ
2) khi các tế bào đã liên kết với nhau thì virút không cần phải giải phóng ra ngoài.
Các loại tế bào nhạy cảm với virút sởi nh tế bào thận khỉ, thận ngời, thận
chuột lang, thận cừu, tế bào phôi gà tiên phát, các loại tế bào thờng trực nh : Vero,
KB (tế bào ung th biểu mô hầu họng) và Hela. Tế bào B95a đợc chuyển thể bởi
virút Epstein-Barr từ nguyên bào lympho của khỉ đuôi sóc gần đây đợc xem là nhạy
cảm nhất với virút sởi. Tỷ lệ nhân lên của virút sởi là thấp. Chúng bắt đầu nhân lên
trong tế bào cả Vero và KB 20 giờ sau khi thâm nhiễm và chúng đạt đỉnh cao vào
ngày thứ 4-6. Sau đó tế bào giữ đợc tốc độ sản sinh virút. Số lợng virút tạo ra trên tế
bào KB vẫn giữ ở tỷ lệ cao cho đến ngày thứ 12. Trong thời gian đó tế bào chủ dần
dần thoái hoá. Số lợng virút giải phóng ra

14
ngoài chỉ bằng 1/10 đến 1/100 số lợng virút tổng hợp đợc và chúng đợc xem là
hầu hết virút tổng hợp đợc đều dính chặt vào tế bào chủ. Hiệu giá HA bắt đầu tăng 4
ngày sau khi thâm nhiễm. Điều đó chứng tỏ rằng số lợng hạt virút làm tăng hiệu giá
HA. Đối với tế bào Vero hiệu giá HA và sự thâm nhiễm giảm kể từ ngày thứ 12. Tế
bào khổng lồ đợc hình thành đối với tế bào Vero lớn hơn rất nhiều so với tế bào KB.
Cuối cùng tế bào khổng lồ bị dung giải liên quan đến các bớc của quá trình nhân lên
của virút. Một lý do mà virút sởi nhân lên trong tế bào KB lâu hơn có thể là do chúng
ít tạo thành tế bào khổng lồ.
Mặt khác virút rất dễ bị bất hoạt bởi nhiệt và tia cực tím. Hiệu giá thâm nhiễm
giảm 1/2 khi hỗn dịch virút đợc giữ ở 4
o
C trong 12 giờ. Chúng chỉ còn 1/10 khi giữ ở
33
o
C trong 15 giờ và 37
o
C trong 5 giờ, và chỉ còn 1/100 khi ở 37

bệnh nhân SSPE có kháng thể kháng thành phần M rất thấp. So sánh 9 chủng virut
khác nhau bằng kháng thể đơn dòng đã phát hiện ra rằng protein M thay đổi trong
các quyết định kháng nguyên.
Đánh giá hiệu quả sau khi tiêm chủng bằng xác định kháng thể trong máu và so
sánh trớc khi tiêm vắc xin với sau khi tiêm vắcxin ít nhất 4 tuần. Thờng sử dụng
phản ứng ức chế ngăn ngng kết hồng cầu (HI) để xác định hiệu giá kháng thể. Hiệu
giá kháng thể cao ở giai đoạn đầu, nó vẫn tồn tại kéo dài từ 1 1,5 năm sau tiêm.
Sau đó giảm dần từ 1/2 1/3 trong vòng 5 năm.
2.5.Sinh bệnh học
Con ngời bị nhiễm bệnh qua đờng hô hấp. Virút xâm nhập vào hệ thống bạch
huyết, có thể ở thể tự do hoặc liên kết với các đại thực bào, và đi tới các hạch bạch
huyết. Tại đây virút nhân lên mạnh mẽ nhng không gây huỷ hoại nhiều tế bào, và có
một số lan truyền sang các hạch bạch huyết khác, tới lách. Những tế bào đơn nhân bị
nhiễm sẽ tạo thành tế bào đa nhân khổng lồ, tế bào lympho T nhạy cảm với virút sởi
khi chúng đang hoạt động. Khoảng 6 ngày sau khi bị nhiễm xuất hiện virút trong máu
và các hạt virút lan truyền khắp cơ thể. Vì biểu mô liên kết chỉ có 1 hoặc 2 lớp tế bào
nên chúng bị huỷ hoại trớc tiên, chỉ 9-10 ngày sau khi bị nhiễm. Sau đó các triệu
chứng bệnh cấp tính xảy ra nh ho, chảy nớc mũi, phù nề mô liên kết, sốt cao, xuất

16
hiện hạt Koplik. Các triệu chứng này giảm đi khi ban xuất hiện. Cũng trong giai đoạn
này, trong máu ngoại vi xuất hiện kháng thể kháng virút sởi.
2.6. Dịch tễ học bệnh sởi
2.6.1. Đặc điểm dịch tễ của bệnh sởi
Virút sởi có khả năng lây nhiễm rất mạnh so với các tác nhân gây bệnh đợc
biết cho đến nay. Bệnh có triệu chứng lâm sàng điển hình. Khi ngời không có kháng
thể kháng lại virút sởi bị nhiễm virút sởi thì sẽ bị bệnh, chỉ một số rất ít không có
triệu chứng. Tuy nhiên, có một số trờng hợp mà trẻ bị phơi nhiễm với virút trong khi
kháng thể do mẹ truyền sang đã giảm nhng vẫn không có biểu hiện lâm sàng. Sởi
đợc biết đến nh là một bệnh của trẻ nhỏ, tất cả mọi ngời nhạy cảm với virút đều có

giữ đợc virút sởi sau mỗi vụ dịch. Virút biến mất trong giai đoạn giữa 2 vụ dịch và
nguồn lây chủ yếu là do những bệnh nhân từ cộng đồng lớn mang tới trong thời gian ở
đó xảy ra dịch. Trong cộng đồng dân c nhỏ dịch xảy ra theo kiểu thứ III. Dịch xảy
ra không liên tục và không theo một qui tắc nào cả.
Kiểu I
Kiểu II

Kiểu III

18

2.6.2. Tình hình mắc bệnh sởi ở Việt Nam

2.7.2.1. ở Nhật Bản
Trớc kia sử dụng vắcxin sởi chết, nhng sau đó huỷ bỏ vì có phản ứng phụ và
xuất hiện thể sởi không điển hình.
Hiện nay đang sản xuất và sử dụng vắcxin sởi sống giảm độc lực, có 4 chủng
virút sởi : Schwarz, CAM, AIK - C, TD - 97 đang đợc sử dụng để sản xuất vắc xin
này. Mỗi chủng đều thích nghi ở nhiệt độ thấp, nhng độ nhậy cảm nhiệt độ của
vắcxin phụ thuộc vào chủng virút dùng để sản xuất.
1970 1975 1980 1985 1990

Schwarz Schwarz FF8

CAM - 70

AIK - C

TD 97

Chủng AIK - C và Schwarz FF8 có nguồn gốc từ chủng Edmonston. Chủng
CAM - 70 và TD - 97 có nguồn gốc từ chủng Tanabe là chủng đợc phân lập ở Nhật.
Lịch sử các chủng gốc đang đợc sử dụng để sản xuất vắcxin sởi sống giảm
độc lực ở Nhật.

20

HK/24
HA/28
MK/1 MK(32
0
C)/1
HK/3 GPK(32
0
C)/37
MK/1 GPK(32
0
C)/5
HK/5 CEF(32
0
C)/7
MK/1 MK(32
0
C)/1
CE/90 CEF(32
0
C)/2
HK/2 MK(32
0
C)/2
CE/4
CAM/35
CEF (26
0
C)/12

thứ 32.
Chủng này hiện nay đợc dùng ở viện văcxin và huyết thanh Bắc Kinh và viện
văcxin và sinh phẩm Vũ Hán Trung Quốc. Trong một nghiên cứu về huyết thanh học
và dịch tễ học sau khi tiêm văcxin sởi đợc sản xuất từ chủng Hu191 trên 503 trẻ từ 6
đến 15 tháng tuổi, từ năm 1991 đến 1998 thấy rằng: tỷ lệ đáp ứng miễn dịch đạt
91,65%, hiệu giá kháng thể trung bình nhân đạt 1:266,74. Tuổi gây miễn dịch là một
yếu tố rất quan trọng quyết định tỷ lệ đáp ứng miễn dịch. Qua nghiên cứu cho thấy trẻ
dới 6 tháng tuổi có tỷ lệ đáp ứng thấp hơn rõ rệt so với trẻ trên 8 tháng tuổi.
2.8. Sử dụng vắcxin sởi
Trình bày vắcxin dới dạng đông khô, có chất bảo quản và kháng sinh. Nó có
mầu đỏ trong suốt khi hoàn nguyên. Vắcxin đông khô đợc bảo quản dới 5
0
C trong
điều kiện không có ánh sáng. Hiệu giá của vắcxin không dới 1.000 CCID
50
/ 1 liều.
Vắc xin đợc tiêm dới da, tiêm cho trẻ từ 9 tháng tuổi .
Trong vùng dịch sởi khuyến cáo phải tiêm cho trẻ từ 18 tháng đến 36 tháng
tuổi. Vắcxin này có thể tiêm quanh năm, nhng tốt nhất nên tránh vào thời điểm giữa
mùa hè hoặc đang giai đoạn có dịch sởi lu hành.
Chống chỉ định : Những ngời nhiễm HIV nên tránh không tiêm chủng vắcxin
Sởi.
Hiện tại có hai loại vắcxin sởi : vắcxin sởi sống giảm độc và vắcxin sởi chết.
Vắcxin sống giảm độc rất có hiệu quả phòng bệnh sởi, do vậy nó đợc tiêm cho trẻ
em 9 tháng tuổi để phòng bệnh sởi ở mọi hình thái lâm sàng.
Vắcxin chết, trong quá trình sản xuất đã phá huỷ protein kháng nguyên hoà
màng, do vậy kháng thể hình thành sau khi tiêm vắcxin không đủ để kháng lại mọi
kháng nguyên của virút sởi. Vì vậy nếu nhiễm virút sởi hoang dại, ngời đã tiêm có
thể bị sởi không điển hình, đó là nguồn lây không biết rõ nên khó phòng.


o
C/ qua đêm

Gặt, Lọc, Cho chất bảo quản

Đóng lọ, Đông khô

3.2. Vật liệu và phơng pháp sản xuất
3.2.1. Chủng virút Hu-191
Chủng do Viện vắcxin và huyết thanh Bắc Kinh, Trung Quốc cung cấp 23
Lịch sử của chủng Hu-191
Virút Sởi
(Phân lập từ một bệnh nhân nam 2 tuổi ở Thợng Hải năm 1960)

HK/33 lần cấy truyền

HAM/39 lần cấy truyền

CEC/16 lần cấy truyền Đợc cấp phép năm 1965

CEC/P22 Từ đây cho đến P32 dùng cho ngời

CEC/P30 Việt Nam

Sơ đồ 3-1: Lịch sử chủng virút sởi Hu-191.

3.2.2. Trứng gà SPF

- Tủ ấm 33
o
C, 37
o
C Harman - Đức
- Tủ lạnh, tủ đá
- Kính hiển vi lộn ngợc - Nhật
- Hốt vô trùng
- Lọc millipore - Mỹ
- Máy đông khô Virtis - Mỹ

3.2.4. Các loại môi trờng cần thiết.
3.2.4.1 Dung dịch trypsin
STT
Thành phần hóa học
Hng sản xuất
số g/l
1 NaCl Sigma 80
2 KCl Merck 2
3 KH
2
PO
4
Merck 2
4 Na
2
HPO
4
.12 H
2

2
O Merck 3,16
6 Gluco Labosi 20
7 Red Phenol BDH 0,02
Kháng sinh : Kanamycin
Chống nấm : Fugizon
Nớc cất 2 lần vừa đủ 1 lít
3.2.4.3. Môi trờng phát triển LH (0,2% Lactabumin Hydrolyzat - 3% huyết thanh
bê)
- Lactabumin Hydrolyzat : 2 g/l
- Huyết thanh bê : 30 ml/l
- Môi trờng Earle : vừa đủ 1 lít
3.2.4.4. Môi trờng duy trì: 199 (Sigma)
3.2.4.5. Môi trờng bảo quản.
STT Thành phần hoá học Hng sản xuất Số g/l
1 Sodium Glutamat Labosi 16
2 UREA Labosi 8,3
3 Arginin Merck 2,7
4 Succoze Labosi 50
5 Gelatin BDH 10
6 Albumin, Human Sigma 2
Đợc pha trong môi trờng 199