BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐH QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH
CHƢƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƢỚC KC.04/06-10
BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI/DỰ ÁN
NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT
INSULIN TÁI TỔ HỢP PHỤC VỤ ĐIỀU
TRỊ BỆNH ĐÁI THÁO ĐƢỜNG
MÃ SỐ KC.04.09/06-10 Cơ quan chủ trì đề tài/dự án: Trƣờng ĐH Khoa học Tự Nhiên
Chủ nhiệm đề tài/dự án: PGS.TS. Phạm Thành Hổ TP Hồ Chí Minh – 2010

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐH QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH
CHƢƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƢỚC KC.04/06-10
BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI/DỰ ÁN
NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT
INSULIN TÁI TỔ HỢP PHỤC VỤ ĐIỀU TRỊ

Danh mục hình…………………………………………………………… xii
Danh mục bảng………………………………………………………… xxxi
Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt………………………………………. .xxxvi
Danh mục chủng E. coli đã sử dụng………………………………… xxxix
Danh mục vector đã sử dụng……………………………………………. xlii
BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI………………I
PHẦN I. MỞ ĐẦU…………………………………………………… 1
1. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THUỘC
LĨNH VỰC CỦA ĐỀ TÀI 2
1.1. Tình hình bệnh ĐTĐ trên thế giới 2
1.2. Tình hình bệnh ĐTĐ ở Việt Nam 3
1.3. Thuốc điều trị bệnh ĐTĐ 4
1.4. Cấu trúc, sự hình thành và tác dụng của insulin 5
1.5. Sản xuất insulin điều trị bệnh ĐTĐ 7
2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 12
3. LUẬN GIẢI VỀ VIỆC ĐẶT RA MỤC TIÊU VÀ
NHỮNG NỘI DUNG CẦN NGHIÊN CỨU 14
3.1. Tạo dòng biểu hiện mini-proinsulin 14
3.2. Nghiên cứu công nghệ lên men, thu
sinh khối và đồng nhất sinh khối E. coli

ii
tái tổ hợp quy mô 100 lít dịch lên men 18
3.3. Nghiên cứu công nghệ tạo insulin
có hoạt tính từ MPI 19
3.4. Nghiên cứu công nghệ tinh chế
insulin người tái tổ hợp 22
3.5. Thử nghiệm hoạt tính insulin tái tổ hợp 23
3.6. Nghiên cứu đặc tính và kiểm soát
chất lượng insulin tái tổ hợp 23

3.1. Nghiên cứu công nghệ tạo insulin có
hoạt tính từ MPI dạng thể vùi 309
3.1A. Nghiên cứu công nghệ tạo insulin có
hoạt tính từ 6xHis-MPI dạng thể vùi 316
3.1B. Nghiên cứu công nghệ tạo insulin có
hoạt tính từ 10xHis-MPI dạng thể vùi 337
3.2. Nghiên cứu công nghệ tạo insulin có
hoạt tính từ 6xHis-FTNh-MPI dạng tan 362
3.3. Nghiên cứu công nghệ tạo insulin có
hoạt tính từ DsbA-6xHis-MPI dạng tan 375
CHƯƠNG 4. NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ TINH CHẾ
MPI TÁI TỔ HỢP 387
4.1. Công nghệ tinh chế insulin tái tổ hợp từ
6xHis-MPI quy mô phòng thí nghiệm 387

iv
4.2. Công nghệ tinh chế insulin tái tổ hợp từ
6xHis-MPI quy mô pilot 407
4.3. Công nghệ tinh chế insulin tái tổ hợp từ
10xHis-MPI quy mô phòng thí nghiệm 420
4.4. Công nghệ tinh chế insulin tái tổ hợp từ
10xHis-MPI quy mô pilot 426
CHƯƠNG 5. THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH INSULIN
TÁI TỔ HỢP 432
5.1. Giới thiệu chung 432
5.2. Nội dung thực hiện 435
5.3. Vật liệu và phương pháp 435
5.4. Kết quả và biện luận 436
5.5. Kết luận 441
CHƯƠNG 6. NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH VÀ KIỂM SOÁT

quy trình tạo dòng biểu hiện mini-proinsulin 566
PHỤ LỤC 2. Vật liệu và phương pháp sử dụng trong
nghiên cứu công nghệ lên men, thu sinh
khối và đồng nhất sinh khối E. coli
tái tổ hợp quy mô 100 lít dịch lên men 594

vi
PHỤ LỤC 3. Vật liệu và phương pháp sử dụng cho quy
trình công nghệ tạo insulin có hoạt tính từ MPI 629
PHỤ LỤC 4. Vật liệu và phương pháp sử dụng cho quy
trình tinh chế insulin tái tổ hợp từ MPI 642
PHỤ LỤC 5. Vật liệu và phương pháp sử dụng trong
thử nghiệm hoạt tính insulin tái tổ hợp 649
PHỤ LỤC 6. Vật liệu và phương pháp sử dụng trong
nghiên cứu đặc tính và kiểm soát
chất lượng insulin tái tổ hợp 653
PHỤ LỤC 7. Vật liệu và phương pháp sử dụng trong
nghiên cứu hiệu quả chế phẩm insulin
nguyên liệu điều trị bệnh ĐTĐ 655
PHỤ LỤC 8. Dược điển Anh 657
DANH MỤC SẢN PHẨM DẠNG 2 (Tập tài liệu đính kèm).
DANH MỤC SẢN PHẨM DẠNG 3 (Tập tài liệu đính kèm).
KẾT QUẢ ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC (Tập tài liệu đính kèm).


Hình 2. Trình tự axít amin và các cầu nối S-S trong cấu trúc
proinsulin người 10
Hình 3. Đặc điểm của mini-proinsulin 11
Hình 4. Sơ đồ protein dung hợp 6xHis-MPI và 10xHis-MPI 16
Hình 5. Sơ đồ dung hợp MPI với DsbA-6xHis với vị trí cắt
TEV protease 17
Hình 6. Sơ đồ dung hợp MPI và FTNh với vị trí cắt trypsin
giữa FTNh và MPI 18
Hình 7. Sơ đồ công nghệ sau lên men để thu nhân insulin
có hoạt tính từ 3 loại MPI khác nhau 22
PHẨN 2. NỘI DUNG KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐÃ THỰC
HIỆN
Hình 1.1.1. Bảng mã di truyền và tần số sử dụng 28
Hình 1.1.2. Sơ đồ tổng hợp gen bằng phương pháp PCR tái tổ hợp 34
Hình 1.1.3. Sơ đồ các bước thiết kế gen mã hóa MPI thay đổi codon 43
Hình 1.1.4. Giao diện trang web của ngân hàng gen NCBI
xuất mã số trình tự gen mã hóa insulin người 44
Hình 1.1.5. Sơ đồ các bước tổng hợp đoạn DNA
mang gen mã hóa MPI bằng PCR tái tổ hợp 45
Hình 1.1.6. Sơ đồ cấu trúc chủng E. coli DH5α mang plasmid pBIns 48

xiii
Hình 1.1.7. Chương trình chạy PCR tổng hợp gen mã hóa MPI 49
Hình 1.1.8. Trình tự nucleotide của gen mã hóa insulin người 52
Hình 1.1.9. Trình tự nucleotide và axít amin của proinsulin người 53
Hình 1.1.10. Codon đã được tối ưu hóa bằng phần mềm GeneDesigner 54
Hình 1.1.11. Sự tương đồng giữa gen mã hóa MPI
và gen mã hóa proinsulin người 55
Hình 1.1.12. Độ phù hợp tương đối của các codon
của gen mã hóa MPI 55

mang gen 10xhis-mpi trên plasmid pHTI
và sản phẩm biểu hiện 10xHis-MPI 69
Hình 1.2.3. Sơ đồ dòng hóa gen 6xhis-mpi vào plasmid
pET43.1a tạo plasmid pET43Ins 73
Hình 1.2.4. Chương trình cài đặt máy điều nhiệt
cho phản ứng PCR khuẩn lạc 75
Hình 1.2.5. Các bước tạo dòng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins
biểu hiện 6xHis-MPI ở dạng thể vùi 76
Hình 1.2.6. Kết quả biến nạp sản phẩm nối vào tế bào E. coli DH5α 80
Hình 1.2.7. Kết quả sàng lọc dòng tế bào E. coli DH5α
mang plasmid tái tổ hợp bằng PCR
khuẩn lạc với cặp mồi Ins1F/Ins4R 82
Hình 1.2.8. Kết quả chọn lọc dòng E. coli DH5

mang
plasmid pET43Ins bằng phương pháp cắt giới hạn 82
Hình 1.2.9. Kết quả so sánh trình tự gen 6xhis-mpi
trên pET43Ins và pBIns 83
Hình 1.2.10. Kết quả tách chiết và kiểm tra vector pET43Ins 85
Hình 1.2.11. Kết quả biến nạp vector pET43Ins vào chủng
E. coli BL21(DE3) trên môi trường LB-Amp100 86
Hình 1.2.12. Kiểm tra vector pET43Ins thu nhận
từ dòng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins 88
Hình 1.2.13. Kết quả phân tích sự biểu hiện 6xHis-MPI 90
Hình 1.2.14. Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện protein
6xHis-MPI bằng phần mềm Quantity-One 91

xv
Hình 1.2.15. Sơ đồ dòng hóa gen 10xhis-mpi vào
plasmid pET43.1a tạo plasmid pHTI 95

Hình 1.3.5. Sơ đồ thiết kế cấu trúc biểu hiện đoạn DNA mang gen
6xhis-ftn
h
-mpi trên plasmid pET-FI và sản phẩm
biểu hiện 6xHis-FTNh-MPI 123
Hình 1.3.6. Sơ đồ dòng hóa gen ftn
h
và mpi vào plasmid pET28a
tạo plasmid pET-FI 127
Hình 1.3.7. Sơ đồ dòng hóa gen dnak vào plasmid pET-43.1a
tạo plasmid p43DnaK 128
Hình 1.3.8. Chương trình cài đặt máy luân nhiệt cho phản ứng PCR
khuếch đại gen mpi, dnak và ftn
h
130
Hình 1.3.9. Sơ đồ cấu trúc chủng E. coli BL21(DE3)/pET-FI+p43DnaK
biểu hiện protein dung hợp 6xHis-FTNh-MPI
dạng tan trong tế bào chất 131
Hình 1.3.10. Chương trình cài đặt máy điều nhiệt cho phản ứng PCR
kiểm tra sự hiện diện của plasmid pET-FI và p43DnaK
trong dòng E. coli BL21(DE3)/pET-FI+p43DnaK 133
Hình 1.3.11. Sản phẩm khuếch đại gen ftn
h
và mpi 135
Hình 1.3.12. Biến nạp sản phẩm nối mpi và pFTNH đã
xử l Hind III và XhoI vào tế bào E. coli DH5α 136
Hình 1.3.13. Kết quả kiểm tra dòng E. coli DH5

mang
plasmid pET-FI bằng phương pháp cắt giới hạn 138

Hình 1.4.4. Khoảng không gian chu chất ở tế bào Gram (-) 155
Hình 1.4.5. Sơ đồ thiết kế cấu trúc biểu hiện đoạn DNA mang gen
dsbA-6xhis-mpi trên plasmid p39TI và sản phẩm
biểu hiện DsbA-6xHis-MPI 158
Hình 1.4.6. Sơ đồ thiết kế plasmid tái tổ hợp p39TI 161
Hình 1.4.7. Chương trình PCR khuếch đại gen mpi 162
Hình 1.4.8. Các bước tạo dòng E. coli BL21(DE3)/p39TI biểu
hiện DsbA-6xHis-MPI ở dạng tan trong chu chất 166
Hình 1.4.9. Sản phẩm khuếch đại gen mpi 170
Hình 1.4.10. Biến nạp sản phẩm nối mpi và pET-39b đã xử l

xviii
Kpn I và EcoR I vào tế bào E. coli DH5α 171
Hình 1.4.11. Kết quả sàng lọc dòng E. coli DH5α
mang plasmid tái tổ hợp bằng PCR khuẩn
lạc với cặp mồi TEVIns-F/TEVIns-R 172
Hình 1.4.12. Kết quả chọn lọc dòng E. coli DH5 mang
plasmid p39TI bằng phương pháp cắt giới hạn 173
Hình 1.4.13. Kết quả so sánh trình tự gen mpi trên p39TI và l thuyết 174
Hình 1.4.14. Kết quả tách chiết và kiểm tra vector p39TI 175
Hình 1.4.15. Điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại gen mpi từ p39TI 176
Hình 1.4.16. Kết quả biến nạp vector p39TI vào chủng
E. coli BL21(DE3)trên môi trường LB-Kan50 177
Hình 1.4.17. Kiểm tra vector p39TI thu nhận từ dòng
E. coli BL21(DE3)/p39TI 178
Hình 1.4.18. Kết quả phân tích sự biểu hiện DsbA-6xHis-MPI
của chủng E. coli BL21(DE3)/p39TI 180
Hình 1.4.19. Kết quả phân tích sự biểu hiện DsbA-6xHis-MPI
của chủng E. coli BL21(DE3)/p39TI
ở các phân đoạn khác nhau 181

và sự tạo thành 6xHis-MPI 213
Hình 2.1.12. Sự tăng trưởng của chủng E. coli
BL21(DE3)/pET43Ins trong hệ thống
lên men 5 lít với 5 lít môi trường MT4 216
Hình 2.1.13. Hình thái khuẩn lạc của chủng E. coli
BL21(DE3)/pET43Ins trong hệ thống
lên men 5 lít với 5 lít môi trường MT4 217
Hình 2.1.14. Sự tăng trưởng của chủng E. coli
BL21(DE3)/pET43Ins và sự tạo thành 6xHis-MPI
trong hệ thống lên men 5 lít với 5 lít môi trường MT4 218

xx
Hình 2.1.15. Sự tăng trưởng của chủng E. coli
BL21(DE3)/pHTI và sự biểu hiện 10xHis-MPI
trong hệ thống lên men 50 lít x 2 220
Hình 2.1.16. Kết quả kiểm tra và xác nhận sự biểu hiện của
10xHis-MPI trên môi trường LB+Amp lỏng
bằng phương pháp SDS-PAGE và lai Western blot 222
Hình 2.1.17. Kết quả động học tăng trưởng của chủng E. coli
BL21(DE3)/pHTI trên 10 loại
môi trường đang khảo sát 224
Hình 2.1.18. Xác nhận sự biểu hiện của protein 10xHis-MPI 226
Hình 2.1.19. Ảnh hưởng của pH môi trường lên sự tăng
trưởng của chủng E. coli BL21(DE3)/pHTI
và sự tạo thành 10xHis-MPI 227
Hình 2.1.20. Ảnh hưởng của tỷ lệ nạp giống cấp 1 lên
sự tăng trưởng của chủng E. coli BL21(DE3)/pHTI
và sự tạo thành 10xHis-MPI 229
Hình 2.1.21. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy lên sự tăng trưởng
của chủng E. coli BL21(DE3)/pHTI

Hình 2.1.31. Ảnh hưởng của nhiệt độ cảm ứng lên sự tăng trưởng
của chủng E. coli BL21(DE3)/pET-FI+p43DnaK
và sự tạo thành 6xHis-FTNh-MPI. 249
Hình 2.1.32. Sự tăng trưởng của chủng E. coli
BL21(DE3)/pET-FI+p43DnaK trong hệ thống
lên men 5 lít với 5 lít môi trường MT4. 252

xxii
Hình 2.1.33. Hình thái khuẩn lạc của chủng E. coli
BL21(DE3)/pET-FI+p43DnaK trong hệ thống
lên men 5 lít với 5 lít môi trường MT4. 253
Hình 2.1.34. Sự tăng trưởng của chủng E. coli
BL21(DE3)/pET-FI+p43DnaK và sự
tạo thành 6xHis-FTNh-MPI trong hệ thống
lên men 5 lít với 5 lít môi trường MT4 254
Hình 2.1.35. Sự tăng trưởng của chủng E. coli
BL21(DE3)/pET-FI+p43DnaK và sự biểu hiện
6xHis-FTNh-MPI trong hệ thống lên men 50 lít x 2 257
Hình 2.1.36. Kết quả động học tăng trưởng của chủng E. coli
BL21(DE3)/p39TI trên 10 loại môi trường đang khảo sát 260
Hình 2.1.37. Ảnh hưởng của pH môi trường lên sự tăng trưởng
của chủng E. coli BL21(DE3)/p39TI
và sự tạo thành DsbA-6xHis-MPI 261
Hình 2.1.38. Ảnh hưởng của tỷ lệ nạp giống cấp 1 lên sự
tăng trưởng của chủng E. coli BL21(DE3)/p39TI
và sự tạo thành DsbA-6xHis-MPI 263
Hình 2.1.39. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy lên sự tăng trưởng
của chủng E. coli BL21(DE3)/p39TI và sự tạo
thành DsbA-6xHis-MPI 265
Hình 2.1.40. Ảnh hưởng của nhiệt đô cảm ứng lên sự tăng

áp lực 14000psi. 300
Hình 2.3.7. Kết quả khảo sát khả năng phá tế bào với áp lực 16000psi 300
Hình 2.3.8. Kết quả khảo sát khả năng phá tế bào với áp lực 18000psi 301
Hình 2.3.9. Kết quả khảo sát khả năng phá tế bào với áp lực 20000psi 301
Hình 2.3.10. Kết quả khảo sát khả năng phá tế bào với áp lực 22000psi 301