bộ khoa học và công nghệ Bộ y tế
chơng trình khoa học và công nghệ
phục vụ chăm sóc và bảo vệ sức khỏe cộng đồng
báo cáo tóm tắt dự án sản xuất thử nghiệm cấp nhà nớc
hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin
viêm gan A bất hoạt qui mô 100.000 liều/năm
m số KC.10-DA12
5972
10/8/2006

(axít desoxyribonucleic)
ARN Ribonucleic acid
(axít ribonucleic)
ALT Alanin transferaza
AST Asparagin Transferaza
CDC Centers for Disease Control and Prevention
(Trung tâm kiểm soát bệnh tật và dự phòng- Mỹ)
cADN Complementary ADN
(ADN bổ sung)
ĐƯMD Đáp ứng miễn dịch
ED50 Effective dose 50
(Liều gây miễn dịch 50%)
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay
(thử nghiệm miễn dịch gắn enzym)
ELU ELISA Unit
(Đơn vị ELISA)
GMT Geometric mean titer
(hiệu giá trung bình nhân)
HAV Hepatitis A Virus
(Virút viêm gan A)
HLA kháng nguyên bạch cầu ngời
HT Huyết thanh
IFN interferon-
IFN interferon-
IFN

interferon-
kD kilodalton
(kilôdalton)
LH

VSDTT¦ VÖ Sinh DÞch TÔ Trung ¦¬ng
VX V¾cxin
WSV Working seed virus
( Chñng s¶n xuÊt) mục lục

Đặt vấn đề 1
CHƯƠNG 1 : Vật liệu và phơng pháp 2
1.1. Hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan A bất hoạt
2
1.2. Xây dựng tiêu chuẩn Quốc gia cho vắcxin viêm gan A bất hoạt 3
1. 2.1. An toàn chung 3
1. 2.2. Kiểm tra vô khuẩn 3
1.2.3. Kiểm tra chất gây sốt 3
1.2.4. Kiểm tra chất hấp phụ Al(OH)3 4
1.2.5. Kiểm tra hàm lợng Formaldehyt 4
1.2.6. Kiểm tra hàm lợng protein toàn phần 4
1.2.7. Kiểm tra công hiệu 4
1.3. Phơng pháp đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch của
vắcxin viêm gan A bất hoạt trên thực địa lâm sàng 5
1.3.1. Đối tợng nghiên cứu. 5
1.3.2. Vật liệu nghiên cứu 5
1.3.3. Phơng pháp nghiên cứu 5
CHƯƠNG 2: Kết quả và bàn luận 8
2.1. Hoàn thiện qui trình sản xuất vắc xin viêm gan A bất hoạt 8
2.1.1 Hiệu giá vi rút viêm gan A trong quá trình nuôi cấy8
2.1.2. Hiệu giá vi rút viêm gan A trong quá trình tinh khiết virút 8
2.1.3 Hàm lợng Protein toàn phần 8

HAV ở những vùng dịch lu hành cao. Mức độ lu hành của HAV trong
cộng đồng là cực kỳ cao. Các nghiên cứu huyết thanh-dịch tễ học ở
Bangladesh, Bhutan, India, Maldive và Nepal chứng minh rằng 85-95% trẻ
em ở 10 tuổi đã có miễn dịch với HAV. Chỉ có một số ít trẻ bị nhiễm phát
triển thành các trờng hợp nhiễm trùng có triệu chứng. Nghiên cứu căn
nguyên các trờng hợp viêm gan rải rác ở các nớc này chứng minh rằng
nhiễm HAV chịu trách nhiệm tới khoảng 10-25% tất cả các trờng hợp
viêm gan ở trẻ em, trong khi nhiễm ở ngời lớn thờng chỉ là 1-5%. Dịch
viêm gan A thờng xẩy ra ở các thành phố có liên quan đến việc sử dụng
nguồn nớc uống và thực phẩm không an toàn.
Kết quả nghiên cứu huyết thanh-dịch tễ học ở Indonesia và Thái Lan
cho thấy huyết thanh dơng tính ở trẻ em giảm xuống trong năm 1994-
1995 (30-35%) so với kết quả nghiên cứu đã tiến hành vào năm 1977-1978
(85-90%) ở trẻ em tuổi từ 7-12 tuổi. Đây có thể là kết quả cải thiện tiêu
chuẩn vệ sinh, làm sạch môi trờng, thiết bị nớc uống và cũng do giảm
mạnh sự lu hành của HAV.
ở Việt nam nhiều nghiên cứu về HAV cũng đã đợc tiến hành và cho
thấy HAV là nguyên nhân chủ yếu các trờng hợp viêm gan cấp tính
(29%), 59% trong số đó có độ tuổi > 20 tuổi. Những nghiên cứu khác cho
thấy 90% dân ở nông thôn có anti-HAV (IgG) thuộc tuổi thanh niên.
Tình hình dịch tễ học HAV đang thay đổi ở nhiều nớc. Với việc tăng
cờng tiêu chuẩn vệ sinh ở nhiều nớc tỷ lệ nhiễm HAV ở trẻ nhỏ đã giảm
đi nhiều, thậm trí cả ở những nớc và vùng có dịch lu hành cao, song các

2
ổ dịch thấp đang xuất hiện. Do đó ở nhiều nớc đang chuẩn bị phải đón
nhận các trờng hợp viêm gan A lâm sàng ngày càng tăng ở những trẻ lớn
hơn và ngời lớn. Mặc dù đã có vắcxin tốt, song giá thành rất đắt và vì vậy
không có khả năng tiêm đại trà đợc. Các sinh phẩm chẩn đoán viêm gan A
hiện nay cũng rất đắt do đó cũng hạn chế việc sử dụng để thử nghiệm trớc

chất lợng và các thành phần của các loạt vắcxin viêm gan A do Việt nam
sản xuất so sánh với tiêu chuẩn của TTYTTG.
3. Đánh giá hiệu lực của vắcxin viêm gan A trên thực địa lâm sàng
giai đoạn III, theo dõi tính an toàn, phản ứng phụ, đáp ứng miễn dịch trên
nhóm ngời tình nguyện, đánh giá hiệu lực của vắcxin viêm gan A với cỡ
mẫu n = 300. Xác định liều tiêm và lịch tiêm phù hợp cho các đối tợng
khác nhau.
4
Chơng 1
Tổng quan

1. Những hiểu biết hiện nay về virút viêm gan A
1.1. Lịch sử virút viêm gan A
Hội chứng vàng da đã đợc mô tả trong lịch sử từ thế kỷ thứ 8. Tuy
nhiên đến tận thế kỷ 17, 18 và 19 những vụ dịch vàng da lớn đã đợc mô tả
đầy đủ hơn. Năm 1947, Mac Callum đã đa ra cụm từ viêm gan A và viêm
gan B để phân biệt các loại viêm gan virút. Những cụm từ này đã đợc Uỷ
ban Viêm gan virút của Tổ chức y tế thế giới công nhận. Virút viêm gan A
đợc xác định lần đầu tiên bằng kính hiển vi điện tử năm 1973 nhờ
Feinstone. Năm 1979 Provost và Hilleman đã thành công trong nuôi cấy
virút viêm gan A trên tế bào, mở đầu cho những nghiên cứu phát triển

quyết định nguyên của protein capsit có thể rất bền vững trong quá trình
nuôi cấy lâu dài. Mặc dù quá trình chế biến sau phiên dịch và số phận cuối
cùng của đầu kết thúc amino của polyprotêin biểu thị vẫn cha đợc xác
định rõ ràng, một đoạn tín hiệu cho qúa trình myrin hoá ở vị trí axit amin
thứ bảy sau Methionin thứ nhất với một vùng VP4 ngắn giả thiết rằng khả
năng có một đầu dẫn peptit tắt (L).
VP1 là một protein có khả năng hoạt động bề mặt chính trong
picornavirut. Xác định trình tự dựa trên vùng VP1/2A phân loại đợc 7
genotýp khác nhau. Bốn trong số các genotýp đó có liên quan đến khả năng
gây bệnh cho ngời (I,II,III và VII). Genotýp I và III đợc tìm thấy phổ
biến trong các nghiên cứu trong khi genotýp II và VII mỗi loại chỉ đợc đại
diện bằng một chủng phân lập. So sánh bằng vùng VP1 cho thấy 23,7 %
biến đổi ở mức độ nucleotit và 10,5% biến đổi ở mức độ axit amin giữa các

6
chủng phân lập đợc. Nghiên cứu của Mauro Costa Mattioli và cộng sự đã
tìm thấy đột biến trong vùng VP1 với sự biến mất của 15 axit amin cho
thấy khả năng của đột biến trốn thoát kháng thể trung hòa. Một nghiên cứu
khác tìm thấy đột biến của vùng VP1 với sự biến mất của 18 nucleotit của
chủng HAV thích ứng trong nuôi cấy tế bào. Vùng gen mã hóa cho 2A của
picornavirut đại diện cho vùng hay thay đổi nhất trong genom. Trong khi
2A có chức năng proteolytic trong entero và rhinovirut thì ở các virút khác
không tìm thấy trình tự kiểu proteaza hoặc hoạt tính catalytic. Cấu trúc gen
vùng 2A và kích thớc vẫn còn cha đợc xác định rõ. Một vài nghiên cứu
đã chỉ ra rằng kích thớc của 2A và 2B không giống nh phỏng đoán ban
đầu. Việc xóa bỏ 10 đến 15 axit amin trong protein 2A chỉ có một tác động
rất nhỏ trong nuôi cấy HAV trên tế bào và gan khỉ đuôi sóc. Mặc dù đột
biến vùng P2 (protein 2C và 2B) cần thiết cho khả năng thích ứng của
chủng HM175 và các chủng HAV khác trong nuôi cấy tế bào, đột biến của
vùng 5 không dịch mã cũng có vai trò quan trọng .

không giống nh phần lớn các picornavirút đã đợc biết rõ đặc tính khác.
Thậm trí ở điều kiện tối u thì chu trình sao chép của HAV đợc thực hiện
và kéo dài trên 24 đến 48 giờ. Sự sao chép có liên quan đến hủy hoại tế bào
hiếm khi gặp trừ khi các chủng virút khác nhau phải đợc chọn lọc một
cách thận trọng, ở một vài hệ tế bào, và với điều kiện nuôi cấy đợc xác
định chặt chẽ . Không có sự làm suy sụp sinh tổng hợp đại phân tử ở tế bào
chủ. Nhìn chung một nhiễm trùng dai dẳng đã đợc xác định và virút tiền
gen còn lại một lợng lớn trong tế bào.Trong một vài trờng hợp có thể cần
tới 2 đến 3 tuần nuôi cấy để đạt đợc hàm lợng virút thậm trí 100 đến
10.000 lần thấp hơn, thí dụ, hàm lợng poliovirút trong cùng điều kiện nuôi
cấy tế bào đặc hiệu.
Đặc điểm nhân lên của virút viêm gan A là một trở ngại lớn trong việc
sản xuất và mở rộng qui mô sử dụng vắcxin viêm gan A. Việc nuôi cấy
HAV rất khó đạt đợc hiệu suất cao hoặc không tạo ra hủy hoại tế bào để

8
có thể quan sát đợc. Bằng cách sử dụng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang
Provost đã xác định đợc HAV cấy truyền 31 lần trên khỉ đuôi sóc có thể
nuôi cấy đợc trên tế bào. Kháng nguyên virút phần lớn là protein nội bào.
Thời gian để có đợc lợng kháng nguyên HAV tối đa trong nuôi cấy tế
bào có thể giảm sau khi cấy truyền liên tiếp. Nhiều dòng tế bào tiên phát và
tế bào thờng trực của động vật linh trởng thích hợp cho việc nuôi cấy
HAV, mặc dù kết quả nuôi cấy phụ thuộc vào chủng virút, loại tế bào và
nhiệt độ. Dòng tế bào cảm nhiễm với HAV bao gồm tế bào thận khỉ xanh
châu Phi tiên phát và thứ phát, tế bào thận khỉ cynomologus sơ sinh, tế bào
thận khỉ Rhesus bào thai (FRhK-4), tế bào thận khỉ cercopithecus, tế bào
gan Alexander, tế bào màng ối FL, và tế bào lỡng bội bào thai ngời (WI-
38 và MRC-5). Tế bào thận khỉ xanh châu Phi tiên phát (AGMK), tế bào
nguyên bào sợi của ngời và dòng tế bào phổi lỡng bội ngời (MRC5)
thờng đợc sử dụng trong sản xuất vắcxin viêm gan A. Hiệu giá của HAV

duy trì đáp ứng miễn dịch lâu dài. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng kháng
thể trung hòa có thể đợc tạo ra ở chuột khi gây miễn dịch bằng protein
virút riêng lẻ VP1,VP2 hoặc VP3. Hơn nữa, vị trí gây miễn dịch trung hòa
đã đợc tìm thấy trên protein capsit VP3 của HAV.
Một kho tàng các số liệu nghiên cứu viêm gan A đợc lu trữ trong hơn
một nửa thế kỷ đã củng cố quan điểm cho rằng các chủng virút có tính chất
sinh bệnh học và kháng nguyên thay đổi sẽ không xẩy ra . Bất kỳ lúc nào
các quan sát dịch tễ và lâm sàng cho rằng có sự thay đổi về các tính chất
sinh học cơ bản của virút, nh khi có dịch viêm gan do nguồn nớc gây nên
ở Delhi năm 1956, thì nghiên cứu sau này đã phát hiện thêm một tác nhân
căn nguyên không có liên quan, cũng là một tác nhân virút truyền nhiễm
đờng ruột, một viêm gan không A, không B ( hiện nay đợc mô tả là virút
viêm gan E). Sự ổn định và đồng nhất kháng nguyên của HAV có thể là kết
quả theo dõi tiêm glôbulin miễn dịch huyết thanh ngời bảo vệ đợc viêm
gan A trên toàn thế giới, không phụ thuộc vào nguồn gốc địa lý của chế
phẩm glôbulin miễn dịch đã đợc sử dụng.

10

Hình 2 : Cấu trúc genom HAV và các sản phẩm mã hóa

1.3. Sinh bệnh học
Nhiễm trùng tự nhiên với HAV thờng xẩy ra sau khi nhiễm virút theo
đờng tiêu hóa do các chất bị nhiễm phân có chứa HAV. Quá trình từ khi
virút xâm nhập theo ống tiêu hóa cho đến khi gây ra hậu quả viêm gan vẫn
cha đợc hiểu biết đầy đủ. Mặc dù vị trí sao chép đầu tiên của HAV là tế
bào gan, quá trình tự nhiên của các vật thể cảm thụ trên tế bào chủ đối với
tác nhân vẫn cha đợc xác định rõ. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu đã cho
biết sự kết dính của virút đối với tế bào là phụ thuộc vào canxi. Trong giai
đoạn ủ bệnh, trạng thái virút huyết xuất hiện đồng thời với sự đào thải virút

ngời ta cho rằng prôtêin virút đợc mã hoá có mặt trên bề mặt của tế bào
bị nhiễm. Sự đáp ứng qua trung gian tế bào này đối với nhiễm HAV trong
gan có lẽ chịu trách nhiệm phần lớn thơng tổn gan kèm theo viêm gan A
cấp tính khi virút nhân lên mạnh mẽ và tiếp đến là khởi đầu hủy hoại tế bào

12
gan và sự nhân lên của phần lớn các biến chủng HAV là không gây thơng
tổn hủy hoại tế bào ở các giòng tế bào nuôi. Tế bào đơn nhân cũng xâm
nhập vào bức tranh toàn cảnh trong tổ chức học của viêm gan A cấp tính.
Mặc dù vai trò của interferon trong điều trị viêm gan A cha đợc xác định
rõ, song quá trình nhân lên của HAV có lẽ là hoàn toàn nhậy cảm với
interferon- (IFN

) và IFN

. Tuy nhiên IFN


không đợc sản xuất từ
nguyên bào sơ bị nhiễm và chứng cớ để sản xuất IFN

vẫn còn đang tranh
cãi. Mặt khác IFN

nh đã biết sẽ đợc sản xuất từ lymphô bào T trong đáp
ứng với viêm gan A cấp tính và có lẽ đóng vai trò chủ yếu trong sinh bệnh
học của căn bệnh này. Hơn nữa, đối với hiệu quả kháng virút trực tiếp,
IFN

có thể khởi động các tế bào lymphô gây độc bằng cách gây cảm ứng

HAV, một dấu ấn quan trọng thờng đợc xác định là IgM anti-HAV.
Kháng thể này tăng cao nhanh chóng trong 4 đến 6 tuần, rồi giảm xuống
dới mức phát hiện trong vòng 3 đến 6 tháng ở phần lớn các bệnh nhân.
Trên 85% các trờng hợp men gan vẫn bình thờng trớc khi hoặc tại thời
điểm IgM anti-HAV biến mất. IgG anti-HAV có thể phát hiện đợc trong
vòng 1 hoặc 2 tuần của giai đoạn cấp tính và thay thế IgM. IgG có thể tồn
tại nhiều năm sau khi nhiễm HAV.
Ngoài các phơng pháp xác định kháng thể IgG hoặc IgM anti-HAV
trong huyết thanh bệnh nhân, nhiều kỹ thuật sinh học phân tử đã đợc áp
dụng nhằm tăng cao độ nhậy và độ đặc hiệu trong chẩn đoán. Kỹ thuật lai
ghép đã phát hiện đợc virút với nồng độ 10
4
-10
5
PFU/ml. Tuy nhiên, kỹ
thuật này thiếu độ nhậy cần thiết để phát hiện trực tiếp hạt virút vơi số
lợng nhỏ trong thực phẩm. Hiện nay, phản ứng chuỗi polymeraza - sao
chép ngợc là kỹ thuật duy nhất cho phép phát hiện virút đờng ruột trong

14
thực phẩm. Nhiều nghiên cứu đã cho rằng kỹ thuật này cho phép phát hiện
virút có nồng độ từ 10- 10
5
PFU/ml trong thực phẩm sau khi cô đặc mẫu
bằng sử dụng miễn dịch từ trờng.

1.6. Điều trị
Hiện nay không có điều trị đặc hiệu với viêm gan virút cấp. Liệu pháp
điều trị mang tính chất hỗ trợ và mục đích là duy trì nghỉ ngơi và dinh
dỡng hợp lý. Yêu cầu cung cấp 10% glucoza bởi vì bệnh nhân viêm gan

ARN trong phân trẻ sơ sinh tới 4-5 tháng sau khi bị nhiễm.
Sự đào thải của virút qua phân là nguyên nhân chủ yếu gây nên những
vụ dịch ở các trung tâm chăm sóc trẻ sơ sinh, quân đội, nhà trẻ và trong
cộng đồng. Ngợc lại với kiểu lây truyền giữa ngời ngời, sự bùng nổ
của các vụ dịch thờng do nguồn thực phẩm hoặc nớc uống chung bị
nhiễm phân.
Một vài vụ dịch lớn liên quan đến việc tiêu thụ sò sống hoặc không
đợc nấu chín từ nguồn nớc ô nhiễm với nớc thải. Vụ dịch lớn nhất gần
đây xẩy ra ở Thợng Hải năm 1988 với hơn 300.000 ca bệnh.
Các nghiên cứu về hình thái lây truyền cùng với các kỹ thuật sinh học
phân tử đã chỉ ra rằng trạng thái virút huyết có thể tồn tại 7 đến 10 ngày
trớc khi có triệu chứng lâm sàng. Lây truyền HAV qua máu hiếm gặp
nhng có thể xẩy ra do sau truyền máu bị nhiễm virút viêm gan. 17Hình 4 : Bản đồ dịch tễ học nhiễm HAV trên thế giới

Có 4 hình thái nhiễm HAV trên thế giới dựa trên tỷ lệ mang kháng thể
anti-HAV liên quan đến tuổi. Các hình thức này biến đổi từ vùng có tỷ lệ
cao nh châu Phi, một phần châu á và Mỹ La tinh, nơi có phần lớn các
trờng hợp nhiễm HAV xẩy ra trong thời kỳ thơ ấu cho đến vùng có tỷ lệ
thấp và rất thấp nh Bắc Mỹ và Tây Âu, nơi phần lớn các trờng hợp nhiễm
xẩy ra ở ngời trởng thành. Các trờng hợp nhiễm ở trẻ dới 6 tuổi đều
không có triệu chứng và nếu có triệu chứng lâm sàng thì thờng nhẹ và
không đặc hiệu. Các trờng hợp nhiễm ở trẻ lớn và ngời trởng thành
thờng có triệu chứng và hội chứng vàng da là biểu hiện lâm sàng chính.
Tỷ lệ tử vong tăng từ 0,2% trong trẻ 5-14 tuổi cho tới 1,8% trong nhóm