Bộ khoa học và công nghệ bộ y tế Chơng trình khoa học và công nghệ
phục vụ chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ cộng đồng

Báo cáo tóm tắt Dự án sản xuất thử nghiệm
cấp nhà nớc Hoàn thiện qui trình công nghệ
sản xuất vắcxin viêm gan B
tái tổ hợp M số KC.10-DA06

5971
10/8/2006

Các cơ quan tham gia:
- Công ty vắcxin và sinh phẩm số 1- Viện Vệ sinh
Dịch tễ Trung ơng
- Trung tâm Quốc gia Kiểm định vắcxin và các
chế phẩm sinh học
- Trung tâm y tế dự phòng - Thanh Hóa mục lục

Đặt vấn đề 1
CHƯƠNG I: Vật liệu và phơng pháp 2
1. Hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan B
tái tổ hợp. 2
2. Xây dựng tiêu chuẩn Quốc gia cho vắcxin viêm gan B tái tổ hợp
sản xuất tại Việt Nam. 3
2.1. An toàn chung 3
2.2. Kiểm tra vô khuẩn 3
2.3. Xác định hàm lợng HBsAg 3
2.4. Kiểm tra chất gây sốt 4
2.5. Kiểm tra chất hấp phụ Al(OH)
3
4
2.6. Kiểm tra hàm lợng Merthiolat 4
2.7. Kiểm tra hàm lợng Formaldehyt 4
2.8. Kiểm tra hàm lợng protein toàn phần 4
2.9. Kiểm tra công hiệu 4
2.10. Thử nghiệm nhận dạng 5
3. Phơng pháp đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch của
vắcxin viêm gan B tái tổ hợp trên thực địa lâm sàng . 5

1.2. Lịch sử virút viêm gan B 3
1.3. Cấu trúc sinh học phân tử của virút B 4
1.4. Bệnh lý học 12
1.5. Dịch tễ học virút viêm gan B 12
1.6. Chẩn đoán viêm gan B 13
1.7. Các thể lâm sàng 14
1.8. Điều trị 15
1.9. Dự phòng 16
1.10. Chiến lợc loại trừ lây truyền viêm gan virút B 17
1.11. Phòng nhiễm virút viêm gan B 18
1.12. Globulin miễn dịch phòng viêm gan B (HBIG) 18
2. Các loại vắcxin viêm gan B và những nghiên cứu về vắcxin
viêm gan B hiện nay 18
2.1. Các loại vắcxin phòng viêm gan B và xu hớng phát triển. 18
2.2. Tính an toàn của vắcxin viêm gan B 20
2.3. Tính sinh miễn dịch của vắcxin viêm gan B 21
2.4. Các yếu tố ảnh hởng đến tính sinh miễn dịch của
vắcxin phòng viêm gan B 23
3. Sử dụng công nghệ tái tổ hợp ADN để biểu thị kháng nguyên 26
3.1. Các hệ biểu thị khác nhau 26
3.2. Biểu thị ở nấm men 26
3.3. Biểu thị ở tế bào động vật 27
3.4. Hệ biểu thị ở Pichia pastoris 27
CHƯƠNG II: Vật liệu và phơng pháp 31
1. Hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan B
tái tổ hợp. 31
1.1. Chủng sản xuất 31
1.2. Môi trờng . 31
1.3. Cấy chủng 33
1.4. Nhân chủng . 33

1.2. Kết quả kiểm tra quá trình nhân lên của tế bào nấm men 46
1.3. Kết quả kiểm tra quá trình biến nạp 48
1.4. Kiểm tra vỡ tế bào 50
1.5. Kiểm tra quá trình tinh chế HBsAg 50
1.6. Pha chế vắcxin và đóng ống. 58
2. Xây dựng tiêu chuẩn Quốc gia cho vắcxin viêm gan B tái tổ hợp
sản xuất tại Việt Nam. 59
2.1. Xây dựng tiêu chuẩn về thành phần hoá học 59
2.2. Xây dựng về các chỉ số sinh học. 64
3. Kết quả đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch của vắcxin
viêm gan B tái tổ hợp RecomBvax trên thực địa lâm sàng 68
3.1. Kết quả đánh giá tính an toàn 68
3.2. Các kết quả đánh giá về khả năng đáp ứng miễn dịch
sau khi tiêm vắcxin theo phác đồ tháng 0-1-2 74
Chơng IV. Kết luận 78
Tài liệu tham khảo 81 các chữ viết tắt

aa Amino acid
(axít amin)
ADN Desoxyribonucleic acid
(axít desoxyribonucleic)
ARN Ribonucleic acid
(axít ribonucleic)
AH Aluminium hydroxide
(nhôm hydroxit)
Anti-HBc Antibody against Hepatitis B core antigen
(kháng thể kháng kháng nguyên lõi virút viêm gan B)

HBeAg Hepatitis B e antigen
(kháng nguyên e virút viêm gan B)
HBsAg Hepatitis B surface antigen
(kháng nguyên bề mặt virút viêm gan B)
HBx Hepatitis B x antigen
(kháng nguyên x virút viêm gan B)
HBIg Hepatitis B immunoglobulin
(globulin miễn dịch phòng viêm gan B)
HLKN Hàm lợng kháng nguyên
HT Huyết thanh
HT1 (n) Huyết thanh lấy lần thứ nhất (hoặc lần thứ n)
HLA kháng nguyên bạch cầu ngời
IU International unit
(đơn vị quốc tế)
IFN interferon-
IFN
interferon-
IFN

interferon-
kb kilobase
(kilôbazơ)
kD kilodalton
(kilôdalton)
KN Kháng nguyên
KT Kháng thể
LD
50
Lethal dose 50%
(liều gây chết 50%)

VABIOTECH Công ty vắcxin và sinh phẩm số 1
vđ vừa đủ
v/p vòng/phút
VSDTTƯ Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương
WSV Working seed virus
( Chủng sản xuất)

1
đặt vấn đề

Việt Nam là một trong những nớc có tỷ lệ ngời mang HBsAg cao trong
cộng đồng, theo các báo cáo của các tác giả khác nhau có thể giao động từ 11%-
26%. HBV vẫn chiếm một tỷ lệ lớn trong các căn nguyên gây viêm gan ở các
bệnh nhân bị viêm gan, trên 40% có căn nguyên gây bệnh là HBV. HBV cũng
chịu trách nhiệm tới 90% các trờng hợp ung th gan nguyên phát, trong khi ở
các nớc đã tiến hành tiêm phòng vắcxin viêm gan B cho cộng đồng từ những
năm đầu thập niên 80 thì căn nguyên chủ yếu gây ung th gan nguyên phát hiện
nay lại là virút viêm gan C, khi tỷ lệ ngời mang HBsAg đã giảm xuống dới 1%
do kết quả tiêm phòng viêm gan B. Tỷ lệ ngời mang ở phụ nữ có thai là khoảng
12%, trong đó nếu mẹ chỉ bị HBsAg dơng tính không thôi thì khả năng truyền
sang cho con trong thời kỳ chu sinh là khoảng 40%, và nếu mẹ mang cả HBsAg

2
- Xây dựng tiêu chuẩn Quốc gia cho vắcxin viêm gan B tái tổ hợp sản xuất tại
Việt Nam.
- Chuẩn bị năng lực khoa học công nghệ để tiếp thu dự án vay vốn của Hàn
Quốc với công suất 20 triệu liều/năm.

Nội dung chính của dự án là :
- Hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan B tái tổ hợp.
- Xây dựng tiêu chuẩn Quốc gia cho vắcxin viêm gan B tái tổ hợp sản xuất tại
Việt Nam.
- Đánh giá tính an toàn và khả năng đáp ứng miễn dịch của vắcxin viêm gan B
tái tổ hợp trên thực địa ở giai đoạn 3, với cỡ mẫu n=300.
- Đào tạo đội ngũ cán bộ khoa học, công nhân kỹ thuật lành nghề nắm vững
kiến thức và kỹ thuật để có thể tiếp nhận đợc công nghệ và sử dụng trang thiết
bị trong dự án vay vốn của Hàn Quốc.
3
Chơng I
Tổng quan

1. Những hiểu biết hiện nay về virút viêm gan B
1.1. Thông tin đại cơng về virút viêm gan B
Genôm : ADN sợi kép một phần.
Họ : Hepadna.
Thời kỳ ủ bệnh : 30-180 ngày.
Đờng lây truyền : Máu và dịch tiết.
Tấn công cấp tính : Nhẹ hoặc dữ dội.
Chẩn đoán huyết thanh : Anti-HBc, anti-HBs hoặc HBsAg.

4
Những nghiên cứu trên toàn cầu về chu trình nhân lên của HBV với quan tâm
hàng đầu là sự kết dính và xâm nhập của virút vào tế bào chủ. Những nghiên cứu
lâm sàng cũng đang đợc tiến hành nhằm tìm ra đợc các phơng pháp điều trị
bệnh viêm gan B cấp tính hoặc mạn tính. Các phòng thí nghiệm khác cũng đang
nghiên cứu tìm kiếm cơ chế gây ung th của HBV.

1.3. Cấu trúc sinh học phân tử của virút viêm gan B
1.3.1. Genôm của virút viêm gan B
Genôm của virút viêm gan B đợc trình bày ở hình 1. Kích thớc genôm
giao động giữa các phân týp khác nhau của HBV, song tất cả đều có độ dài
khoảng 3,2 Kb.
ở viriôn của HBV ngời ta tìm thấy genôm ở dạng sợi kép không hoàn
chỉnh. Điều này có lẽ do tính chất riêng trong chu trình sống của HBV. HBV sử
dụng Transcriptaza phiên mã ngợc để phiên mã toàn bộ độ dài ARN sợi dơng
trong genôm của nó ngợc trở lại thành ADN. Transcriptaza ngợc này cũng có
hoạt tính ADN polymeraza và nhờ đó bắt đầu một quá trình sao chép một ADN-
sợi âm mới đợc tổng hợp. Tuy nhiên protein lõi capsid hoá Transcriptaza phiên
mã ngợc/polymeraza trớc khi hoàn thành quá trình sao chép.
Khi nào và ở đâu ADN sợi kép một phần này của genôm đợc sửa chữa
thành ADN khép kín đồng hoá trị vẫn còn cha đợc biết.

1.3.2. Quá trình sao chép genôm của HBV
Sự sao chép genôm HBV xảy ra bên trong nhân một tế bào bị nhiễm. ARN
polymeraza II phiên mã ADN sợi tròn của HBV thành một sợi ARNm lớn hơn độ
dài đầy đủ. Một khi đã đợc sao chép, ARN genôm có mặt trong nhân và xâm
nhập vào bào tơng, ở đó đợc phiên dịch để tái sinh polymeraza, protein lõi và
e của HBV.
Từ trạng thái tự do, trớc hết virút phải kết dính bản thân nó vào màng một tế
bào chủ đặc hiệu. Quá trình kết dính của virút là một trong những bớc quan

chứa cả protein bề mặt virút viêm gan B trọng lợng phân tử lớn. Có thể tìm thấy
những hạt này với hiệu giá cao trong máu những ngời mang HBV.
Các hạt không gây nhiễm này có hiệu giá cao cho thấy virút phải đợc hình
thành để sử dụng chúng theo một kiểu nào đấy. Cũng có giả thiết cho rằng các
hạt không gây nhiễm có hàm lợng cao trong huyết thanh cho phép các hạt virút
gây nhiễm chạy ngang qua máu không xác định đợc bằng hệ miễn dịch. Tuy
nhiên theo mô hình mẫu virút viêm gan B ở vịt hình nh có sự tăng nhanh nhiễm
trùng khi virút đợc trộn ở tỷ lệ nào đó với các hạt không gây nhiễm. Sự bám
dính các hạt không gây nhiễm vào tế bào có thể để hoạt hóa tế bào, chuẩn bị sẵn
sàng cho virút gây nhiễm. Điều này cũng có thể đúng cho virút viêm gan B ở
ngời, song vẫn cha đợc kết luận.

1.3.5. Protein lõi virút viêm gan B (HBc)
Protein lõi virút viêm gan B (HBc) đợc cấu tạo phần lớn từ axít amin a
nớc và tích điện. Protein này không bao giờ đợc glycosyl hoá, cũng nh không
có liên kết lipit nào. Tuy nhiên trong các tế bào eukayriot có lẽ protein này đợc
phosphoryl hoá.
Protein này đợc tổng hợp trong bào tơng và có thể lắp ghép với nhau thành
hạt lõi có chứa genôm của virút. Biểu thị protein HBc ở vi khuẩn cho thấy ARN
lắp ráp theo một kiểu không đặc hiệu. Khả năng lắp ráp hạt c trú trong vòng 149
axít amin đầu. Bốn cụm Arginin trong vòng 36-38 axít amin cuối có lẽ tham gia
vào quá trình lắp ghép các axít nucleic.
Quá trình phosphoryl hoá xẩy ra hoặc ở Serin thứ 170 hoặc 172. Các axít
amin này khu trú giữa cụm Arginin 3 và 4. Vì thế quá trình phosphoryl hoá các
điểm Serin có thể ức chế quá trình gắn các axít amin.
Những nghiên cứu sử dụng hệ lai kép cùng với kỹ thuật quét peptit đã xác
định đợc các axít amin tơng tác mạnh (aa 78 và 117) có thể tạo thành một phần
bề mặt tiếp giáp dimer. Ngợc lại, các vị trí 113 và 143 có lẽ tham gia vào quá
trình multimer hoá các dimer. Đột biến ở hai vị trí này có lẽ đã tác động đến tính
ổn định của capsit.


1.3.8. Kháng nguyên bề mặt virút viêm gan B
Sơ đồ sau đây là các kiểu khác nhau của kháng nguyên bề mặt virút viêm
gan B. Trong genôm của HBV, vùng mã hoá kháng nguyên bề mặt HBV gồm ba
khung bắt đầu từ các vị trí có chung một codon kết thúc. Bởi vậy, các protein bề
mặt khác nhau của HBV đều có liên quan đến nhau bởi một vùng chung nhau
nh đã biết là vùng S.

1.3.8.1. Kháng nguyên bề mặt virút viêm gan B loại nhỏ (HBsAg hay là SHBsAg)
Protein này là loại protein nhỏ nhất trong số các protein bề mặt virút viêm
gan B và có chứa độc nhất vùng-S. Trong lịch sử nó cũng đợc gọi là kháng
nguyên Australia (kháng nguyên Au). Là kháng nguyên kỵ nớc chứa 4 vùng
xuyên màng có trật tự. HBsAg chứa một lợng lớn Cystein, tổng số là 14 và từng
Cystein có liên kết chéo với một Cystein khác. HBsAg cũng có thể đợc glycosyl
hoá ở Asp 146. Hai dạng protein này thờng nhìn thấy đợc trên gel chạy điện di 9
với hạt HBsAg tinh khiết từ huyết tơng ngời mang. Protein này là đoạn khởi
đầu lập thành tất cả các dạng hạt của HBV, vì vậy protein này đợc sản xuất với
một lợng lớn ở virút. Nó cũng chứa epitop có tính kháng nguyên cao. Phân tích
epitop này cho phép xác định đợc phân týp của ngời mang HBV.
Vi tính hoá mô hình cho thấy liên quan đến các đờng xoắn ốc 3 và 4 là
vùng xuyên màng ngăn nắp đợc gài vào màng ER sau giai đoạn phiên dịch. Hai
vòng xoắn này đợc xem nh là vị trí thực hiện quá trình multimer hoá. Điều này
đợc củng cố thêm nhờ quan sát HBsAg bị xén bớt vùng xoắn ốc này sẽ không
có khả năng tạo thành các hạt và sẽ ở lại màng ER. Tế bào bị nhiễm ở giai đoạn
sớm sản sinh ra một lợng lớn nhất protein. Hiệu giá hạt HBsAg không gây
nhiễm tìm thấy trong huyết thanh ngời mang có thể cao tới 200àg/ml. Biểu thị
HBsAg có thể cũng đợc cảm ứng nhờ một chấn động trong lòng ống lới nội

Asp 4. Có thể vị trí này luôn luôn đợc glycosyl hoá, song vị trí glycosyl hoá ở 10
vùng S có lúc ở dạng glycosyl hoá hoàn toàn, có lúc ở dạng glycosyl hoá một
phần protein này.
Một số nghiên cứu cho rằng protein MHBsAg tham gia vào quá trình kết
dính và xâm nhập của HBV vào tế bào gan. Tuy nhiên, trong một nghiên cứu
phân tích di truyền HBV ở bệnh nhân viêm gan bạo phát, codon khởi đầu tiền-S2
có mang một biến dị đúp ngăn cản biểu thị protein tơng ứng. Nh vậy, có lẽ
tiền-S2 không cần thiết cho tính gây nhiễm của HBV cũng nh hình thái của hạt
virút. Điều này có thể loại trừ HBsAg trung bình là protein kết dính của HBV,
mặc dù nó có thể chia sẻ với quá trình kết dính virút theo kiểu cơ chế thứ phát.

1.3.8.3. Kháng nguyên bề mặt virút viêm gan B loại lớn (LHBsAg)
Đây là protein lớn nhất trong số protein bề mặt của HBV có chứa vùng tiền-
S1, tiền-S2 và S. Trình tự vùng tiền-S1 có thể giao động rất lớn trong số bệnh
nhân bị nhiễm cho thấy rằng có thể đây là protein của HBV tham gia vào quá
trình kết dính vào tế bào gan. Vùng tiền-S1 không có vị trí glycosyl hoá bổ sung,
song có chứa tín hiệu myrin hoá ở đầu cuối -N, buộc đầu cuối -N vào màng tế
bào.
Có giả thiết về hai kiểu sắp xếp của protein này : Một kiểu tìm thấy trên bề
mặt tế bào và trong viriôn trởng thành, kiểu khác tìm thấy trên bề mặt của hệ
thống lới nội bào (ER). Các kiểu sắp xếp đợc ghi chép dựa trên những nghiên
cứu proteaza và kháng thể. ở virút viêm gan B của vịt, LHBsAg có kiểu họa đồ
lỡng cực. Có lẽ cả hai vùng tiền-S1 và tiền-S2 ở lại trong nội bào khi LHBsAg ở
trong ER. Vì vậy, vùng tiền-S2 không đợc glycosyl hoá trong khi vùng tiền-S1
đợc myrin hoá. Khi nào, ở đâu và nh thế nào vùng tiền-S đợc di chuyển qua
màng tế bào vẫn còn là một vấn đề cần tranh luận. Tuy vậy, một mô hình giả
thiết cho virút viêm gan B ở vịt cũng đã đợc thiết lập. Mô hình này cho biết

ADN-sợi âm của virút. Protein này là thiết yếu để khởi đầu cho quá
trình tổng hợp sợi âm, vì vậy cũng đợc gọi là primaza.
Vùng tiếp theo có lẽ có chức năng không đặc hiệu trừ khi đó có thể là
một khoảng trống.
Vùng này mã hoá ARN-polymeraza hoặc ARN-polymeraza phụ thuộc
ADN
Vùng cuối cùng có hoạt tính H-ARN-aza hoá giáng ARN nếu nó có
mặt trong một thể lai ghép ARN và ADN.
Có thể hoạt tính của protein polymeraza phụ thuộc vào ion kim loại và phần
có cấu trúc hình cong kiểu elíp. Yêu cầu phải có tín hiệu elíp này để hoạt hoá
polymeraza cũng đã đợc chứng minh ở hệ virút viêm gan B của vịt. Ion
Magnesium có lẽ là cần thiết cho quá trình sao chép ngợc.

1.3.11. Protein X của virút viêm gan B
Protein X của HBV đợc gọi nh vậy vì chức năng đầy đủ của nó vẫn còn là
một điều bí mật. Protêin X có 154 axít amin đợc mã hoá bởi ORF-X. Trình tự
của nó không thay đổi ở cả hai loại virút viêm gan của sóc và chuột chũi, song
virút viêm gan ở vịt không có HBx. Điều này ngụ ý rằng protein HBx không
tham gia trực tiếp vào quá trình sao chép genôm và lắp ráp virion.
Trên quan điểm triết lý di truyền học cho thấy gen HBx là một sự bổ sung
tức thời từ genôm của tế bào eukariot vào genôm của HBV mà ngợc lại là hoàn
toàn không thay đổi. Không có một chứng cớ nào chứng tỏ protein HBx là thành
phần của virion trởng thành hoặc hạt lõi. Phân tích aa cho thấy protein HBx có
nguồn gốc bào tơng. Những nghiên cứu về protein HBx cho biết rất khó biểu
thị protein này in vitro và rất không ổn định với thời gian bán hủy hoại rất ngắn -
20 phút. Tuy nhiên, nó có thể phosphoryl hoá.
Sợi trên của gen này có một vùng đã biết là vùng tăng cờng I của HBV, có
chứa một số trình tự hoạt hoá phần Cis- cho việc biểu thị gen của HBV có hiệu
quả. Có thể một tỷ lệ vùng tăng cờng này là trung gian cho quá trình phiên mã
gen X của HBV. Protein này có nhiều hoạt tính d thừa từ Dinucleotit-kinaza đến

Điều này cũng đúng cho hàng loạt những thay đổi huyết học thỉnh thoảng thấy ở
bệnh nhân viêm gan cấp tính.
Các sản phẩm trung gian và/hoặc phiên bản của virút trong quá trình nhân
lên của HBV cũng tìm đợc ở các vị trí ngoài gan.

1.5. Dịch tễ học virút viêm gan B
Viêm gan B đợc lan truyền trong cộng đồng ngời trên toàn thế giới. Mặc
dù có nhiều báo cáo cho thấy rằng HBsAg có cả ở những động vật bậc cao khác
nữa, song ngời vẫn là ổ chứa chủ yếu. ở những nớc phát triển hơn, tỷ lệ nhiễm
HBV đã giảm đi, có lẽ do thay đổi cách sống của nhóm có nguy cơ cao, vắcxin
viêm gan B đã sẵn có cùng với việc sàng lọc những ngời cho máu.
Nguồn HBV đầu tiên là máu. Tuy nhiên, ng
ời ta cũng đã tìm thấy virút
trong hàng loạt dịch tiết cơ thể nh nớc bọt, nớc mũi, tinh dịch và máu hành
kinh. Ngời ta không tìm thấy virút trong phân, có lẽ do virút đã bị bất hoạt bởi
các enzym có trong niêm mạc ruột hoặc khuẩn trí đờng ruột. Có thể giả thiết
một cách chắc chắn rằng virút có mặt trong tất cả các dịch tiết của một bệnh
nhân bị nhiễm. Máu bị nhiễm của một ngời mang HBeAg dơng tính có hiệu
class="bi x1a y130 w2 h16" 14
1.7. Các thể lâm sàng
1.7.1. Viêm gan cấp tính
Tiến triển lâm sàng của HBV cũng tơng tự nh viêm gan A (HAV), song sẽ
trầm trọng hơn và có thể có liên quan với các triệu chứng nh kiểu bị bệnh huyết
thanh. Những kiểu tấn công nhẹ nhất không có biểu hiện lâm sàng và chỉ có thể
xác định đợc bằng mức tăng transaminaza trong huyết thanh. Nói cách khác
bệnh nhân có thể không vàng da nhng sẽ bị mắc các triệu chứng kiểu bệnh cúm
và viêm ruột- dạ dày. Những bệnh nhân này thờng không chẩn đoán đợc trừ

có hiện tợng viêm và xơ hoá, đôi khi có thay đổi thành phần mỡ trong tế bào
gan. Những điểm này cũng không khác so với bệnh nhân đã bình phục và cả
bệnh nhân hết triệu chứng. Không đợc tiến hành làm sinh thiết gan trong vòng 6