T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam

1
NGHIÊN CỨU TÁI SINH GIỐNG LÚA DT22
VÀ KHANG DÂN ĐỘT BIẾN (KDĐB)
PHỤC VỤ CHO KỸ THUẬT CHUYỂN GEN
Phí Công guyên, guyễn Thuý Điệp,

Kiều Thị Dung, Trần Minh Hoa,
Trần Duy Dương, Đặng Trọng Lương
SUMMARY
Study on the plant regeneration of DT22 and mutant Khang dan (KDĐB) rice
cultivars
from matured embryo calli for rice transformation
Two rice cultivars DT22 and KDĐB were used to induce calli and plant regeneration
from matured embryo calli. Callus induction, callus proliferation and regeneration ratio
were evaluated on MS (Murashige Skoog, 1962) and 6 (Chu et al, 1978) media
supplemented with different concentrations of phytohormon. 6D supplemented with 2
mg/l 2,4D was the most effective on callus induction and callus proliferation of both DT22
and KDĐB cultivars. DT22 cultivar was highest regenerated on MS medium supplemented
with 2 mg/l BAP (BL2 medium). Regeneration ratio equal to 74.1% and regenerated shoot
were healthy and uniform. Healthy and uniform shoot were induced as 72.6% of
regeneration ratio on MS medium supplemented with 2 mg/l BAP and 0.1 mg/l AA (A4
medium).
Keywords: Rice, Callus, Plant regeneration.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Đã có rất nhiều loại mô khác nhau được
dùng trong nghiên cứu tái sinh ở lúa
(Bhaskaran và Smith, 1988). Tuy nhiên, các
mô phôi thường được ứng dụng nhiều trong
nuôi cấy in vitro nhờ có khả năng tái sinh

Giống lúa DT22 và giống lúa Khang
dân đột biến (KDĐB) có nguồn gốc và xuất
xứ từ Viện Di truyền Nông nghiệp.
Nuôi cấy mô tái sinh sử dụng môi
trường cơ bản MS (Murashige Skoog,
1962) và môi trường N6 (Chu và cs., 1978)
bổ sung các chất điều hoà sinh trưởng ở
nồng độ khác nhau.
2. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nuôi cấy mô tạo callus và
tái sinh cây sử dụng phôi trưởng thành được
kết hợp từ phương pháp của IRRI và phòng
thí nghiệm Chọn giống cây trồng, Đại học
Kyushu, Nhật Bản.
2.1. Khử trùng mẫu
Sử dụng 2 hóa chất khử trùng hạt khác
nhau là HgCl
2
1‰ trong 10 phút và NaClO
10% trong 2 lần x 20 phút.
2.2. Phát sinh và nhân callus
- Môi trường N6D: N6 + 2 mg/l 2,4D +
3000 mg/l proline + 300 mg/l Casein + 3%
đường + 0,3% phytagel).
- Sau 10 ngày các callus được tách ra
và chuyển vào các môi trường sau:
+ LD: Môi trường MS (Murashige and
Skoog, 1962) bổ sung 3% đường, 0,3%
phytagel, 100 ml/l nước dừa và các loại
vitamin, casein,

(mg/ml)
Tryptophan
(mg/ml)
Proline
(mg/ml)
Glutamin
(mg/ml)
Asparagin
(mg/ml)
Nước dừa
(ml/l)
N6D 2 300 0 3000 0 0 0
N6D1 1,5 0 0 0 100 100 100
N6D2 2,5 0 0 0 0 0 100
N6D3 3,0 0 100 0 0 0 0
N6D4 3,5 300 0 3000 0 0 0

2.3. Tái sinh chồi và tạo cây hoàn chỉnh
Callus lúa được nuôi cấy trên môi
trường nhân callus sau 4 tuần được cấy
chuyển sang môi trường tái sinh và tạo chồi.

Công thức
thí nghiệm
BAP
(mg/ml)
Kinetin
(mg/ml)
NAA
(mg/ml)

2
cho tỷ lệ nhiễm thấp hơn so với
phương pháp khử trùng bằng NaClO (2,0 ±
0,5% ở KDĐB so với 9,0 ± 1,5%; 2,5 ±
0,5% ở DT22 so với 7,0 ± 5,0%) nhưng tỷ
lệ tạo callus ở phương pháp này lại thấp
hơn so với khi khử trùng bằng NaClO (65,0
± 2,0% so với 77,0 ± 0,5% ở KDĐB; 74,0 ±
2,0% so với 86,0 ± 1,5% ở DT22. Sử dụng
HgCl
2
để khử trùng mẫu cho tỷ lệ nhiễm
thấp thích hợp khi thiết lập mẫu in vitro với
số lượng mẫu nhỏ. Tuy nhiên, khi sử dụng
số lượng mẫu lớn, chúng tôi khuyến cáo
nên sử dụng NaClO với mục đích thân thiện
hơn với môi trường.
Bảng 1. Kết quả vào mẫu in vitro
Hóa chất
khử trùng

KDĐB DT22
Số lượng mẫu Tỷ lệ nhiễm

Tỷ lệ tạo
callus
Số lượng mẫu

Tỷ lệ nhiễm
Tỷ lệ tạo

4
DT22 + ++ ++ +++ ++ ++ + ++
KDĐB + ++ ++ ++ ++ ++ + ++
Bảng 3. Cho điểm và đánh giá khả năng nhân callus trên nền môi trường 6
Môi trường

Giống
N6D N6D1 N6D2 N6D3 N6D4
DT22 ++++ ++ +++ ++ ++
KDĐB +++ ++ +++ ++ ++
Trong các nồng độ 2,4D được sử dụng
ở cả 2 công thức môi trường, thì nồng độ 2
mg/l 2,4D cho khả năng tạo callus cao nhất
ở cả 2 giống DT22 và KDĐB. Nồng độ này
đã được sử dụng nhiều trong các thí nghiệm
tạo callus. Điều đó gợi ý rằng, các giống lúa
có khả năng tạo callus cao nhất khi nồng độ
2,4D ngoại sinh được bổ sung trong môi
trường nuôi cấy là 2 mg/l. Do vậy, nồng độ
2 mg/l 2,4D có bổ sung các hợp chất như
casein (300 mg/l) và proline (3000 mg/l) có
thể áp dụng để tạo và nhân callus cho các
thí nghiệm tạo callus phục vụ kỹ thuật tái
sinh và chuyển gen.

Ảnh 1. Mẫu lúa DT22 và KDĐB trên môi trường phát sinh và nhân callus
Trong một số tài liệu, môi trường MS

Ở nồng độ BAP 2 mg/l khả năng tạo
chồi và chất lượng các chồi được tạo thành
tốt nhất. Ở môi trường BL2 (2 mg/l BAP),
giống DT22 phản ứng tốt hơn so với giống
KDĐB với hình thái cụm chồi xanh, khoẻ và
đồng nhất. Tỷ lệ tạo chồi trung bình là
74,1% đối với giống DT22 và 66,1% đối với
giống KDĐB. Đây cũng là môi trường cho
tỷ lệ tạo chồi cao nhất so với các môi trường
còn lại được sử dụng để tái sinh giống
DT22. Với các tổ hợp môi trường có bổ
sung thành phần kinetin thì ở nồng độ 2 mg/l
kinetin khả năng tạo chồi và tỷ lệ tạo chồi
cũng cao nhất trong cả 2 giống được nghiên
cứu. Tuy nhiên, xét trên cả 2 tiêu chuNn là tỷ
lệ tạo chồi và chất lượng chồi được tạo thành
đều không cao bằng sử dụng môi trường với
nồng độ 2 mg/lBAP. Tỷ lệ tạo chồi chỉ đạt
cao nhất là 58,4% đối với giống DT22 ở môi
trường K3 (2 mg/l kinetin) (bảng 4). Trong
khi đó, cũng với môi trường này, tỷ lệ tạo
chồi của giống KDĐB chỉ đạt được là
53,7%. Chất lượng chồi tạo thành cũng
không cao khi chồi thường bị xoăn, yếu và
có tạo rễ. Vì vậy, trong tái sinh cây của 2
giống DT22 và KDĐB sử dụng môi trường
tái sinh với chất kích thích sinh trưởng là
BAP sẽ cho hiệu quả cao hơn môi trường có
sử dụng kinetin. Sự khác biệt là đối với môi
trường tái sinh A4 có bổ sung BAP 2 mg/l,

KDĐB
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam

6
khoẻ trung bình
BL3 71,4 ± 3,3 Cụm chồi xanh, đồng nhất,
khoẻ
65,8 ± 2,3 Chồi xanh, thẳng, sức sống
trung bình
BL4 69,9 ± 2,1 Chồi xanh, nhỏ, yếu 63,7 ± 1,9 Cụm chồi xanh, kích thước vừa,
yếu
BL5 66,4 ± 1,5 Chồi xanh, xoăn, yếu 61,8 ± 2,7 Chồi xanh, kích thước vừa, yếu
BL6 64,2 ± 3,0 Chồi xanh, xoăn, yếu 60,3 ± 2,9 Chồi xanh, kích thước vừa, yếu
K1 49,7 ± 3,0 Chồi xanh, ngắn, yếu 52,7 ± 2,3 Chồi xanh, xoăn, yếu
K2 51,0 ± 2,2 Chồi xanh, ngắn, yếu 54,6 ± 1,2 Chồi xanh, ngắn, yếu
K3 53,7 ± 1,4 Chồi xanh, dài, khoẻ 58,4 ± 1,6 Chồi xanh, dài, khoẻ
K4 50,8 ± 2,2 Chồi xanh, ngắn, có rễ 54,1 ± 2,3 Chồi xanh, mảnh, yếu
K5 49,1 ± 1,6 Chồi xanh, mảnh, xoắn, có rễ

52,2 ± 3,1 Chồi xanh, mảnh yếu, có rễ

IV. KẾT LUẬN
1. Hiệu quả khử trùng tốt nhất đối với
giống DT22 và KDĐB là sử dụng
NaClO 10% trong thời gian 20 phút;
2. Môi trường tạo callus thích hợp cho 2
giống DT22 và KDĐB là: N6 + 2 mg/l
2,4D + 3000 mg/l proline + 300 mg/l
casein + 3% đường + 0,3% phytagel
3. Môi trường tái sinh giống DT22: Môi

5 Kyozuka J, Otoo E, et al., 1988. Plant
regeneration from protoplast of
Indica rice: genotype differences in
culture response. Theor. Appl. Genet.
76:887-890.
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam

7
6 Toki S., 1997. Rapid and efficient
Agrobacterium-mediated transformation
of rice. Pl. Mol. Biol. Rep. 15: 16-21.
gười phản biện: GS.TSKH. Trần Duy Quý
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
8