ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

LÊ THỊ HỒNG NHUNG

Tên đề tài

NGHIÊN CỨU TÁI SINH GIỐNG SA NHÂN TÍM
(Amomum longilgulare T.L.Wu) BẰNG PHƯƠNG PHÁP
NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo
Chuyên ngành
Khoa

: Chính quy
: Công nghệ sinh học
: CNSH - CNTP

Khoá học

: 2010 - 2014

Thái Nguyên, năm 2014


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM




LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian thực hiện đề tài em đã được sự tạo điều kiện, quan
tâm giúp đỡ của các thầy cô giáo, bạn bè và gia đình, trong thời gian qua
em đã hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình tại phòng thí nghiệm
nuôi cấy mô của Bộ môn Công nghệ Tế bào, Viện Khoa học Sự sống, Đại
học Nông lâm Thái Nguyên.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến PGS.TS Ngô Xuân Bình, trưởng khoa
Công nghệ sinh học - Công nghệ Thực Phẩm, cùng toàn thể các thầy cô trong
khoa Công nghệ Sinh học - Công nghệ thực phẩm đã giảng dạy và chỉ bảo
cho em rất nhiều trong quá trình học tập và thực hiện đề tài này.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Th.S Nguyễn Thị Tình, giảng viên
khoa CNSH - CNTP, người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, chỉ ra những sai
lầm giúp em hoàn thành tốt khóa luận.
Em xin gửi lời cảm ơn đến ThS. Đào Duy Hưng cùng các thầy cô,
anh chị tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô của Bộ môn Công nghệ Tế bào,
Viện Khoa học Sự sống, Đại học Nông lâm Thái Nguyên đã tận tình giúp
đỡ và hướng dẫn giúp em hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp đại học này.
Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã hết lòng động
viên, giúp đỡ tạo điều kiện về vật chất và tinh thần cho em trong quá trình học
tập và nghiên cứu.
Do trình độ và điều kiện thời gian thực hiện đề tài có hạn nên đề tài
không tránh khỏi những sai sót. Em rất mong nhận được sự góp ý của các
thầy cô và các bạn để đề tài hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Thái nguyên, ngày 30 tháng 5 năm 2014
Sinh viên thực hiện

Lê Thị Hồng Nhung

: Least Significant Difference Test

MS

: Murashige and Skoog’s

NAA

: α - Naphlene axetic acid

TN

: Thí nghiệm

2,4-D

: 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid


MỤC LỤC

PHẦN 1: MỞ ĐẦU........................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề.................................................................................................... 1
1.2. Mục đích nghiên cứu ................................................................................... 2
1.3. Yêu cầu ........................................................................................................ 2
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .................................................... 2
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................ 3
2.1. Giới thiệu về cây Sa Nhân Tím ................................................................... 3
2.1.1. Nguồn gốc và phân loại............................................................................ 3
2.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây Sa Nhân Tím .......................................... 3

HgCl2 (0,1%) đến khả năng vô trùng mẫu mẫu Sa Nhân Tím (Amomum
longilgulare T.L.Wu) ....................................................................................... 28
4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến
khả năng tái sinh của chồi Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) .... 31
4.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tái sinh chồi
Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) ............................................... 31
4.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi Sa
Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) .................................................... 33
4.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IAA đến hiệu quả
tái sinh chồi Sa Nhân tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) ............................ 35
4.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IBA đến hiệu quả
tái sinh chồi Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) ............................ 37
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................... 39
5.1. Kết luận ..................................................................................................... 39
5.2. Kiến nghị ................................................................................................... 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 40


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung
dịch H2O2 (5%) đến khả năng vô trùng mẫu Sa Nhân Tím (Amomum
longilgulare T.L.Wu) ( sau 20 ngày nuôi cấy) ............................................... 26
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl2 (0,1%)
đến khả năng vô trùng mẫu Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu)
(sau 20 ngày nuôi cấy) ................................................................................... 28
Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tái sinh
chồi Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) (sau 45 ngày nuôi cấy) . 31
Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi
Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) (sau 45 ngày nuôi cấy) ........ 33
Bảng 4.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IAA đến hiệu

MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Sa Nhân Tím (Amomum longiligulare T.L.Wu), thuộc chi Sa Nhân
(Amomum), họ gừng (Zingiberaceae) [11]. Sa Nhân Tím là cây thuốc quý, có
trong danh mục thực vật rừng quý hiếm ban hành kèm theo nghị định số 18 HĐBT ngày 17/01/1992 [8].
Trong y học cổ truyền, quả Sa Nhân được sử dụng làm thuốc, nhằm kích
thích tiêu hóa, chữa ăn uống không tiêu, bị nôn mửa, đau dạ dày, đau bụng, kiết lỵ,
sảy thai, bệnh cao huyết áp, cao cholesterol máu [11], [15]. Quả Sa Nhân tím chứa
tinh dầu có tác dụng kháng khuẩn và nấm [17], [23], [28]. Sa Nhân Tím còn
được dùng làm gia vị, hương liệu sản xuất xà phòng thơm...Chính vì thế, đây
không chỉ là cây dược liệu quý mà còn được dùng nhiều trong nước và được
xuất khẩu ra nhiều nước trên thế giới.
Rừng tự nhiên đang bị tàn phá nghiêm trọng. Cây dược liệu bị khai thác
tự do nên diện tích và sản lượng ngày càng suy giảm. Cây Sa Nhân đang bị
khai thác tự do nên ngày càng bị thu hẹp về diện tích, giống Sa Nhân Tím
cũng bị mất dần và thoái hóa. Nếu không kịp thời trồng mới và tác động
những biện pháp tích cực thì những nguồn gen cây trồng có giá trị cao cũng
dần bị mất. Trong khi đó nhu cầu sử dụng thuốc đông dược để chăm sóc và
bảo vệ sức khỏe ngày càng cao. Vấn đề phát triển cây dược liệu, khắc phục
những khó khăn trên cần được giải quyết.
Nhân giống Sa Nhân bằng phương pháp nuôi cấy mô sẽ tạo ra được
một sản lượng lớn cây giống sạch bệnh phục vụ cho sản xuất, khắc phục được
những khó khăn trong việc bảo tồn nguồn gen, cung cấp cây giống, giúp cho
người dân chủ động được mùa vụ không phải mất diện tích trồng cũng như
chi phí lưu trữ giống.
Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Nghiên cứu tái sinh giống Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu)
bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào’’.



2.1.1. Nguồn gốc và phân loại
Sa Nhân Tím phân bố chủ yếu ở vùng có khí hậu nhiệt đới, đặc biệt là
khu vực nhiệt đới Đông Nam và Nam Á. Sa Nhân Tím có vùng phân bố từ
đảo Hải Nam Trung Quốc đến vùng Trung Lào và Việt Nam. Ở Việt Nam Sa
Nhân Tím tập trung nhiều nhất ở các tỉnh Tây Nguyên, Quảng Ngãi, Phú Thọ,
Hòa Bình, Lào Cai…với khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm, hai mùa mưa và
khô khá rõ rệt thì Sa Nhân Tím sinh trưởng phát triển tốt và ra hoa kết quả nhiều.
Sa Nhân Tím có tên khoa học là Amomum longiligulare T.L.Wu thuộc:
Giới (regnum)

: Plantae

Ngành (Phylum)

: Tracheophyta

Lớp (Class)

: Liliospida

Bộ (ordo)

: Zingerberales

Họ (Family)

: Zingiberaceae

Chi (genus)


2.1.2.2. Đặc điểm sinh thái của cây Sa Nhân Tím
Sa Nhân Tím là cây nhiệt đới, là cây chịu bóng, thích râm mát, sống
dưới ánh sáng tán xạ, độ ánh sáng tốt nhất là 50%, nếu quá râm thì cây Sa
Nhân Tím mọc rậm rạp, ít ra hoa kết quả, thậm chí không ra hoa kết quả. Sa
Nhân Tím mọc hoang dại trong rừng, vì độ khép tán của rừng quá lớn nên
cây ít ra hoa kết quả. Còn cây mọc ở rìa rừng, ánh sáng chiếu xuống tương
đối nhiều, cây tuy thấp nhưng đậu quả rất nhiều. Dưới ánh sáng trực xạ, cây
sinh trưởng kém, lá bị vàng úa.
Sa Nhân Tím sinh trưởng phát triển gần như quanh năm nhưng mạnh
nhất vào mùa mưa ẩm. Sa Nhân Tím ra hoa quả đều hàng năm. Tái sinh tự
nhiên chủ yếu bằng hạt và bằng cách mọc chồi từ thân rễ. Sa Nhân Tím là
cây có biên độ sinh thái rộng, dễ trồng và có thể trồng được ở nhiều vùng
sinh thái khác nhau, từ vùng núi thấp đến trung du và cả đồng bằng [15].
Sa Nhân Tím mọc ở các vùng miền khác nhau thì thích hợp với từng
loại đất khác nhau. Ở các tỉnh phía nam nhìn chung là ở trên loại đất nâu đỏ
phát triển trên bazan có mùn tích tụ ở chân núi (Sơn Hòa – Phú Yên, K’
Bang – Gia Lai...). Đặc điểm chung của loại đất này là có tầng đất mặt sâu,
tỷ lệ hạt sét cao, tơi xốp, dễ thấm nước. Hàm lượng mùn và lân tổng số khá
cao, nhưng kali lại thấp.


5

Sa Nhân Tím trồng ở Chân Mộng – Đoan Hùng – Phú Thọ, Tân Lạc –
Hòa Bình, Đại Từ - Thái Nguyên và nhiều nơi khác có loại đất thuộc nhóm
feralit vàng – đỏ hay đỏ vàng. Nhưng loại đất này thường nghèo về chất dinh
dưỡng, hàm lượng mùn, kali, lân tổng số thấp hơn so với đất nâu – đỏ hay đỏ
- nâu trên bazan.
Ngoài ra, Sa Nhân Tím đem trồng thí nghiệm trên đất phù sa sông
Hồng vẫn sinh trưởng và phát triển bình thường và ra hoa kết quả nhiều.

ý cung cấp thêm các chất hữu cơ, chất khoáng trong đó không thể thiếu phân
lân [15].
2.1.3. Công dụng Sa Nhân Tím
2.1.3.1. Bộ phận dùng và tiêu chuẩn chất lượng
Sa Nhân là loại dược liệu có giá trị sử dụng rất cao, các bộ phận của
cây điều được sử dụng cho những mục đích nhất định.
Một số bài thuốc sử dụng từ Sa Nhân:
+ Thai nghén hay nôn: Sa Nhân 4g, rễ gai 8g, ích mẫu 6g, hương phụ
4g, mầm cây mía 10g. Tất cả rửa sạch thái nhỏ, phơi khô, sắc với 400ml nước
còn 100ml, uống làm hai lần. 5 ngày một liệu trình, tái khám lại.
+ Hỗ trợ viêm loét dạ dày mạn tính: Sa Nhân 6g; dạ dày lợn 1 cái, dạ
dày rửa sạch, thái chỉ, cùng với Sa Nhân nấu thành món canh; ăn dạ dày và
uống nước canh. Dùng 10 ngày một liệu trình.
Ngoài ra, hạt Sa Nhân còn được dùng làm gia vị. Tinh dầu Sa Nhân
dùng trong kỹ nghệ mỹ phẩm [3], [6], [7].
- Bộ phận dùng:
Là quả già đã phơi hay sấy khô, bóc ra lấy nguyên khối hạt. Hạt rời ra
cũng được sử dụng
- Tiêu chuẩn chất lượng:
Theo dược điển Việt Nam III (2002) [9], hạt khô còn nguyên cả khối,
hình trứng, màu nâu đen. Hàm lượng tinh dầu trong hạt đạt tỷ lệ trên 1,5%.


7

- Thành phần hóa học
Trong Sa Nhân có 2-3 % tinh dầu. Thành phần chủ yếu của tinh dầu là
d.bocneola (19%), dcampho (33%), axetat bocnyla (26,5%), dlimonen(7%),
camphen (7%), phelandren (2,3%), parametoxyetylinamat (1%), pinen (1,8%),
linalola, nerolidola… Năm 1958, hệ dược viện y học Bắc Kinh có nghiên cứu thấy

vitro cây Sa Nhân như Đỗ Năng Vịnh và cs (2006) đã nghiên cứu áp dụng
công nghệ phôi vô tính, hạt nhân tạo trong nhân nhanh Sa Nhân. Kết quả trên
vẫn còn hạn chế [19].
Đặng Ngọc phúc và cs (2011) đã nghiên cứu nhân giống in vitro cây Sa
Nhân Tím thu được thời gian khử trùng 12 phút cho tỷ lệ mẫu sống cao nhất,
đạt 91,11% đối với đỉnh sinh trưởng. Mẫu được nuôi cấy trên môi trường MS
bổ sung riêng lẻ chất kích thích sinh trưởng BAP, Kinetin. Sau 8 tuần nuôi
cấy, khả năng tái sinh chồi tốt nhất đạt được trên môi trường bổ sung BAP 1,0
mg/l (1,36 chồi/đỉnh sinh trưởng; 1,40 chồi/ đỉnh sinh trưởng bổ đôi; 1,04
chồi/ đoạn thân). Kế tiếp Đoạn thân in vitro được cấy lên môi trường nhân
nhanh bổ xung riêng lẻ hay kết hợp các chất kích thích sinh trưởng BAP,
Kinetin và NAA. Chồi in vitro được cảm ứng rễ trên môi trường MS bổ sung
NAA hay IBA. Rễ được cảm ứng tốt nhất trên môi trường MS có bổ sung 0,5
mg/l NAA (18,42 rễ/chồi). Cây con in vitro được huấn luyện thích nghi và
trồng ở vườn ươm với tỷ lệ sống sót 93,14% [12].
2.2. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.2.1. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nhân giống vô tính là hình thức nhân giống thông qua các cơ quan dinh
dưỡng (thân, lá, vỏ, củ…) bao gồm các phương pháp giâm cành, chiết cành,
mắt ghép và nuôi cấy mô in vitro. Nhân giống vô tính in vitro được tiến hành
trên nguyên tắc cắt nuôi đoạn thân có mang chồi ở nách lá, đoạn rễ hay mảnh
củ, cánh hoa, có kích thước nhỏ phù hợp với điều kiện vô trùng của ống
nghiệm [1].
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là thuật ngữ dùng để chỉ quá trình nuôi cấy
in vitro các nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi
trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng. Kỹ thuật nuôi cấy mô
dùng cho cả hai mục đích nhân giống và cải thiện di truyền, sản xuất sinh


9



10

phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu
cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau [5].
Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô
chuyên hóa, đảm bảo các chức năng khác nhau. Quá trình phân hóa tế bào có thể
biểu thị như sau:
Tế bào phôi sinh → Tế bào dãn → Tế bào phân hoá
Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên
biệt, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Trong trường hợp
cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và
phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự
phân hóa tế bào.
Phân hóa tế bào

Tế bào phôi sinh

tế bào dãn

tế bào chuyên hóa

Phản phân hóa tế bào
Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt
hóa, ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá
thể, có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính
trạng mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra
theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử ADN của
mỗi tế bào khiến cho quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn

Theo Ammirato (1986): Cường độ ánh sáng cao kích thích sự sinh
trưởng của mô sẹo. Ngược lại, cường độ ánh sáng thấp kích thích sự tạo chồi.
Nhìn chung cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là 1000-7000 lux,
ngoài ra chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát sinh hình thái của mô
thực vật in vitro: Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh
sáng trắng. Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế vươn cao nhưng
lại có ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo. Hiện nay trong các phòng thí


12

nghiệm nuôi cấy mô để cung cấp nguồn ánh sáng có cường độ 2000-2500 lux
người ta sử dụng các đèn huỳnh quang đặt cách bình nuôi cấy từ 35 – 40 cm.
- Nhiệt độ
Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh
hưởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hoá trong cây. Tuỳ thuộc
vào xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp. Nhìn
chung nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng tốt ở nhiều loài cây là
25±20C.
2.2.5.2. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật
Môi trường dinh dưỡng phải có đầy đủ các chất dinh dưỡng, các chất cần
thiết cho sự phân chia, phân hoá tế bào cũng như sự sinh trưởng bình thường
của cây.
Thành phần hoá học của môi trường đóng vai trò quyết định đến sự
thành công hay thất bại của nuôi cấy tế bào và mô thực vật. Mỗi một loại vật
liệu khác nhau có những đòi hỏi khác nhau về thành phần môi trường, khi bắt
đầu nghiên cứu một số loài mới hoặc giống mới cần phải chọn lựa cho đối
tượng nghiên cứu một loại môi trường cơ bản phù hợp.
Từ những năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra môi trường nuôi cấy
thực vật, cho đến nay đã có rất nhiều loại môi trường khác nhau được sử dụng

saccarose, một số trường hợp sử dụng glucose và fructose thay thế cho saccarose
nhưng chúng thường nghèo hydrat cacbon so với nhu cầu của thực vật.
Ngoài ra, khi khử trùng môi trường, cần chú ý không nên kéo dài thời
gian để tránh xảy ra hiện tượng caramen hoá, làm cho môi trường chuyển
sang màu vàng dẫn đến ức chế sự sinh trưởng và phát triển của tế bào [4].
Các vitamin và axit amin
Ảnh hưởng của các vitamin đến sự phát triển của tế bào nuôi cấy
invitro ở các loài khác nhau là khác nhau.
Hầu hết tế bào nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại
vitamin cơ bản nhưng với số lượng dưới mức yêu cầu. Để mô có thể sinh
trưởng, tốt nhất phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại
vitamin và amino acid. Trong các loại vitamin, B1 được xem là vitamin


14

quan trọng nhất cho sự phát triển của thực vật. Axit nicotinic (B3) và
pyridoxin (B6) cũng có thể được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm
tăng cường sức sống cho mô.
Các chất bổ sung
- Nước dừa
Công bố đầu tiên về sử dụng nước dừa trong nuôi cấy mô thuộc về Van
Overbeek và cộng sự (Van Overbeek cs,1941) [34]. Sau đó tác dụng tích cực
của nước dừa trong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được nhiều tác
giả ghi nhận. Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất
khoáng và chất kích thích sinh trưởng [2]. Nước dừa đã được sử dụng để kích
thích phân hoá và nhân nhanh chồi ở nhiều loại cây. Nước dừa thường được
lấy từ quả dừa để sử dụng tươi hoặc sau bảo quản. Thông thường nước dừa
thường được xử lý để loại trừ các protein, sau đó được lọc qua màng lọc để
khử trùng trước khi bảo quản lạnh. Protein trong nước dừa không gây ảnh

Auxin có tác dụng sinh lý rất nhiều mặt lên các quá trình sinh trưởng của
tế bào, hoạt động của tầng phát sinh, sự hình thành rễ, hiện tượng ưu thế ngọn.
Chất auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là Indol axetic acid
(IAA). IAA có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào và điều khiển sự
hình thành rễ. Ngoài IAA, còn có các dẫn xuất của nó là napthyl axetic acid
(NAA) và 2,4-dichlorophenoxy acetic acid (2,4 D). Các chất này cũng đóng
vai trò quan trọng trong sự phân chia của mô và trong quá trình hình thành rễ.
NAA được Went và Thimann (1937) phát hiện, chất này có tác dụng tăng hô
hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính enzym và ảnh hưởng mạnh đến
trao đổi chất của nitơ [14], tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng đường trong
môi trường. NAA là auxin nhân tạo, có hoạt tính mạnh hơn auxin tự nhiên
IAA, NAA có vai trò quan trọng đối với phân chia tế bào và tạo rễ. Kết quả
nghiên cứu của Butenko (1964) cho thấy NAA tác động ở mức độ phân tử
trong tế bào theo ba cơ chế đó là cơ chế thứ nhất: NAA gắn với phân tử
enzym và kích thích enzym hoạt động. Sarkissian đã phát hiện tác dụng của
auxin kích thích hoạt tính của ATPase, cơ chế thứ hai: Auxin tác động vào
gen và các enzym phân giải acid nucleic, cơ chế thứ ba: Auxin tác động
thông qua sự thay đổi tính thẩm thấu của màng. Dùng phương pháp đánh
dấu phân tử có thể thấy NAA dính kết vào màng tế bào làm cho màng hoạt
động như một bơm proton và bơm ra ngoài ion H+ làm màng tế bào mềm và


16

kéo dài ra, do đó tế bào lớn lên và sinh trưởng. Trong tế bào, NAA có tác
dụng lên sự tổng hợp acid nucleic. Còn 2,4D được sử dụng có hiệu quả với
mục đích tạo mô sẹo ở thục vật và không dùng trong môi trường tái sinh cơ
quan [20], [24].
- Cytokinin
Cytokinin là chất điều hoà sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân

men…vào môi trường kết hợp với các yếu tố ánh sáng, nhiệt độ thích hợp
nhằm tạo ra hệ số nhân cao nhất. Tuổi mẫu đem vào nuôi cấy cần được chú ý,
thường các mô non chưa phân hoá có khả năng tái sinh cao hơn những mô đã
chuyển hoá.
2.2.6.3.Giai đoạn nhân nhanh chồi
Giai đoạn này là giai đoạn tạo ra hệ số nhân cao nhất. Được coi là then
chốt của quá trình. Điều khiển quá trình này bằng cách bổ xung vào môi
trường nuôi cấy các chất điều hòa sinh trưởng, các chất bổ xung khác như:
nước dừa, dịch chiết nấm men,... kết hợp với yếu tố nhiệt độ và ánh sáng.
2.2.6.4. Tạo cây hoàn chỉnh
Khi đạt được kích thước nhất định các chồi được chuyển sang môi
trường ra rễ. Thường sau 2-3 tuần, các chồi riêng lẻ này sẽ ra rễ và trở thành
cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này người ta bổ sung vào môi trường nuôi cấy các
chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm Auxin, là nhóm hoocmon thực vật quan
trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy.
2.2.6.5. Chuyển cây in vitro ra ngoài vườn ươm
Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình và quyết định khả năng ứng
dụng của quá trình nhân giống in vitro trong thực tiễn sản xuất. Đây là giai
đoạn chuyển cây con từ môi trường dị dưỡng sang môi trường tự dưỡng, do
đó cần phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh thích hợp để cây có thể đạt tỷ
lệ sống cao trong vườn ươm cũng như trong sản xuất.