1

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
---------------------------

PHẠM VĂN HẢI

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG VÀ KHẢO NGHIỆM
MỘT SỐ DÒNG KEO LAI BẰNG PHƯƠNG PHÁP
NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO TẠI VIỆN NGHIÊN CỨU
CÂY NGUYÊN LIÊU GIẤY
Chuyên ngành: Lâm học
Mã số: 60 62 02 01

LUẬN VĂN THẠC SỸ LÂM HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Dương Văn Thảo

Thái Nguyên - 2014


i
LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu này là của riêng tôi, các số liệu
trong công trình này là hoàn toàn trung thực, chính xác. Tôi xin chịu trách
nhiệm hoàn toàn về những kết quả này.

Tác giả


MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1
1.Tính cấp thiết của đề tài ............................................................................ 1
2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài ................................................................. 2
2.1. Mục tiêu của đề tài ................................................................................ 2
2.2. Yêu cầu của đề tài ................................................................................. 3
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ................................................. 3
3.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................. 3
3.2. Ý nghĩa thực tiễn ................................................................................... 3
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài ........................................... 3
4.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................... 3
4.2. Phạm vi nghiên cứu của đề tài .............................................................. 4
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 5
1.1.Những nét chung về các dòng keo lai .................................................... 5
1.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam ............................... 6
Chương 2 : NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 18
2.1. Nội dung nghiên cứu ........................................................................... 18
2.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng và thời gian
khử trùng đến tỷ lệ nẩy chồi , hệ số nhân chồi và tỷ lệ nẩy chồi hữu hiệu
của mẫu thí nghiệm. ................................................................................ 18
2.1.2. Nghiên cứu xác định môi trường tái sinh chồi và tạo nguồn vật liệu ban đầu. 18
2.1.3 Bước đầu đánh giá tình hình sinh trưởng của 3 dòng keo lai KL2,
KLTA3 và KL20 nghiên cứu. ................................................................. 18
2.2 Phương pháp nghiên cứu: .................................................................... 18
2.2.1. Vật liệu nghiên cứu ....................................................................... 18


iv
2.2.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng và
thời gian khử trùng đến tỷ lệ nẩy chồi , hệ số nhân chồi và tỷ lệ nẩy chồi
hữu hiệu của mẫu thí nghiệm .................................................................. 19

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 53
1. Kết luận ................................................................................................... 54
2. Kiến nghị ................................................................................................ 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................... 55


vi

DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT

ĐC

: Đối chứng.

ĐDSH

: Đa dạng sinh học.

GPA

: Global Plant of Action.

MS

: Murashige & Skoog.

SH

: Schenk & Hildebrandt.


KL20 nghiên cứu và 11 dòng keo lai đối chứng thời điểm 6
tháng tuổi. ............................................................................................ 49
Bảng 3.9. Tình hình sinh trưởng 3 dòng keo lai KL2, KLTA3 và
KL20 nghiên cứu và 11 dòng keo lai đối chứng thời điểm 6
tháng tuổi. ............................................................................................ 50


viii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1: Hỉnh ảnh khử trùng mẫu dòng keo lai KL2 .................................... 33
Hình 3.2: Hình ảnh khử trùng mẫu dòng keo lai KL20 .................................. 36
Hình 3.3: Hình ảnh khử trùng mẫu dòng keo lai KLTA3 ............................... 39
Hình 3.4: Một số hình ảnh kết quả thử nghiệm môi trường cơ bản............... 46
Hình 3.5: Hình ảnh vườn thí nghiệm các dòng keo lai 4 tháng tuổi .............. 51
Hình 3.6: Hình ảnh vườn thí nghiệm các dòng keo lai 6 tháng tuổi ............... 51


1

MỞ ĐẦU

1.Tính cấp thiết của đề tài:
Hiện nay, gỗ là nguồn nguyên liệu chính phục vụ cho sản xuất của Tổng
công ty giấy Việt Nam. Nhu cầu nguyên liệu hàng năm của Tổng công ty là
khoảng 500.000m3, trong khi đó các công ty lâm nghiệp mới chỉ cung cấp
được khoảng 60% nhu cầu trên. Thêm vào đó diện tích đất trồng các loài cây
nguyên liệu giấy ngày càng bị thu hẹp do nhu cầu trồng các loài cây công
nghiệp và nông nghiệp khác. Vì vậy việc nghiên cứu nâng cao năng suất và

tương tự. Thực tế cho thấy rừng trồng các dòng keo lai nêu trên tại vùng
Trung tâm Bắc Bộ cho năng suất cao, chất lượng rừng đồng đều và ổn định
hơn tương đối nhiều so với các loài khác.
Khi đã có giống năng suất cao thì việc nhân nhanh và đưa các giống đã
được chọn lọc và trồng rừng sản xuất là vô cùng quan trọng. Trong các kỹ
thuật nhân giống hiện nay ở nước ta thì nhân giống bằng phương pháp nuôi
cấy mô cho hiệu qua cao nhất, đặc biệt là chất lượng di truyền của cây giống
được đảm bảo và khả năng cung cấp số lượng lớn cây giống ở quy mô công
nghiệp. Tuy nhiên, ba giống keo lai nêu trên chưa được tiến hành nghiên cứu
bằng kỹ thuật nuôi cấy mô.
Xuất phát từ những đặc điểm nêu trên, để góp phần nâng cao năng suất và
duy trì tính ổn định của rừng trồng thì việc làm chủ công nghệ nuôi cấy mô ba
dòng keo lai KL2, KL20 và KLTA3 là cần thiết. Do vậy thực hiện đề tài: “Nghiên
cứu nhân giống và khảo nghiệm một số dòng keo bằng phương pháp nuôi cấy
mô tế bào tại Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy” là cần thiết.
2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài
2.1. Mục tiêu của đề tài
Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô invitro để nhân nhanh và tạo thành
công cây mầm mô 3 dòng keo lai KL2, KL20 và KLTA3 góp phần bảo tồn và
phát triển nguồn gen cây nguyên liệu giấy.


3

* Mục tiêu cụ thể:
- Xác định môi trường dinh dưỡng và điều kiện vật lý thích hợp cho
nhân giống in vitro 3 dòng keo lai nói trên.
- Tạo cây mầm mô keo lai 3 dòng KL2, KL20 và KLTA3 chất lượng
cao phục vụ trồng mô hình.
- Bước đầu đánh giá tình hình sinh trưởng 3 dòng keo lai nghiên cứu.

Vì vậy, trong khuôn khổ của đề tài, chúng tôi thực hiện nghiên cứu với
3 dòng keo lai KL2, KL20 và KLTA3 hiện có tại Viện nghiên cứu cây nguyên
liệu giấy.
- Các môi trường nuôi cây; một số hóa chất.
4.2. Phạm vi nghiên cứu của đề tài
Nội dung nghiên cứu của đề tài chỉ giới hạn nghiên cứu nhân giống và
khảo nghiệm bằng phương pháp nuôi cây mô tế bào 3 dòng keo lai KL2,
KL20 và KLTA3 và trồng khảo nghiệm trên thực địa.


5

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.Những nét chung về các dòng keo lai
Keo lai là tên gọi tắt để chỉ giống lai tự nhiên giữa Keo tai tượng
(Acacia mangium) và Keo lá tràm (Acacia auriculiformis), giống lai này được
Messrs Herburn và Shim phát hiện lần đầu tiên vào năm 1972 trong số những
cây Keo tai tượng được trồng ven đường ở Sook Telupid thuộc bang Sabah
của Malaysia. Đến tháng 7 năm 1978, sau khi xem xét các mẫu tiêu bản tại
phòng tiêu bản thực vật ở Queensland (Australia) được gửi đến từ tháng 1
năm 1977 Pedgley đã xác nhận đó là giống lai tự nhiên giữa Keo tai tượng và
Keo lá tràm.
Việt Nam giống keo lai tự nhiên giữa Keo tai tượng và Keo lá tràm
(Acacia mangium x Acacia auriculiformis) được phát hiện từ năm 19911992. Những cây lai này (gọi tắt là Keo lai) được phát hiện ở các vùng như
Tân Tạo, Sông Mây, Trị An, Trảng Bom ở Đông Nam Bộ và Ba Vì (Hà Tây),
Phú Thọ, Hoà Bình, Tuyên Quang vv.. ở Bắc Bộ.
Keo lai là một dạng lai tự nhiên giữa Keo tai tượng với Keo lá tràm, có
tỷ trọng gỗ và nhiều đặc điểm hình thái trung gian giữa Keo tai tượng và Keo
lá tràm. Keo lai có ưu thế lai rõ rệt về sinh trưởng so với Keo tai tượng và

Nhân giống bằng nuôi cấy mô (propagation by tisue culture), hoặc vi
nhân giống (micropropagation) là tên gọi chung cho các phương pháp nuôi
cấy in vitro cho các bộ phận nhỏ được tách khỏi cây đang được dùng phổ biến
để nhân giống thực vật, trong đó có cây lâm nghiệp. Các bộ phận được dùng
để nuôi cấy có thể là chồi đỉnh, chồi bên, chồi bất định, bao phấn, phấn hoa,
phôi và các bộ phận khác như vỏ cây, lá non, thân mầm (hypocotyl) v.v. Song
nuôi cấy mô cho chồi bên và chồi bất định là những phương pháp chính được
dùng trong nhân giống cây rừng.


7
Hiện nay, đã có rất nhiều các loài cây lâm nghiệp được nhân giống
thành công bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào như các loài Acacia,
các loài Eucalyptus, ... Trong đó, cây keo lai Acacia hybrid là một trong
những đối tượng chính, được nhân giống thành công ở nhiều nước như
Malaysia, Ấn Độ ....
R .Yasodha (2004)[23], đã nghiên cứu tái sinh cây keo lai bằng phương
pháp nuôi cấy mô tế bào cho kết quả sử dụng chất khử trùng HgCl2, mùa tốt
nhất để vào mẫu là tháng 5 và tháng 8, sử dụng môi trường MS bổ sung IBA
3.0-5.0 mg/l, NAA 1.0 mg/l và IAA 3.0 mg/l là tốt nhất với dòng No.10; sử
dụng môi trường MS bổ sung IBA 2.0-4.0 mg/l, NAA 1.0 mg/l và IAA 2.0 3.0 mg/l là tốt nhất với dòng No.32.
Christine Le Roux (2009)[21], đã lựa chọn chồi nách từ cây mẹ 1.5 năm
tuổi, các chồi được khử trùng và vào mẫu thành công. Đầu tiên tác giả sử
dụng Tween 20 để rửa mẫu, khử trùng trong cồn 700 trong 30s để khử trùng
bề mặt. Sau đó tiến hành khử trùng sâu với HgCl2 0.1% trong 1-2 phút. Các
chồi in vitro được ra rễ thành công trên môi trường MS giảm ½ nồng độ muối
đa lượng, bổ sung với 0.1 mM NaFe-EDTA, 1.03 µM NAA và 58.4 µM
succharose, pH của môi trường được điều chỉnh ở mức 5.7 và môi trường
được ổn định bằng Phytagel 0.3%. Điều kiện vật lý trong quá trình nuôi cấy là
280C, 16h chiếu sáng ở cường độ 60 µmol.m2.s1.

tục thực hiện quá trình phân hóa, quá trình này gọi là sự phản phân hoá
của tế bào.
Về bản chất thì sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá
phân hoá gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có
một số gen được hoạt hoá để cho ra tính trạng mới, một số gen khác lại bị ức
chế hoạt động. Quá trình này xảy ra theo một chương trình đã được mã hoá
trong cấu trúc của phân tử AND của mỗi tế bào. Khi tế bào nằm trong cơ thể
thực vật, chúng bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách tế bào riêng rẽ,
gặp điều kiện thuận lợi thì các gen được hoạt hoá, quá trình phân chia sẽ được
xảy ra theo một chương trình đã định sẵn trong AND của tế bào.
Tài nguyên di truyền cây nông nghiệp tức là quỹ gen cây nông nghiệp,
được FAO gọi là tài nguyên di truyền thực vật vì mục tiêu lương thực và nông
nghiệp (TNDTTVLN), lại là phần có trọng số lớn nhất của toàn bộ tài nguyên


9

di truyền thực vật. Sự xói mòn nguồn gen cây trồng trong nông nghiệp gây ra
bởi nhiều nguyên nhân hiện nay đang là vấn đề nghiêm trọng, Để có thể bảo
tồn và sử dụng hiệu quả đa dạng sinh học nông, lâm nghiệp trong đó tài
nguyên di truyền thực vật là hạt nhân, Hội nghị Thượng đỉnh lần thứ nhất về
môi trường họp tại Stockholme, Thụy Điển năm 1972 đã kêu gọi khẩn cấp
nhiệm vụ bảo tồn tài nguyên di truyền thực vật. Hai mươi năm sau, Hội nghị
Thượng đỉnh lần thứ hai họp tại Río de Janero, Brazin năm 1992 đã thoả
thuận Công ước đa dạng sinh học. Hội nghị Kỹ thuật quốc tế lần thứ tư về tài
nguyên di truyền thực vật phục vụ mục tiêu lương nông do FAO triệu tập năm
1996 tại Cộng hòa liên bang Đức đã thống nhất Kế hoạch hành động toàn cầu
(Global Plant of Action, GPA) về bảo tồn quỹ gen cây nông nghiệp. Gần đây,
tháng 11 năm 2001 Đại hội đồng FAO đã thông qua Hiệp ước về Tài nguyên
di truyền thực vật phục vụ mục tiêu lương nông nhằm thiết lập một hệ thống

hợp quốc (FAO) đã thực hiện dự án đầu tư xây dựng các khu bảo tồn ex situ
cho bạch đàn ở một số nước như Thái Lan, ấn Độ, Nigiêria, Băng-la-đét...
- Australia, năm 1972 đã tiến hành xây dựng các khu bảo tồn gen insitu cho bạch đàn với mục tiêu bảo tồn nguồn gen hơn là bảo tồn các cây cá
thể. Yêu cầu cơ bản là duy trì các quần thể bằng cách tái sinh tự nhiên hoặc
nhân tạo từ nguồn hạt giống thu hái trong khu bảo tồn và tái tạo thế hệ mới từ
nhiều cây cá thể.
- Ở Trung Quốc, từ những năm 1978 Viện nghiên cứu lâm nghiệp
Khâm Châu tỉnh Quảng Tây đã tiến hành bảo tồn nguồn gen bạch đàn bằng in
vitro. Sau đó hình thức bảo tồn này được áp dụng rộng rãi ở nhiều nơi (Viện
khoa học lâm nghiệp Quảng Tây, Viện khoa học lâm nghiệp Quảng Đông...)
cho các đối tượng: Bạch đàn, thông, keo và một số loài cây khác [10].
- Công ty Aracruz (Braxin), ngay từ những năm 1984 đã chọn 5.000
cây trội từ 36.000 ha rừng trồng bạch đàn. Từ đó đã chọn ra 150 dòng phù
hợp nhưng chỉ sử dụng 31 dòng tốt nhất vào chương trình trồng rừng. Năm


11
1989, vốn gen của họ có 2.000 xuất xứ của 56 loài bạch đàn, trên 7.000 cây
đã được kiểm tra đánh giá và 100 cây chứng tỏ có triển vọng cao.
- FAO đã đầu tư cho xây dựng một số khu bảo tồn ex situ cho bạch đàn
ở một số nước như Thái Lan, ấn Độ, Nigiêria, Băng-la-đét...
Nhìn chung, tất cả các nghiên cứu và đầu tư trên đều tập trung vào tầm
quan trọng của công tác bảo tồn nguồn gen, nó có vai trò rất quan trọng trong
công tác giống, một số thàng tựu đã đạt được và các nghiên cứu vẫn đang
được thực hiện trên thế giới.
* Ở Việt Nam
Cây keo lai tự nhiên đã được phát hiện tại Việt Nam, Thái Lan,
Malaysia, Indonesia, Australia, nam Trung Quốc và một số nước khác ở vùng
Châu Á - Thái Bình Dương, ở vĩ độ 8 - 22o Bắc, độ cao 5 - 300 m trên mặt
biển, nơi có lượng mưa hàng năm 1500 - 2500 mm/năm, nhiệt độ trung bình

cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng lên quá trình nhân chồi
cây keo lai. Báo cáo cho thấy, chồi mẫu cây keo lai được đưa vào ống nghiệm
trong điều kiện xử lý với HgCl2 0.1% trong 15 phút với tỷ lệ đạt 5%. Môi
trường nhân chồi hữu hiệu là môi trường M7274 bổ sung 3% saccharose,
CH500, PVP, 0.3 mg/l IAA, 5 mg/l KT và 0.3 mg/l IBA. Môi trường tạo rễ
hoàn chỉnh cây keo lai trong ống nghiệm là môi trường ½ M7274 bổ sung 0.7
mg/l IBA.
Đoàn Thị Mai (2009)[8], đã nhân thành công bằng phương pháp nuôi
cấy mô cho một số dòng keo lai mới chọn tạo như BV71, BV73 và BV75.
Báo cáo cho thấy điều kiện khử trùng mẫu hữu hiệu là HgCl2 0.1% trong 8
phút với tỷ lệ đạt khoảng 10%, môi trường nuôi cấy cơ bản là môi trường MS
cải tiến bổ sung BAP 1.5 mg/l và NAA 0.5 mg/l, môi trường ra rễ thích hợp là
½ MS cải tiến bổ sung IBA 1.5 mg/l.
Ngoài ra, hiện nay cây keo lai mầm mô các dòng BV10, BV16, BV32
đã được ứng dụng nhân giống và sản xuất thành công tại nhiều cơ sở trong


13
nước như Trung tâm Ứng dụng khoa học và sản xuất lâm - nông nghiệp
Quảng Ninh, công ty TNHH Nguyên Hạnh ở Bình Định (quy mô 4 triệu
cây/năm), Trung tâm Ứng dụng - chuyển giao công nghệ Phú Yên ...
Cây keo lai nhân giống bằng công nghệ nuôi cấy mô có những ưu điểm
như các cây con đồng nhất về mặt di truyền, mang đầy đủ những ưu thế lai
của cây mẹ, hệ số nhân cao, rút ngắn thời gian đưa giống vào sản xuất, trong
1m2 nền có thể để được 18,000 cây. Cây được làm sạch bệnh và không tiếp
xúc với các nguồn bệnh nên đảm bảo các cây giống sạch bệnh. Cây keo lai
cấy mô sau khi trồng có tốc độ sinh trưởng nhanh và đồng đều, thân lên
thẳng, ít phân nhánh, không chẻ thân, có rễ cọc chắc chắn, thân không giòn,
chịu được gió mạnh, ít đổ ngã nên có thể trồng thành cây lâu năm lấy gỗ,
nâng cao giá trị kinh tế. Cây Keo lai cấy mô khắc phục được những nhược

sạch virus, nhân nhanh các giống cây trồng, sản xuất và chuyển hóa sinh học
các hợp chất tự nhiên cải tiến về mặt di truyền các giống cây mang lại hiệu
quả kinh tế cao. Kỹ thuật nhân nhanh được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực:
- Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quí hiếm làm vật liệu cho công
tác chọn giống.
- Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống
các loại cây trồng khác nhau.
- Nhân nhanh các kiểu gen quí hiếm của giống cây lâm nghiệp.
- Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng, cách ly tải nhiễm kết hợp với làm
sạch virus.
- Bảo quản tập đoàn nhân giống vô tính, các loài cây giao phấn trong
ngân hàng gen.
Trên thực tế trong nhiều năm vừa qua Viện nghiên cứu cây nguyên liệu
giấy đã và đang chọn lọc được nhiều giống là giống quốc gia, giống tiến bộ
kỹ thuật và nhiều giống khác có năng suất cao hoặc các giống có các tính ưu
việt khác cho cây nguyên liệu giấy nói riêng và cho trồng rừng nói chung.
Việc lưu giữ và bảo tồn nguồn gen của các giống này là rất cần thiết.


15
Việc bảo tồn, lưu giữ tài nguyên di truyền được thực hiện dưới nhiều
hình thức khác nhau (in situ, ex situ) tại các cơ sở, tổ chức, các thành phần
kinh tế khác và được liên kết thành một mạng lưới dưới sự quản lý thống nhất
của Bộ Khoa học và Công nghệ. Trong những năm qua việc bảo tồn nguồn
gen thực vật, động vật, vi sinh vật đã thu được một số kết quả nhất định.
Trong đó việc bảo tồn nguồn gen cây lâm nghiệp nói chung và cây nguyên
liệu giấy nói riêng mới được bảo tồn ở hình thức in situ và ex situ dạng Field
gene bank (trồng thành rừng) còn bảo tồn in vitro thì hầu như chưa có đơn vị
nào triển khai ngoài Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy [10].
Theo thống kê, ở Việt Nam có khoảng 100 loài trong số hơn 14.624

đã chọn được loài P. caribaca hondurensis với xuất xứ từ Mountain Pine
Ridege thuộc cộng hoà Belize đưa vào trồng ở phía nam nguyên liệu. Đã chọn
ra được 100 cây trội.
Đối với bạch đàn: Từ năm 1979, Viện đã khảo nghiệm hơn 80 loài và
xuất xứ trên 43 điểm/lập địa. Kết quả đã chọn được 4 loài: E. camaldulensis,
E. tereticornis, E. urophylla, E. grandis x E. urophylla và các xuất xứ:
Pettford (Queensland – Australia) của loài E. camaldulensis, xuất xứ
Lewotobi (Indonesia) của loài E. urophylla. Các khảo nghiệm dòng dõi (kể cả
các dòng dõi tự do thụ phấn và dòng vô tính) của các loài trên cũng đã được
triển khai cùng với việc chọn được 200 cây trội.
Đối với keo: Năm 1981, Viện đã khảo nghiệm trên 100 loài ở 30
điểm/lập địa và đã chọn ra một số loài sinh trưởng nhanh, phát triển tốt. Đó là
các loài A. mangium, A. crasicarpa, A. aulacocarpa, A. mangium x A.
auriculifocmis, A. auriculifocmis x A. mangium. Các xuất xứ tốt như: Iron
Range, Cardwell, Mossman của loài A. mangium. Đã tuyển chọn được 100
cây trội của các xuất xứ này.
Giống là một trong những khâu quan trọng nhất của trồng rừng thâm
canh, không có giống được cải thiện theo mục tiêu kinh tế thì không thể đưa