Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
------------------------ -----------------------
ĐẶNG NGỌC HÙNG

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÁC DÕNG BẠCH ĐÀN LAI UE35 VÀ
UE56 GIỮA EUCALYPTUS UROPHYLLA VÀ E. EXSERTA BẰNG
PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ

LUẬN VĂN THẠC SỸ LÂM SINH


PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ
CHUYÊN NGÀNH: LÂM HỌC
MÃ SỐ: 60.62.60
LUẬN VĂN THẠC SỸ LÂM SINH NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
GS.TS. LÊ ĐÌNH KHẢ
THS. ĐOÀN THỊ MAI THÁI NGUYÊN – 2009

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
MỤC LỤC

1.6.1. Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla)......................................................... 16
1.6.2. Bạch đàn liễu (Eucalyptus exserta) ............................................................ 17
1.6.3. Bạch đàn lai ................................................................................................ 17
1.6.4. Nhân giống Bạch đàn bằng nuôi cấy mô ................................................... 20
1.7. Một số kết quả nổi bật về nuôi cấy mô cây thân gỗ và Bạch đàn ............... 21
1.7.1. Trên thế giới................................................................................................ 21
1.7.2. Nhân giống cây gỗ bằng phương pháp nuôi cấy mô ở Việt Nam ............... 25
CHƢƠNG 2: MỤC TIÊU, ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ..................................................................................................... 28
2.1. Mục tiêu nghiên cứu ..................................................................................... 28
2.2. Đối tƣợng nghiên cứu ................................................................................... 28
2.2.1. Một số đặc điểm chính của dòng UE35 và dòng UE56 .............................. 28
2.2.2. Cây mẹ lấy vật liệu ...................................................................................... 28
2.2.3. Vật liệu nuôi cấy (mẫu cấy) ........................................................................ 29
2.3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 29
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................. 30
2.4.1. Chọn loại môi trường phù hợp ................................................................... 31
2.4.2. Ảnh hưởng của mùa vụ đến khả năng tái sinh chồi ban đầu..................... 31
2.4.3. Ảnh hưởng của vitamin B2 đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu .... 32
2.4.4. Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng đến hệ số nhân chồi (HSNC)
và chất lượng chồi (TLCHH) ............................................................................... 32
2.4.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến HSNC và TLCHH ................................. 32
2.4.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP+IAA đến HSNC và TLCHH ........................ 33
2.4.4.3. Ảnh hưởng của nồng độ BAP + NAA đến HSNC và TLCHH ..................... 34
2.4.4.4. Ảnh hưởng của nồng độ BAP + Kinetin đến HSNC và TLCHH ................. 34
2.4.4.5. Ảnh hưởng của nồng độ BAP + Kinetin + NAA đến HSNC và TLCHH ..... 35
2.4.4.6. Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây và chiều
dài trung bình của rễ ............................................................................................. 35
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
2.4.4.7. Ảnh hưởng của nồng độ IBA+ ABT1 đến tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây

chồi ra rễ, số rễ trung bình/cây và chiều dài của rễ ............................................. 63
3.5.7. Ảnh hưởng của tổ hợp IAA + ABT1 đến tỷ lệ chồi ra rễ, số rễ trung
bình/cây và chiều dài của rễ ................................................................................. 66
3.5.8. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao của cây
con ở vườn ươm.................................................................................................... 68
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Chƣơng 4: KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ ........................................ 72
4.1. Kết luận ......................................................................................................... 72
4.2. Tồn tại ........................................................................................................... 72
4.3. Kiến nghị ....................................................................................................... 73
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 75
Tài liệu tiếng việt ................................................................................................ 75
Tài liệu tiếng Anh ................................................................................................ 77
Phụ Lục

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
LỜI NÓI ĐẦU
Nâng cao chất lượng đào tạo bằng nghiên cứu khoa học là mục tiêu
quan trọng trong việc đào tạo cao học của Trường đại học Nông Lâm Thái
Nguyên. Để hoàn thành chương trình đào tạo cao học Lâm nghiệp khoá học
2006-2009, được sự đồng ý của Khoa sau đại học - Trường Đại học Nông
Lâm Thái Nguyên, tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp “Nghiên cứu nhân giống
các dòng Bạch đàn lai UE35 và UE56 giữa Eucaliptus urophylla và E.
exsertar bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào”.
Sau thời gian học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi đã
nhận được sự quan tâm và giúp đỡ tận tình về nhiều mặt của Trường đại học
Nông Lâm Thái Nguyên, đặc biệt là khoa sau đại học, cùng các thầy cô giáo
trực tiếp giảng dạy, cũng như lãnh đạo Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng
thuộc Viện khoa học Lâm nghiệp Hà Nội, bộ môn công nghệ tế bào thuộc
Viện khoa học sự sống - trường đại học Nông Lâm Thái Nguyên. Cho phép


44
3.4 Ảnh hưởng của việc bổ sung vitamine B2 đến HSNC và TLCHH của
UE35 và UE56 (180 mẫu cấy/công thức) ……………………………..

47
3.5 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến HSNC và TLCHH của Bạch đàn lai
dòng UE35 và UE56 (180 mẫu/công thức) …………………….……...

51
3.6 Ảnh hưởng sự phối hợp nồng độ BAP + IAA đến HSNC và TLCHH
của dòng UE35 và UE56 (180 mẫu/ công thức) ………………………

53
3.7 Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA đến HSNC và
TLCHH của 2 dòng Bạch đàn lai UE35 và UE56 (180 mẫu cấy/công
thức)…………………………………………………………………… 56
3.8 Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + Kinetin đến HSNC và
TLCHH của 2 dòng UE35 và UE56 (180 chồi cấy/công thức) ………

59
3.9 Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA + Kinetin đến
HSNC và TLCHH (180 chồi cấy/công thức) ………………………….

61
3.10 Ảnh hưởng nồng độ IBA đến tỷ lệ chồi ra rễ, số rễ trung bình và chiều
dài của rễ (180 chồi cây/ công thức) …………………………………..

3.5b: Biểu đồ ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + Kinetin đến TLCHH
của dòng UE35 và UE ........................................................................................... 60
3.6a: Biểu đồ ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA + Kinetin đến
HSNC của dòng UE35 và UE ................................................................................ 62
3.6b: Biểu đồ ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA + Kinetin đến
TLCHH của dòng UE35 và UE ............................................................................. 62
3.7a: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ IBA tỷ lệ ra rễ của dòng UE35 và UE ......... 65
3.7b: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ IBA tới số rễ trung bình của dòng UE35
và UE .................................................................................................................... 65
3.8a: Biểu đồ ảnh hưởng của tổ hợp IBA + ABT1tới tỷ lệ ra rễ của dòng
UE35 và UE .......................................................................................................... 67
3.8b: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ IBA + ABT1 tới số rễ trung bình của
dòng UE35 và UE ................................................................................................. 67
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

TT Tên bảng Trang
3.1. Ảnh khử trùng mẫu cấy và mẫu nuôi cấy sau 20 ngày ……………... 43
3.2. Ảnh dòng UE35 cấy trong 5 loại môi trường ………………………. 46
3.3 Ảnh mẫu được cấy sang môi trường có bổ sung vitamin B2 sau 10
ngày nuôi cấy ………………………………………………………..

47
3.4a. Ảnh chồi nuôi cấy trong môi trường MS
*
có bổ sung 2,0mg/l B2 … 48
3.4b. Ảnh chồi nuôi cấy trong môi trường MS
*
có bổ sung 2,0mg/l B2 … 49
3.5. Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA đến HSNC và

3
: Gibberellin acid 3
HgCl
2
: Clorua thuỷ ngân
HSNC : Hệ số nhân chồi
IAA : Indol acetic acid
IBA : 3-Indol butyric acid
Kinetine : 6- Furfuryl aminopurine - C
10
H
9
N0
5

NAA : Nathyl acetic acid
Na0Cl : Hypoclorit natri
TTG1 : Thuốc kích thích ra rễ có gốc IBA của Trung tâm
giống - Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam
TLCHH : Tỷ lệ chồi hữu hiệu

1
MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã không
ngừng phát triển và thu được những thành tựu đáng kể. Kỹ thuật này ra đời nhanh
chóng có vị trí quan trọng trong lĩnh vực công nghệ sinh học về sản xuất giống cây
trồng. Ưu điểm nổi bật của phương pháp này là có thể nhân nhanh, giữ được đặc
điểm di truyền ổn định, có thể sản xuất với số lượng cá thể lớn trong thời gian ngắn.
Cây nuôi cấy mô thường được trẻ hoá cao độ và có rễ giống như cây mọc từ hạt.

Để hạn chế lây lan của dịch bệnh có thể xảy ra thì một trong những biện
pháp kỹ thuật là trồng hỗn loài các dòng vô tính khác nhau. Ở Nước ta hiện nay có
khoảng 12 dòng Bạch đàn đã được Bộ NN&PTNT công nhận và cho phép trồng
rừng sản xuất, trong khi đó mới có U6, GU8, PN2, PN14, PN32 là những dòng đã
được nhân giống bằng nuôi cấy mô đã qua khảo nghiệm, nghiên cứu nhân giống
bằng phương pháp nuôi cấy mô để cung cấp cho rừng trồng.
Hiện nay, nhu cầu cây giống Bạch đàn có năng suất cao và đã qua khảo
nghiệm, cũng như của hai dòng này nhằm phục vụ trồng rừng khá lớn. Thời gian
qua Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng thuộc Viện khoa học Lâm nghiệp đã thử
nghiệm áp dụng quy trình nhân giống nuôi cấy mô hai dòng UE35 và UE56 và đã
có kết quả bước đầu. Việc nghiên cứu nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô để
hoàn thiện công nghệ và phục vụ sản xuất giống là rất cần thiết. Từ những đặc
điểm, nhu cầu thực tiễn và nhu cầu khoa học nêu trên, chúng tôi tiến hành đề tài:
“Nghiên cứu nhân giống các dòng bạch đàn lai UE35 và UE56 giữa Eucaliptus
urophyla và E. exserta bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô”. Đây cũng là một phần
kết quả của đề tài “Nghiên cứu nhân giống Keo lai tự nhiên, Keo lai nhân tạo, Bạch
đàn urophyla, Bạch đàn lai nhân tạo (mới chọn tạo) và Lát hoa bằng công nghệ tế
bào” - chủ nhiệm đề tài: Đoàn Thị Mai - Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng
thuộc Viện khoa học Lâm nghiệp Việt Nam thực hiện.

3
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1. Khái niệm về nhân giống lai trong lâm nghiệp
Giống lai là giống được tạo ra do lai tự nhiên hoặc lai nhân tạo giữa các cá thể
có kiểu gen (genotype) khác nhau. Giống lai thường có năng suất cao và có tính
chống chịu với các điều kiện bất lợi tốt hơn bố mẹ. Vì thế, tạo và sử dụng giống lai
đang là mối quan tâm hàng đầu của các nhà chọn giống nông lâm nghiệp trên thế
giới (Lê Đình Khả, 2006).

cây trưởng thành sau 4-8 tháng đã có một số cây có hoa, trong lúc cây mọc từ hạt
nhanh nhất cũng phải sau 8 năm mới có hoa (Grosdova, 1985). Điều đó chứng tỏ
cây nuôi cấy mô tuy có mức độ trẻ hoá cao hơn cây ghép và cây hom lấy từ cành
của cây trưởng thành (chứ không phải lấy từ chồi của cây đã trẻ hoá) song không
thể trẻ như cây mọc từ hạt.
1.3. Cơ sở khoa học của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào
1.3.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật
Nguyên lý cơ bản của nhân giống nuôi cấy mô tế bào là tính toàn năng của tế
bào thực vật. Mỗi tế bào bất kỳ của cơ thể thực vật đều mang toàn bộ lượng thông
tin di truyền cần thiết và đầy đủ của cả thực vật đó còn gọi là bộ gen (genom). Đặc
tính của thực vật được thể hiện ra kiểu hình cụ thể trong từng thời kỳ của quá trình
phát triển phụ thuộc vào sự giải mã các thông tin di truyền tương ứng trong hệ gen
của tế bào. Do đó, khi gặp điều kiện thích hợp, trong mối tương tác qua lại với điều
kiện môi trường, cơ quan, mô hoặc tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể
mới hoàn chỉnh mang những đặc tính di truyền giống như cây mẹ.
1.3.2. Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô là kết quả phân hoá và phản
phân hoá tế bào. Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm
nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào khác nhau, thực
hiện chức năng cụ thể khác nhau. Các mô có được cấu trúc chuyên môn hoá nhất
định nhờ vào sự phân hoá.

5
Phân hoá tế bào là sự chuyển hoá các tế bào phôi sinh thành các tế bào của
mô chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể. Quá trình phân
hoá có thể diễn như sau:
Tế bào phôi sinh Tế bào dẫn Tế bào phân hoá chức năng
Khi tế bào đã phân hoá thành mô chức năng, chúng không hoàn toàn mất khả
năng phân chia của mình. Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng
lại có thể trở về dạng giống như tế bào phôi sinh và tiếp tục thực hiện quá trình phân

Tế bào chuyển hoá

6
của tế bào thực vật. Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, người ta
thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực
vật là Auxin và Cytokinin. Tỷ lệ hàm lượng hai nhóm chất này trong môi trường
khác nhau sẽ tạo ra sự phát sinh hình thái khác nhau theo quy luật được biểu thị ở
sơ đồ bên. Theo sơ đồ, khi trong môi trường nuôi cấy có tỷ lệ nồng độ Auxin (IAA,
IBA, NAA, 2,4-D)/Cytokinin (BAP, Kinetin, Zeatin, TDZ) thấp thì sự phát sinh
hình thái của mô nuôi cấy theo hướng tạo chồi, ngược lại nếu tỷ lệ cao thì mô nuôi
cấy sẽ theo hướng tạo rễ còn ở tỷ lệ cân đối sẽ phát sinh theo hướng tạo mô sẹo
(callus).
1.4. Các nhân tố ảnh hƣởng tới quá trình nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào
Nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào gồm nhiều giai đoạn kế tiếp nhau, quá
trình này có thể chia thành các nhân tố sau:
1.4.1. Môi trường nuôi cấy
Trong nuôi cấy in vitro, môi trưởng nuôi cấy và điều kiện bên ngoài được
xem là vấn để quyết định sự thành bại của quá trình nuôi cấy. Môi trường nuôi cấy
được xem là phần đệm để cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự tăng
trưởng và phân hoá mô trong suốt quá trình nuôi cấy in vitro. Cho đến nay, đã có
nhiều môi trường dinh dưỡng được tìm ra (MS-62, WPM, WV3, N6, B5, LS…) tuỳ
thuộc vào đối tượng và mục đích nuôi cấy. Vấn đề lựa chọn môi trường thích hợp
cho cây sinh trưởng và phát triển tối ưu trong từng giai đoạn của nôi cấy mô là rất
quan trọng. Môi trường nuôi cấy của hầu hết các loài thực vật bao gồm các muối
khoáng đa lượng, vi lượng, nguồn các bon, các acid amine và các chất điều hoà sinh
trưởng (cũng có thể bổ sung thêm một số chất phụ gia khác như than hoạt tính, nước
dừa …) tuỳ từng loài, giống, nguồn gốc mẫu, thậm chí từng cơ quan trên cùng cơ
thể mà dinh dưỡng cần cho sự sinh trưởng tối ưu của chúng khác nhau. Vì vậy, vấn
đề cần lựa chọn môi trường thích hợp cho sinh trưởng, phát triển tối ưu cho từng
giai đoạn của hệ mô trong nuôi cấy mô rất quan trọng, số lượng và các loại hoá chất

vậy giải pháp sử dụng phối hợp cả 2 nguồn nitrơ với tỷ lệ hợp lý được sử dụng rộng
rãi nhất.
+ Các nguyên tố đa lượng: là những nguyên tố khoáng như: N, P, K, S, Mg,
Ca… cần thiết và thay đổi tuỳ đối tượng nuôi cấy. Nhìn chung, các nguyên tố này
được sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm (tỷ lệ phần nghìn). Các nguyên tố này có chức
năng cung cấp nguyên liệu để mô hoặc tế bào thực vật xây dựng thành phần cấu
trúc hoặc giúp cho quá trình trao đổi chất giữa các tế bào thực vật với môi trường
được thuận lợi.
Có nhiều môi trường với thành phần, tỷ lệ các chất khác nhau, chúng ta có thể
lựa chọn sử dụng. Nói chung, môi trường giàu Nitơ và Kali thích hợp cho việc hình
thành chồi, còn môi trường giàu Kali sẽ thúc đẩy quá trình trao đổi chất mạnh hơn.
Thành phần khoáng của một môi trường cấy được xác định do sự cân bằng
nồng độ của những ion khác nhau trong dung dịch (nồng độ ion thể hiện bằng mg/l).
Việc lựa chọn thành phần và hàm lượng khoáng cho một đối tượng nuôi cấy là rất
khó đòi hỏi người làm công tác nuôi cấy mô phải có những hiểu biết cơ bản về sinh
lý thực vật đối với dinh dưỡng khoáng.
+ Nhóm nguyên tố vi lượng: Fe, Cu, BO, Zn, Mn, Co, I… là các nguyên tố
rất quan trọng và không thể thiếu cho sự phát triển của mô và tế bào do chúng đóng

8
vai trò quan trọng trong các hoạt động của enzym. Chúng được dùng ở nồng độ thấp
hơn nhiều so với các nguyên tố đa lượng để đảm bảo sinh trưởng và phát triển bình
thường của cây (Nguyễn Văn Uyển, 1993).
+ Các vitamin: Mặc dù cây nuôi cấy mô có thể tự tổng hợp được Vitamin,
nhưng không đủ cho nhu cầu (Czocnowki, 1952). Do đó, để cây sinh trưởng tối ưu
một số Vitamin nhóm B được bổ sung vào môi trường với lượng nhất định tuỳ theo
từng hệ mô và giai đoạn nuôi cấy. Các Vitamin B1 (Thiamin) và B6 (Pyridocin) là
những Vitamin cơ bản nhất thường dùng trong môi trường nuôi cấy với nồng độ
thấp khoảng 0,1-1mg/l (Trần Văn Minh, 1994).
+ Dung dịch hữu cơ: có thành phần không xác định như nước dừa, dịch chiết

N0
5
), BAP (6-
Benzyl amino purine), Zip (Izopentenyl adenin), Zeatin… Trong các chất này thì
Kenitin và BAP được sử dụng phổ biến nhất vì chúng có hoạt tính cao và giá thành
rẻ. Tuỳ vào từng hệ mô và mục đích nuôi cấy mà Cytokinin được sử dụng ở các
nồng độ khác nhau. Ở nồng độ thấp (10
-7
- 10
-6
M) chúng có tác dụng kích thích sự
phân bào, ở nồng độ 10
-6
- 10
-5
M chúng kích thích sự phân hoá chồi. Trong nuôi cấy
mô để kích thích sự nhân nhanh người ta thường xử dụng Cytokinin với nồng độ 10
-
6
- 10
-4
(Lê Văn Chi, 1992).
+ Gibberellin: Nhóm này có khoảng 20 loại hormone khác nhau nhưng quan
trọng nhất là GA
3
(Gibberellin acid 3). GA
3
có tác dụng kích thích nảy mầm của các
loại hạt khác nhau, kéo dài các lóng đốt thân cành. Bên cạnh đó GA
3

Cường độ ánh sáng cao kích thích sinh trưởng của mô sẹo trong khi cường độ thấp
gây nên sự tạo chồi (Ammirato, 1986). Nhìn chung, cường độ ánh sáng thích hợp
cho mô nuôi cấy là từ 1000 - 7000 lux (Moresin, 1974).
Bên cạnh thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng thì chất lượng ánh sáng
cũng ảnh hưởng khá rõ tới sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy. Ánh sáng đỏ làm
tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng, còn ánh sáng xanh thì ức
chế sự vươn cao của chồi nhưng lại ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo.
Chính vì vậy mà trong phòng thí nghiệm thường sử dụng ánh sáng của đèn
huỳnh quang với cường độ 2000 - 3000 lux.
+ Nhiệt độ: là nhân tố có ảnh hưởng rõ rệt đến sự phân chia tế bào và các quá
trình trao đổi chất của mô nuôi cấy, đồng thời nó có ảnh hưởng tới sự hoạt động của
Auxin, do đó làm ảnh hưởng đến khả năng ra rễ của cây mô. Theo kết quả nghiên
cứu của Vonanorld (1982) thì nếu nhiệt độ ngày/đêm là 20
0
C/15
0
C hoặc 20
0
C/18
0
C

11
tỷ lệ ra rễ đạt được khoảng 33%, thậm chí còn thấp hơn. Ở nhiệt độ trung bình thì
hoạt động trao đổi chất tốt hơn. Còn ở nhiệt độ cao lại thích ra nhiều tế bào không
có tổ chức. Trong nuôi cấy mô, nhiệt độ thường được duy trì ổn định, ban ngày từ
25 - 30
0
C và ban đêm từ 17 - 20
0

 Dung dịch khử trùng: để khử trùng vật liệu đưa vào nuôi cấy người ta thường
sử dụng các dung dịch như HgCl
2
(clorua thuỷ ngân), Na0Cl (Hypoclorit
natri), Ca (0Cl)
2
(Hypoclorit canxi), H
2
0
2
(ôxi già) (Street, 1974)…cồn dùng
để khử trùng mẫu sơ bộ và đốt các dụng cụ khi nuôi cấy.
 Phễu lọc vô trùng: dùng để khử trùng các dung dịch, không khử trùng được ở
nhiệt độ cao như dung dịch Enzym hoặc một số chất điều hoà sinh trưởng.
Hiện nay, người ta thường sử dụng một hệ thống bơm khử trùng dung tích
lớn để thanh trùng các dung dịch nuôi cấy khi nuôi cấy tế bào trần hay huyền
phù tế bào.
 Buồng vô trùng: nơi đặt bàn cấy cần kín gió, cao ráo, sạch sẽ. Buồng phải
được tiệt trùng liên tục trước và sau khi làm việc bằng Foocmon kết hợp
chiếu đèn tử ngoại.
 Bàn cấy vô trùng: Tốt nhất là sử dụng bàn cấy Laminair flow box. Thiết bị
này làm việc theo nguyên tắc lọc không khí vô trùng qua màng và thổi không
khí vô trùng về phía người ngồi thao tác.
1.4.6. Buồng nuôi cấy
Buồng nuôi cấy là nơi dùng để đặt các mẫu nuôi cấy. Buồng cấy cần phải
đảm bảo các điều kiện:
- Nhiệt độ: 25 - 30
0
C
- Ánh sáng đạt 2000 - 3000 lux.

thì độ trẻ hoá cao, nuôi cấy dễ thành công. Các mô lấy ở thời kỳ sinh trưởng mạnh
của cây trong mùa sinh trưởng cho khả năng tái sinh tốt hơn (Anoleson, 1980). Đối
với mẫu dễ bị hoá nâu khi nuôi cấy có thể bổ sung than hoạt tính hoặc polyvinin
pyrroline (PVP) vào môi trường (Lê Đình Khả, 1999). Giai đoạn này cần đảm bảo
các yêu cầu: tỷ lệ mô nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt. Kết
quả của giai đoạn này phụ thuộc vào việc chọn bộ phận nuôi cấy, cho nên khi lấy
mẫu cần đảm bảo các nguyên tắc nêu trên. Giai đoạn này thường kéo dài từ 4 - 6 tuần.
1.5.3. Giai đoạn nhân nhanh
Một trong những ưu điểm của phương pháp nhân giống in vitro so với các
phương pháp nhân giống khác có hệ số nhân cao. Vì vậy, có thể coi đây là giai đoạn
then chốt của toàn bộ quá trình nhân giống. Hệ số nhân ở giai đoạn này biến động từ
5-50 lần tuỳ thuộc vào loài cây, môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp. Trong
giai đoạn này vai trò của các chất điều hoà sinh trưởng (Auxin, Cytokinin) là cực kỳ
quan trọng để sản sinh ra lượng cây con tối đa mà vẫn đảm bảo sức sống và bản chất
di truyền của cây. Theo nguyên tắc chung thì môi trường có nhiều Kitocinin sẽ kích
thích tạo chồi. Chế độ nuôi thường là 25-27
0
C và 10-16h/ngày, cường độ chiếu sáng

14
1000 lux. Yêu cầu của giai đoạn này là tạo ra số lượng cây con tối đa trong thời
gian ngắn nhưng vẫn đảm bảo sức sống và bản chất di truyền của cây.
1.5.4. Tạo cây hoàn chỉnh (ra rễ)
Đây là giai đoạn chuẩn bị cho cây con chuyển ra ngoài hệ thống vô trùng khi
đã đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ giai đoạn 3 sang môi
trường tạo rễ. Thường sau 2-3 tuần ở các chồi này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây
hoàn chỉnh. Môi trường tạo rễ thường giảm lượng Cytokinin và tăng lượng Auxine
để tạo điều kiện cho sự ra rễ của chồi cây. Người ta thường dùng các chất NAA
(Acid α- naphty axetic), IBA (Acid β - indol butyric), IAA (Acid β - indol acetic) ở
nồng độ 1mg/l - 5mg/l để tạo rễ cho hầu hết các loại cây trồng bằng phương pháp