BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI










NGUYỄN THỊ HUYỀN TRANG

NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG LÚA NẾP THƠM
KHÁNG BỆNH BẠC LÁ BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DAN

CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ : 60.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Nguyễn Văn Hùng cùng toàn bộ các
cán bộ ñang công tác tại bộ môn Công nghệ sinh học Ứng dụng - ðại học
Nông Nghiệp Hà Nội ñã giúp ñỡ và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi cho tôi
trong suốt thời gian thực hiện ñề tài.
Qua ñây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh chị và
bạn bè ñã giúp ñỡ, ñộng viên em trong suốt quá trình học tập cũng như thực
tập tốt nghiệp.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới toàn thể gia ñình
mình ñã luôn là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong suốt quá trình học tập và
nghiên cứu.
Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2013
Tác giả luận văn Nguyễn Thị Huyền Trang
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
iv

MỤC LỤC

LỜI CAM ðOAN
ii
LỜI CẢM ƠN
iii
MỤC LỤC
iv
DANH MỤC BẢNG
vi

2.2.2. Nghiên cứu về di truyền tính kháng bệnh
11
2.2.3. Các phương pháp chọn giống lúa kháng bệnh bạc lá
14
2.2.4. Ứng dụng công nghệ sinh học trong nghiên cứu và chọn giống kháng
bệnh bạc lá
15
2.3. Ứng dụng chỉ thị phân tử vào chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá
17
2.3.1. Giới thiệu về chỉ thị phân tử DNA
17
2.3.2. Một số nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử vào chọn tạo giống kháng
bệnh bạc lá lúa
20
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
v

2.3.3. Chỉ thị phân tử liên quan một số gen kháng bệnh bạc lá lúa
21
2.4. Các phương pháp chuyển gen kháng bệnh bạc lá vào giống
24
2.4.1. Phương pháp chuyển gen bằng súng bắn gen
24
2.4.2. Phương pháp lai hữu tính kết hợp với việc sử dụng chỉ thị phân tử
24
PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
26
3.1. Vật liệu, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu
26
3.1.1. Vật liệu nghiên cứu

PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ
57
5.1. Kết luận
57
5.2. ðề nghị
57
TÀI LIỆU THAM KHẢO
58
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
vi

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Bản ñồ liên kết di truyền giữa gen quy ñịnh tính trạng nông sinh học
quan trọng với RFLP ñánh dấu
21
Bảng 3.1. Các quần thể phân ly sử dụng trong nghiên cứu
26
Bảng 3.2. Thành phần dung dịch chiết tách
30
Bảng 3.3. Thành phần dung dịch TE
30
Bảng 3.4. Thành phần phản ứng PCR cho một gen Xa4, Xa7
31
Bảng 3.5. Các Primer dùng trong PCR
31
Bảng 3.6. Chu kỳ nhiệt cho gen Xa4, Xa7
31
Bảng 4.1. ðặc ñiểm nông sinh học của các dòng chọn lọc từ các tổ hợp
34


DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Ảnh ñiện di sản phẩm gen Xa7 các cá thể trong quần thể 12BC1F1
39
Hình 2: Ảnh ñiện di sản phẩm gen Xa7 sau khi tiến hành phản ứng PCR của tổ
hợp lai 21BC1F1 ((Khẩu Lếch x 10132 – 2) x Khẩu Lếch)
41
Hình 3: Ảnh ñiện di sản phẩm gen Xa4 sau khi tiến hành phản ứng PCR của tổ
hợp lai 154BC1F1 ((11000 x 10900) x 11000)
43
Hình 4: Ảnh ñiện di sản phẩm gen Xa7 sau khi tiến hành phản ứng PCR của tổ
hợp lai 154BC1F1 ((11000 x 10900) x 11000)
44
Hình 5: Ảnh ñiện di sản phẩm gen Xa4 sau khi tiến hành phản ứng PCR của tổ
hợp lai 63BC1F1 ((10883 x 10222) x 10883)
46
Hình 6: Ảnh ñiện di sản phẩm gen Xa7 sau khi tiến hành phản ứng PCR của tổ
hợp lai 63BC1F1 ((10883 x 10222) x 10883)
47
Hình 7: Ảnh ñiện di sản phẩm gen Xa7 sau khi tiến hành phản ứng PCR của tổ
hợp lai 62F2 (10165 x 10140 – 2)
53
Hình 8: Ảnh ñiện di sản phẩm gen Xa7 sau khi tiến hành phản ứng PCR của tổ
hợp lai 31F2 (10165 x 10140 – 2)
55

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
viii


Ứng dụng chỉ thị phân tử DNA nhằm chọn lọc những cá thể tốt trong
các quần thể phân ly chứa các gen kháng bệnh bạc lá hữu hiệu Xa4, Xa7
làm vật liệu cho công tác chọn tạo giống kháng bệnh có năng suất cao,
phẩm chất tốt là một việc làm vô cùng có ý nghĩa. Thí nghiệm ñược thực
hiện trên 6 quần thể phân ly 12BC1F1 ((NV4 x 10915) x NV4), 21BC1F1
((Khẩu Lếch x 10132 – 2) x Khẩu Lếch), 31F2 (10969 x 10900), 62F2
(10165 x 10140 – 2), 63BC1F1 ((10883 x 10222) x 10883), 154BC1F1
((11000 x 10900) x 11000).
Sau khi có kết quả theo dõi một số ñặc ñiểm nông sinh học, năng
suất, các yếu tố cấu thành năng suất và áp dụng phương pháp chọn lọc tăng
tiến trên 6 quần thể phân ly ñã chọn ñược 98 cây có năng suất cao, phẩm chất
tốt. Tiến hành chạy PCR các cá thể tốt ñã chọn ñược 59 cây mang gen kháng
ðHT trong ñó 38 cây mang gen kháng Xa7 , 21 cây mang 2 gen kháng
xa4/xa7. Các cá thể mang gen kháng ðHT là nguồn vật liệu quý giá trong
công tác chọn tạo giống kháng có năng suất cao, chất lượng tốt. Các cá thể
còn chứa gen DHT cần ñược tiếp tục chọn tạo trong các thế hệ phân ly.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
2

PHẦN I: MỞ ðẦU

1.1. ðặt vấn ñề
Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo)
gây ra là bệnh phổ biến và tàn phá lúa nghiêm trọng trên toàn thế giới (Khan,
1996), bệnh ñặc biệt nặng ở những nơi có mức ñộ thâm canh cao. Ở miền Bắc
nước ta, bệnh gây hại ở tất cả các vụ trong năm, nặng nhất vào vụ mùa, ñặc biệt
trên các giống lúa lai nhập nội từ Trung Quốc. Cho ñến nay, chưa có loại thuốc
hóa học nào ñặc trị bệnh bạc lá, việc tạo ra các giống lúa có khả năng kháng
bệnh bền vững ñược xem là hiệu quả nhất, cả về mặt kinh tế và môi trường.
Mỗi vùng trồng lúa lại có một số chủng vi khuẩn bạc lá ñặc trưng,

phẩm chất tốt. Chính vì vậy chúng tôi tiến hành ñề tài: “Nghiên cứu chọn tạo
giống lúa nếp thơm kháng bệnh bạc lá bằng chỉ thị phân tử DNA ”.
1.2. Mục ñích và yêu cầu
1.2.1. Mục ñích
Chọn lọc các cá thể giống lúa nếp có các ñặc tính nông sinh học tốt, năng
suất cao, chất lượng tốt và mang gen kháng bệnh bạc lá Xa4, Xa7 từ một số quần
thể phân ly F2 của một số tổ hợp lai phục vụ cho quá trình tạo giống lúa nếp
thơm kháng bệnh bạc lá bền vững.
1.2.2. Yêu cầu
Chọn ra những cá thể F2 có chứa gen kháng bệnh bạc lá, có năng suất
cao, phẩm chất tốt, mang các ñặc ñiểm nông sinh học tốt
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
4

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Tổng quan về bệnh bạc lá lúa
2.1.1. Nguyên nhân, triệu chứng và tác hại của bệnh
2.1.1.1. Nguyên nhân, triệu chứng
Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae. pv. oryzae (Xoo) gây
ra, ñược phát hiện ñầu tiên ở Fukuoka - Nhật Bản vào năm 1884.
Theo Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề (2004), bệnh bạc lá phát sinh
và phá hại trong suốt từ thời kỳ mạ ñến khi lúa chín, nhưng triệu chứng
bệnh thể hiện rõ nhất vào giai ñoạn từ sau ñẻ nhánh tới trỗ, chín sữa. Khi bị
bệnh, vết bệnh xuất hiện ở mép lá, mút lá, sau ñó lan dần vào phiến lá
theo ñường gợn sóng hoặc lan thẳng xuống gân chính. Trong ñiều kiện ẩm,
nhiệt ñộ tương ñối cao, hoặc buổi sáng sớm, trên vết bệnh có thể xuất hiện
giọt dịch vi khuẩn màu vàng, gặp trời nắng tạo thành dạng hạt keo vi khuẩn
màu hổ phách, hay màu mật ong. Thường thì giữa mô bệnh và mô khỏe có ranh
giới rõ ràng theo ñường gợn sóng, màu vàng hoặc khô vàng, có khi có một

3.770 ha, trong ñó diện tích nhiễm nặng là 560 ha. Tỷ lệ bệnh phổ biến là 8 –
20% số lá, nơi nhiễm nặng là 50 – 70% số lá.
2.1.2. Quy luật và các yếu tố ảnh hưởng ñến phát sinh, phát triển bệnh
2.1.2.1. Quy luật phát sinh, phát triển của bệnh
Mỗi vùng lãnh thổ lại có một số chủng vi khuẩn bạc lá ñặc trưng,
phụ thuộc vào cơ cấu các giống lúa và ñiều kiện tự nhiên của vùng:
Philipin 6 chủng, Nhật Bản 12 chủng, Ấn ðộ 9 chủng,… (Tika và cộng
sự, 1999). Ở Việt Nam, nhiều nghiên cứu trước ñó ñã xác ñịnh ñược 14
chủng vi khuẩn bạc lá lúa có mặt ở miền Bắc Việt Nam (trích dẫn theo
Pham Van Du và Le Cam Loan, 2007). Trong nghiên cứu về bệnh bạc lá
ở 15 tỉnh miền Bắc, Nguyễn Văn Viết và cộng sự (2005) ñã nhận thấy
các nhóm chủng Xoo thường xuất hiện ñan xen, ở một ñịa phương có thể
xuất hiện nhiều nhóm chủng, trái lại một nhóm chủng có thể hiện diện ở
nhiều ñịa phương, trên một vết bệnh ñôi khi có thể tồn tại một hoặc một
số chủng vi khuẩn nhất ñịnh.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
6

Ở miền Bắc nước ta, bệnh bạc lá có thể xuất hiện và gây hại ở tất
cả các vụ lúa, bệnh thường nặng hơn trong vụ lúa mùa. Vụ xuân bệnh
phát triển mạnh vào tháng 5 - 6, còn vụ mùa là tháng 8 - 9 khi có nhiều
mưa bão gây tổn thương cho lá lúa. Giai ñoạn mẫn cảm nhất của cây lúa
với bệnh là giai ñoạn làm ñòng ñến chín sữa (Vũ Triệu Mân và Lê Lương
Tề, 2001).
2.1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng ñến sự phát sinh, phát triển bệnh
Nguồn bệnh là từ hạt giống, tàn dư cây bệnh, ngoài ra, ñất, nước
cũng như dạng viên keo vi khuẩn trên lá cũng có ý nghĩa nhất ñịnh trong
việc lan truyền bệnh cho vụ sau (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 2004).
Các yếu tố ngoại cảnh: Nhiệt ñộ thích hợp nhất cho vi khuẩn sinh
trưởng là 26

sự phát triển của bệnh. Bao gồm các kỹ thuật: vệ sinh ñồng ruộng, diệt trừ cỏ
dại; xử lý hạt giống trước khi trồng; bón phân cân ñối, tăng cường bón phân hữu
cơ, bón ñạm sớm và tập chung ;…
Ưu ñiểm: dễ thực hiện, không gây ô nhiễm môi trường, thực hiện tốt còn
có tác dụng giảm thiểu các loại sâu bệnh hại khác.
Nhược ñiểm: tốn công lao ñộng, hiệu quả không cao.
2.1.3.2. Biện pháp hóa học
Dùng các loại thuốc hợp chất ñồng, chất kháng sinh Streptomycin hoặc
các chất như MBAMT, acid Oxolinic, Ningnamycin,… Các chất này có bản chất
kháng vi khuẩn gram âm, chỉ sử dụng khi bệnh phát triển mạnh và lan tràn
nhanh. Có thể kết hợp sử dụng các chất tăng ñề kháng của cây lúa với vi khuẩn
như acid Salicylic,…
Biện pháp này mang lại hiệu quả ñáng kể khi sử dụng ñúng lúc, tuy nhiên
ngoài nhược ñiểm gây tốn kém về mặt kinh tế ra thì hậu quả nghiêm trọng nhất
do sử dụng các hóa chất này là làm mất cân bằng sinh thái, ñặc biệt là mất cân
bằng về thành phần vi sinh vật ñất.
2.1.3.3. Biện pháp sinh học
Sử dụng vi sinh vật ñối kháng: Một số loài vi sinh vật có khả năng ñối kháng với
vi khuẩn Xoo ñã ñược tìm thấy như: Pseudomonas fluorescens và một số chủng
Bacillus ñược phân lập từ các mẫu ñất vùng rễ lúa có khả năng ức chế sự phát
triển của X. oryzae pv. oryzae trong phòng thí nghiệm (Gnanamanickam và cộng
sự, 1999), hay chủng Lysobacter APMus ñược phân lập từ rễ lúa của tỉnh
Yunnan, Trung Quốc, có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều loại nấm và vi
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
8

khuẩn gây bệnh thực vật, trong ñó có X. oryzae pv. oryzae (Ji và cộng sự, 2008).
ðây là một hướng ñi mới trong chiến lược phòng chống bệnh bạc lá hứa hẹn
mang lại hiệu quả cao. Tuy nhiên, biện pháp này chỉ mới ñược tiến hành nghiên
cứu và thử nghiệm trong những bước ñầu tiên mà chưa thực sự ñược ứng dụng

của các phynylalanine. Nghiên cứu về tính kháng ñạt ñược (acqured resistance,
induced resistance), Watanabe và cộng sự (1976), Watanabe và Nakanishi
(1976, 1977) thấy rằng khi lây nhiễm vi khuẩn vào kí chủ nếu không có sự
tương hợp giữa kí sinh và kí chủ thì kí chủ sẽ tiết ra các hợp chất chống lại vi
khuẩn. Các tác giả ñã xác ñịnh ñược các hợp chất kìm hãm chỉ trong 24 giờ ở
các giống kháng, trong khi ñó phải sau lây nhiễm 5 ngày các chất này mới ñược
xác ñịnh ở các giống nhiễm khi vết bệnh thể hiện rõ ràng. Gần ñây, những ngiên
cứu của Reimers và Leach (1991) nhận thấy rằng, trong phản ứng không tương
hợp giữa vi khuẩn gây bệnh và cây lúa thì chất kìm hãm sự phát triển của vi
khuẩn tương quan với chất tích luỹ ban ñầu của các hợp chất huỳnh quang và
phản ứng tự chết của tế bào kí chủ. Bên cạnh ñó, trong phản ứng không tương
hợp, các hợp chất cao phân tử như ligin ñược hình thành rất nhanh ở các giống
kháng nhưng lại không ñược hình thành ở các giống nhiễm. Sự tạo ra các hợp
chất kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn và các hợp chất cao phân tử có tương
quan với sự tăng lên khả năng hoạt ñộng của các hợp chất peroxidase ñược hình
thành trong bước cuối của quá trình sinh tổng hợp các enzym của lignin. Bởi vì,
vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae cư trú tại các mô bó mạch và không
xâm nhập trực tiếp vào tế bào kí chủ nên các hợp chất cao phân tử như lignin là
một rào cản vật lý ñể ngăn chặn sự lan rộng của vi khuẩn trong kí chủ. Ngoài ra,
các hoạt ñộng của peroxidase, các hợp chất phenolic ñược hình thành trong
quá trình sinh tổng hợp lignin cũng ñóng vai trò quan trọng trong quá trình
chống lại sự xâm nhập cũng như sự nhân lên của vi khuẩn Xanthomonas oryzae
pv. oryzae.
2.2.1.2. Cơ sở sinh học phân tử về tính kháng bền vững
Trong phản ứng với bệnh cây kí chủ biểu hiện mức ñộ khác nhau ñối với sự
xâm nhiễm của tác nhân gây bệnh. Hầu hết các ghi nhận về tính kháng của lúa ñối
với vi khuẩn bạc lá ít nhiều thay ñổi theo tính kháng ngang và tính kháng dọc.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
10


11

kháng bệnh của giống ñó. Trên thực tế tính kháng bệnh bền vững thường kết
hợp tính kháng không chuyên tính và có tính chất số lượng, nhưng sự hiểu biết
về mối quan hệ này chưa rõ ràng trên cơ sở sinh hoá học. Sự ra ñời của các
giống lúa kháng bệnh kéo theo sự xuất hiện các chủng vi khuẩn gây bệnh mới có
ñộc tính cao hơn, làm giảm tính bền vững của gen kháng. Do ñó, trong công tác
chọn tạo giống chống bệnh , người ta chú ý ñến việc tìm nguồn gen kháng
phong phú với mỗi chủng, mỗi nòi và mỗi vùng sinh thái khác nhau từ ñó tổ hợp
vào một giống ñể tăng tính kháng bền vững của giống. ðây là mục tiêu chiến
lược trong giai ñoạn hiện nay.
Tính kháng không hoàn toàn ñược do J.E Parlevliet ñịnh nghĩa ñầu tiên
năm 1979. Biểu hiện của tính kháng bệnh không hoàn toàn là sự sinh bào tử bị
giảm, mặc dù kí chủ nhiễm bệnh nhưng thời kì ủ bệnh kéo dài, thời kì nhiễm
bệnh của kí chủ ngắn ñi. Gần ñây, người ta gọi tính kháng không hoàn toàn là
tính kháng số lượng (quatitativeloci resistance – QR).
2.2.2. Nghiên cứu về di truyền tính kháng bệnh
Những nghiên cứu có tính chất hệ thống về gen kháng bệnh bạc lá ñược
thực hiện tại Nhật Bản vào ñầu thập kỷ 60. Năm 1961, những nghiên cứu ñầu
tiên về di truyền khả năng kháng bệnh bạc lá ñã ñược Nishimura tiến hành.
Trong khi nghiên cứu về sự luân chuyển các giống lúa trồng ở Nhật Bản, ông ñã
phát hiện ra khả năng kháng bệnh bạc lá ở hai giống lúa trồng Kogyoku và
Kaganeman ñược ñiều khiển bởi một gen trội nằm trên NST số 11 (theo hệ
thống thứ tự NST của ông). Vào thập kỷ 60 của thế kỷ trước, cùng với việc phổ
biến các giống lúa bán lùn và năng suất cao vào sản xuất, bệnh bạc lá phát triển
ngày càng rộng. Nhận thấy thực tế này, IRRI ñã tiến hành ñánh giá khả năng
kháng bệnh của các giống lúa nhiệt ñới, ñồng thời tiến hành nghiên cứu về bản
chất di truyền khả năng kháng bệnh bạc lá (Tsugufumi Ogawa,1997). Cho ñến
những năm 80 của thế kỷ XX, viện nghiên cứu lúa quốc tế ñã xác ñịnh bản chất
di truyền tính chống bệnh là do gen qui ñịnh (Mew, 1987).

(sequence tagged site) Xa21 là gen lần ñầu tiên ñược clone hoá từ loài lúa dại O.
Longistaminata. Nó mã hoá kinase ñóng vai trò như receptor gồm nhiều phân tử
lặp giàu leucine (LRR) ở vùng ngoại bào và mã hoá kinase có serine hoặc
threonine ở vùng nội bào. Phân tích chuỗi mã di truyền bảy thành viên của họ
gen này tại locus Xa21 cho thấy hiện tượng lặp ñoạn, tái tổ hợp, chuyển vị ñều
xuất hiện trong suốt quá trình tiến hoá họ gen này (Wang và ctv, 2001). Gen Xa-
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
13

21 có phổ kháng rộng ñối với nhiều nòi vi khuẩn Xoo, gen này ñược phát hiện
trong quần thể lúa hoang dại ở Châu Phi (O. longistaminata – Khush và ctv,
1990) nằm trên NST số 11 liên kết với chỉ thị pTA818 và pTA248 với khoảng
cách di truyền 0-1 cM (Ronal et al, 1992). Việc xác ñịnh chính xác các gen
kháng, NST chứa gen kháng và vị trí sắp xếp của các gen ñó trên NST ñã phục
vụ ñắc lực trong công tác chọn tạo giống kháng bệnh.
Di truyền tính kháng bệnh bạc lá tuân theo thuyết “gen ñối gen” (gene for
gene) của Flor, ông ñã viết: “ ðối với mỗi gen qui ñịnh tính kháng trong cây kí
chủ có một gen tương ứng qui ñịnh tính gây bệnh trong kí sinh”. Nói cách khác,
gen kháng trong kí chủ chỉ hoạt ñộng nếu kí sinh mang alen không gây bệnh.
Luôn tồn tại mối tương tác giữa Xoo và cây lúa, biểu hiện kháng ñược chi phối
bởi tương tác giữa một gen kháng ñơn, trội (R genes) ở cây lúa và gen của tác
nhân gây bệnh tương ứng ñược gọi là avirulence (avr) genes (Mew 1987, Leach
và White 1995). Do mỗi vùng ñịa lý khác nhau tồn tại những nòi sinh lý khác
nhau nên có những giống kháng bệnh rất hiệu quả ở vùng này nhưng lại nhiễm
bệnh nặng ở vùng khác. Vì vậy, ñể chọn tạo giống chống bệnh phù hợp với từng
vùng sinh thái khác nhau cần xác ñịnh ñược nòi sinh lý, khu vực phân bố và khả
năng kháng của gen ñối với nòi ñó. Viện nghiên cứu lúa quốc tế (IRRI) ñã tạo ra
các dòng ñẳng gen chứa các gen kháng bệnh bạc lá khác nhau trên thế giới bằng
phương pháp lai giữa giống IR24 và giống chứa gen kháng bệnh bạc lá khác
nhau. Từ ñó tạo ra các dòng, có nền gen chung của IR24, chỉ khác nhau ở một

Phương pháp chọn giống kháng bệnh bạc lá phổ biến và quan trọng nhất
cho ñến nay là phương pháp lai hữu tính. Phương pháp này tiến hành lai giữa
các giống có chứa gen kháng, sau ñó chọn lọc các thế hệ phân li. Bằng phương
pháp này nhiều giống kháng bệnh ñã ñược tạo ra. Khả năng kháng bạc lá
thường do ñơn gen quy ñịnh, vì vậy việc sử dụng phương pháp lai lại ñể
chuyển gen kháng là rất hiệu quả. Nguyên lý của phương pháp này là sử dụng
một giống lúa tốt nhưng không mang gen kháng cần thiết ñể lai lại với một
giống mang gen kháng hữu hiệu. Sau một số lần chọn lọc và lai lại liên tục,
giống mới ñược tạo thành gần như mang toàn bộ nguồn gen tốt của cây lai lại
và mang thêm ñược gen kháng mong muốn. Trong quá trình lai lại, có thể kết
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
15

hợp với tự phối, chọn lọc các dạng phân ly ñể ñẩy nhanh quá trình tạo dòng
thuần. Ở phương pháp này bắt buộc nhà chọn giống phải sử phương pháp lây
nhiễm nhân tạo ñể xác ñịnh con lai có mang gen kháng hay không. Nhưng
bằng phương pháp này ñôi khi khó phân biệt ñược các gen kháng khác nhau,
nếu chúng cùng biểu hiện một phổ kháng nhiễm với các chủng vi khuẩn tương
tự. Hoặc nếu gen kháng là gen trội, bằng lây nhiễm nhân tạo ta có thể chọn
ñược cả 2 dạng, dạng ñồng hợp tử trội và dạng dị hợp tử, cả 2 dạng này ñều
biểu hiện kiểu hình như nhau, rất khó ñể phân biệt. ðể khắc phục nhược ñiểm
này, hiện nay phương pháp dùng chỉ thị phân tử, dựa trên các trình tự DNA
liên kết chặt với gen kháng, ñược sử dụng nhằm xác ñịnh các gen kháng dễ
dàng và có thể phân biệt ñược các trạng thái alen khác nhau.
Ngoài phương pháp chuyển gen kháng bệnh bạc lá bằng lai hữu tính, hiện
nay còn có các nghiên cứu nhằm chuyển gen kháng bằng phương pháp cứu phôi
và lai tế bào trần. Bằng phương pháp cứu phôi, Amide-Border và cộng sự (1992)
ñã chuyển gen kháng từ lúa dại vào lúa trồng (K.S.Lee và cộng sự). Bằng
cách lai tế bào trần giữa lúa trồng Oryzae sativa L. với nguồn cho gen kháng là
lúa dại Oryzae meyeriana, Cheng-qui Yan và cộng sự tiến hành thành công việc

93,3% (Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2004). Bùi Chí Bửu và Cộng sự cũng
ñã sử dụng chỉ thị phân tử ñể kiểm tra tổ hợp BC4F4 của IR24 với giống lúa ñịa
phương mang gen kháng Xa4, xa5, Xa13 với ñộ chính xác cao.
Trong các năm 2000-2005, Phan Hữu Tôn và cộng sự tiến hành việc tìm
kiếm nguồn gen kháng từ các giống lúa ñịa phương bằng cả hai phương pháp lây
nhiễm nhân tạo và PCR. Năm 2000, theo kết quả nghiên cứu ñã công bố của
Phan Hữu Tôn thì trên cơ sở ñiều tra 145 giống lúa ñịa phương ñã phát hiện
ñược 12 giống chứa gen xa5 và 2 giống chứa gen Xa7. Năm 2004, trên cơ sở
tiếp tục ñiều tra 120 giống ñịa phương, Phan Hữu Tôn và cộng sự phát hiện
ñược thêm 8 giống lúa ñịa phương chứa gen xa5. Các kết quả nghiên cứu trên
ñều nhằm mục ñích phục vụ cho chiến lược chọn tạo giống lúa chống bệnh bạc
lá ở miền Bắc Việt Nam.
ðến nay, bước ñầu có thể khẳng ñịnh các gen Xa3, Xa4, xa5, Xa7, Xa10,
xa13, Xa14 là các gen kháng thường có mặt trên các giống lúa ñịa phương ở
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
17

Việt Nam. Các gen kháng Xa4, xa5, Xa7, Xa21 là các gen có ý nghĩa quan trọng
trong việc chọn tạo giống lúa kháng bệnh, bởi chúng có khả năng kháng ñược
hầu hết các chủng vi khuẩn phổ biến ở nước ta. Nhưng trong số các gen kháng
hữu hiệu, tại miền Bắc thì gen Xa7 có khả năng xuất hiện nhiều hơn xa5. Hiện
chưa có nghiên cứu nào công bố việc phát hiện ñược gen Xa21 trên các giống
lúa trồng. Việc sử dụng kỹ thuật PCR xác ñịnh gen kháng và vi khuẩn bạc lá
trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh cho kết quả rất khả quan.
2.3. Ứng dụng chỉ thị phân tử vào chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá
2.3.1. Giới thiệu về chỉ thị phân tử DNA
Bất kỳ ñoạn DNA nào ñược sử dụng ñể phân biệt sự khác nhau về kiểu
hình (tính trạng) giữa các cá thể, dòng, giống và giữa các loài ñều ñược gọi là chỉ
thị phân tử DNA ñánh dấu gen (Phan Hữu Tôn, 2005). Hiện nay chỉ thị phân tử
DNA ñược sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu di truyền và chọn giống.