TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC





ĐỀ CƯƠNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
“ Khảo sát đánh giá nguồn gen lúa nếp
(gen thơm, waxy và kháng bệnh bạc lá)
bằng chỉ thị phân tử ”
G.V hướng dẫn : ThS. Nguyễn Quốc Trung
Bộ môn CNSH ứng dụng
Khoa CNSH -
Trường ĐHNN HN
Sinh viên thực hiện : Đoàn Thị Hoa
Mã sinh viên : 533265
Lớp : CNSHA-K53
HÀ NỘI – 2012
I. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Lúa nếp là một trong những nhóm lúa đặc sản lâu đời của nhân dân Việt
Nam và được sử dụng vào nhiều mục đích khác nhau như: nấu xôi, làm các loại
bánh trưng, bánh dày, bánh dẻo, làm đồ uống như rượu và nhiều loại đồ ăn khác,
đó là những thứ không thể thiếu trong các dịp lễ, tết. Lúa nếp đã góp phần làm
nên hương vị độc đáo, giàu tính nhân văn của văn hóa ẩm thực Việt Nam. Lúa
nếp chiếm khoảng 10 % diện tích sản xuất lúa và khoảng 10% lượng gạo được
tiêu dùng của người Việt Nam.
Nếp có giá thành cao, tuy nhiên các dòng lúa nếp Việt Nam khá nghèo

địa phương.
- Đánh giá một số đặc điểm nông sinh học chính, năng suất, chất lượng và
khả năng kháng bệnh bạc lá của các dòng/giống lúa nếp địa phương.
3
II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tình hình chọn tạo giống lúa nếp chất lượng
2.1.1 Tình hình chọn tạo giống lúa nếp chất lượng trên thế giới
2.1.2 Tình hình chọn tạo giống lúa nếp chất lượng ở Việt Nam
2.2 Chỉ thị phân tử
2.3 Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị gen mùi thơm
2.4 Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị gen waxy
2.5 Nghiên cứu về bệnh bạc lá trên lúa nếp
2.5.1 Nguyên nhân gây bệnh
2.5.2 Triệu chứng
2.5.3 Tác hại của bệnh bạc lá lúa
2.5.4 Cơ sở khoa học của chọn giống kháng bạc lá
4
III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa điểm: Khu ruộng thí nghiệm và phòng thí nghiệm phòng sinh học
phân tử và công nghệ sinh học ứng dụng, khoa CNSH, trường ĐH Nông Nghiệp
Hà Nội.
- Thời gian nghiên cứu: từ 01/2012 đến 07/2012.
3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Vật liệu
- 50 giống lúa nếp địa phương và giống đối chứng là TK90
- Các isolate vi khuẩn bạc lá được phân lập và bảo quản tại phòng thí
nghiệm bộ môn Công nghệ Sinh học Ứng dụng trường ĐHNN Hà Nội.
3.2.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.2.1 Thí nghiệm đồng ruộng

(tạ /ha).
Trong đó:
A: số bông hữu hiệu/ khóm.
B: Số hạt chắc/ bông chính.
C: Khối lượng 1000 hạt.
D: Mật độ cấy (số khóm/m
2
).
Với mỗi giai đoạn quan sát, tiến hành lập bảng.
c. Đánh giá cảm quan mùi thơm
Theo Sood và Siddiq (1978), mùi thơm được đánh giá cảm quan như sau:
Mùi thơm trên lá: Thu 10 lá của mỗi mẫu giống ở giai đoạn lúa đẻ nhánh
rộ. Lấy 1g lá, cắt thành những đoạn dài 5 mm, bỏ vào ống nghiệm, ngâm với
5ml dung dịch KOH 1,7%, đậy nắp lại và để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
Mức độ thơm được chấm điểm bởi 5 người cho theo 3 mức rồi lấy trung bình.
Điểm 1: không thơm Điểm 2: hơi thơm Điểm 3: thơm
Mùi thơm của gạo: Lấy 10 hạt của mỗi giống, vừa mới thu hoạch, bóc vỏ,
làm trắng rồi nghiền nhỏ. Bột gạo của mỗi giống được cho vào một ống chứa
500µl KOH 1,7%, đậy nắp và để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Đánh giá mùi
thơm cũng bằng phương pháp ngửi của 5 người rồi cho điểm như trên.
d. Đánh giá hàm lượng amylose, độ dẻo của cơm các giống lúa
6
* Nhiệt hoá hồ
Lấy 6 hạt gạo đã xát trắng, không có vết nứt, gãy, sắp vào đĩa petri. Cho
vào mỗi đĩa 10 ml dung dịch KOH 1.7%, đậy nắp và để trong 23 giờ ở nhiệt độ
30
o
C. Nhiệt trở hồ được xác định bằng mức lan rộng và độ trong suốt của gạo
sau khi xử lý (theo phương pháp của Little và cs). Đánh giá nhiệt hoá hồ và độ
phân huỷ theo thang điểm IRRI.(1996)

+Ca
2
(NO
3
)
2
.4H
2
O: 0.5g
+ Nước cất: 100ml, pH= 6.8-7.0
Môi trường Wakimoto được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121
0
C trong ống
nghiệm thời gian 20 phút, tạo mặt phẳng nghiêng.
7
Trước khi lây nhiễm nguồn vi khuẩn được cấy bảo quản trong môi trường
sữa ở -30
0
C, được cấy truyền sang môi trường Wakimoto ở 28
0
C sau 48-72h,
sau đó pha loãng dung dịch vi khuẩn bằng nước cất vô trùng đạt được nồng độ
10
8
CPU/ml để gây bệnh.
* Phương pháp lây nhiễm
Lây nhiễm theo phương pháp cắt đầu lá: dùng kéo đã khử trùng nhúng
vào dung dịch chứa vi khuẩn gây bệnh bạc lá ( mỗi chủng vi khuẩn dùng một
kéo vô trùng) cắt lên đầu lá lúa một đoạn dài khoảng 2-5 cm và lây nhiễm vào
giai đoạn lúa làm đòng-trỗ, mỗi chủng một cây, trên một cây cắt toàn bộ các lá

13000 vòng/ phút. Đổ phần dung dịch phía trên, giữ lại phần kết tủa dưới đáy
ống nghiệm.
+ Bước 9: rửa kết tủa bằng ethanol 70%, làm khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng
bằng cách úp ngược ống nghiệm lên giấy thấm.
+ Bước 10: hoà tan kết tủa bằng 50µl dung dịch TE rồi bảo quản ở nhiệt độ
-20
0
C hoặc 4
0
C.
Bảng 3.1 Thành phần dung dịch chiết tách
Thành phần Nồng độ dd mẹ Nồng độ dd
làm việc
Hỗn hợp 50ml dd
chiết tách
Tris-HCl pH=8 1M 50mM 2.5ml
EDTA pH=8 0.5M 0.25mM 2.5ml
NaCl 5M 300mM 3.0ml
SDS 10% 1% 5.0ml
H
2
O 37.0ml
Bảng 3.2 Thành phần dung dịch TE
Thành phần Nồng độ dd mẹ Nồng độ dd làm việc Thể tích 50ml
Tris-HCl 1M 10Mm 0.5ml
EDTA 0.5M 1Mm 0.1ml
H
2
O 49.9ml
b. Tiến hành nhân PCR

3 55 1 phút
4 72 1 phút
5 Lặp lại 35 lần từ bước 2
6 72 7 phút
7 4
*Gen kháng bạc lá Xa4 xa5, Xa7
10
Quy trình PCR xác định gen kháng bệnh bạc lá do GS.TS.S. Taura và
cộng sự đề xuất.
Thành phần nhân PCR:
Bảng 3.Thành phần phản ứng PCR cho một gen Xa4, xa5, Xa7
Thành phần Nồng độ gốc Thể tích cần lấy(µl)
H
2
O 13,3
PCR buffer (có chứa Mg
2+
) 10X 2,0
dNTP 2,5mM 1,6
Primer Forward 10 pmol/µl 1,0
Primer Reverse 10 pmol/µl 1,0
DNA taq polymerase 5unit/µl 0,1
Tổng thể tích cocktail 19,0
DNA mẫu 1 µl 1,0
Tổng thể tích 20 L
Nếu PCR không chứa Mg
2+
thì phải bổ sung thêm Mg ở nồng độ cuối
cùng bằng 0.5- 1.5 mM
Các Primer dùng trong PCR:

C) Thời gian
1 94 4 phút
2 94 1 phút
3 56 1 phút
4 72 2 phút
5 Lặp lại 34 lần từ bước 2
6 72 8 phút
7 4
Bảng: Chu kỳ nhiệt cho gen xa5
Bước Nhiệt độ (
0
C) Thời gian
1 94 4 phút
2 94 1 phút
3 60 1 phút
4 72 1 phút 50 giây
5 Lặp lại 34 lần từ bước 2
6 72 7 phút
7 4
c. Chạy điện di
- Chuẩn bị gel chạy điện di: cân 1.5g agarose cho vào 50ml dung dịch
TAE và 50ml nước cất đem đun sôi trong lò vi sóng, sau đó lấy đem ra khuấy từ
từ cho tới khi dung dịch trong suốt.
- Đổ dung dịch agarose 1.5% vào khuôn gel cho tới khi đông đặc thì rút
lược ra. Đổ đầy dung dịch TAE vào bể điện di sao cho ngập giếng.
- Trải một màng parafin, nhỏ 1 µl loading dye, trộn với 8 µl dung dịch
PCR, sau đó trộn đều và nhỏ hỗn hợp vào giếng. Nhỏ theo thứ tự của các giống
DNA của các giống đã được đánh số.
- Cắm nguồn điện một chiều (75V) chạy điện di trong khoảng 25 đến 50
phút. DNA mang điện tích âm sẽ chạy về cực dương của nguồn điện.

15