LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng:
Đây là công trình nghiên cứu khoa học do tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa
học của PGS. TS. Phan Hữu Tôn.
Số liệu và kết quả nghiên cứu trình bày trong luận văn là khách quan, trung
thực và chưa từng được sử dụng để bảo vệ bất kỳ một công trình nào.
Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông
tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày tháng năm 2014
Sinh viên
Nguyễn Xuân Trường
i
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận này, em chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô trong khoa
Công nghệ sinh học, Trường Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội đã tận tình truyền đạt kiến
thức trong bốn năm học tập. Với vốn kiến thức được tiếp thu trong quá trình học
không chỉ là nền tảng cho quá trình nghiên cứu khóa luận mà còn là hành trang quí báu
để em bước vào đời.
Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy PGS.TS Phan Hữu Tôn-Trưởng bộ
môn SHPT & CNSH Ứng dụng -khoa Công nghệ sinh học- trường Đại học Nông
Nghiệp Hà Nội, đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện để em hoàn thành đề tài này.
Em xin cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình, hướng dẫn chỉ bảo của Ths. Nguyễn Văn
Hùng, cùng các anh chị làm việc tại Trung tâm bảo tồn và Phát triển nguồn gen cây
trồng đã tạo điều kiện thuận lợi nhất để em hoàn thành quá trình thực tập này.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người luôn bên
cạnh động viên, quan tâm giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài
này.
Mặc dù đã có nhiều cố gắng, nhưng do thời gian có hạn, trình độ kĩ năng của
bản thân còn nhiều hạn chế nên bài báo cáo không tránh khỏi những thiếu sót. Em kính
mong nhận được sự góp ý, nhận xét từ phía quý thầy, cô để kiến thức của em được
hoàn thiện hơn.
2.5.3. Chỉ thị isozyme 11
2.5.4. Chỉ thị phân tử - chỉ thị DNA( Phan Hữu Tôn, 2005) 11
PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
3.1. Vật liệu nghiên cứu 14
iii
3.2. Phương pháp nghiên cứu 15
3.2.1. Bố trí thí nghiệm đồng ruộng 15
3.2.2. Kỹ thuật trồng và chăm sóc 15
3.2.3. Phương pháp đánh giá một số đặc điểm nông sinh học cơ bản 16
3.2.4. Phương pháp đánh giá mùi thơm 17
3.2.5. Phương pháp đánh giá khả năng kháng nhiễm bệnh bạc lá bằng lây
nhiễm nhân tạo 17
3.3.Phương pháp xác định gen kháng bệnh bạc lá Xa4, Xa7 bằng chỉ thị phân
tử 17
3.3.1. Phương pháp tách chiết DNA 17
3.3.2. Kiểm tra khả năng mang gen kháng Xa4, Xa7 bằng PCR 18
3.4. Phương pháp xử lý số liệu 19
PHẦN IV.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 20
4.1. Kết quả đánh giá các tính trạng nông sinh học 20
4.1.1. Một số chỉ tiêu sinh trưởng 20
4.1.2. Khả năng đẻ nhánh, tỉ lệ nhánh hữu hiệu 23
4.1.3. Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất 25
4.1.4. Kết quả đánh giá mùi thơm 28
4.2. Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá 30
4.2.1. Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá bằng phương pháp lây nhiễm
nhân tạo 30
4.2.2. Kiểm tra gen kháng bệnh bạc lá bằng PCR 33
4.2.3. So sánh kết quả PCR với kết quả lây nhiễm nhân tạo 35
4.3. Đánh giá đa dạng di truyền bằng các chỉ thị phân tử SSR 37
4.3.1. Phân tích đa hình DNA của 25 giống lúa nếp bằng kỹ thuật PCR 37
Hình 4.4. Kết quả lây nhiễm nhân tạo trên đối chứng IRBB7 32
Hình 4.5. Kết quả điện di đồ gen Xa4 với cặp mồi MP2 33
Hình 4.6. Kết quả điện di đồ gen Xa7 với cặp mồi P3 34
Hình 4.7. Kết quả điện di đồ PCR của mồi RM-154 39
Hình 4.8. Kết quả điện di đồ PCR của mồi RM-536 40
Hình 4.9. Biểu đồ hình cây của 25 giống lúa nếp tính hệ số di truyền theo Dice
44
và kiểu phân nhóm UPGMA 44
vii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU
AFLP Amplified Fragment Lenght Polymorphism
RAPD Random amplified polymorphic DNA
RFLP Restriction fragment length polymorphism
SSR Simple Sequence Repeat
DNA Acid Deoxyribo Nucleic
PCR – based marker Polymerase Chain Reaction– based marker
ALP Amplicon length polymorphism
DAF DNA amplification fingerpringting
SSCP Single strand conformation polymorphism
AP-PCR Arbitrary Primer – PCR
NST Nhiễm sắc thể
NSLT Năng suất lý thuyết
CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide
EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic
STT Số thứ tự
KH Ký hiệu
TGST Thời gian sinh trưởng
viii
TÓM TẮT
Hiện nay ở Việt Nam, lúa nếp chưa có nhiều có giống mới, chủ yếu là các
Nguồn gen càng phong phú đa dạng bao nhiêu thì khả năng chọn tạo ra giống càng
thành công bấy nhiêu. Để khảo sát các giống lúa nếp có chứa gen kháng bạc lá hay gen
mùi thơm bằng phương pháp truyền thống thì tốn nhiều thời gian, phụ thuộc vào điều
kiện môi trường, hiệu quả chưa cao mà đôi khi còn dễ nhầm lẫn.
Hiện nay, trong công tác lai tạo giống lúa mới, các nhà chọn giống thường
ghép cặp ngẫu nhiên giữa các giống khác nhau, điều này dẫn đến nhiều cặp lai không
cho ưu thế lai cao, do chúng có khoảng cách di truyền rất gần nhau. Ngày nay, phát
triển của các chỉ thị phân tử như AFLP, RAPD, RFLP, SSR đã trợ giúp cho việc xác
định khoảng cách di truyền giữa các mẫu giống nhanh chóng. Để từ đó lựa chọn cặp
lai cho ưu thế lai cao. Trong số các chỉ thị DNA thì chỉ thị SSR được sử dụng rộng rãi
và hiệu quả nhất trong nghiên cứu cấu trúc di truyền lúa trồng O.sativa. Hiện nay, đã
có hơn 15.000 chỉ thị SSR đã được thiết lập, phủ kín trên bản đồ liên kết di truyền của
lúa( Giarrocco và cộng sự, 2007). Trong nghiên cứu này, sau khi tiến hành khảo sát
các mẫu giống chúng tôi sử dụng các chỉ thị SSR nghiên cứu đa dạng di truyền các
mẫu giống cho năng suất cao, chất lượng tốt, thơm, có chứa gen kháng bệnh bạc lá. Từ
đó chọn cặp lai giữa các mẫu giống để lai tạo giống lúa nếp mới.
1
1.2. Mục đích và yêu cầu của đề tài
1.2.1. Mục đích
- Phát hiện được các mẫu giống lúa nếp năng suất cao, chất lượng tốt, chứa gen
thơm, gen kháng bạc lá để làm vật liệu lai tạo giống lúa nếp mới.
- Xác định mối quan hệ di truyền giữa các mẫu giống thơm, chứa gen kháng
bệnh bạc lá từ đó ghép cặp lai cho ưu thế lai cao.
1.2.2. Yêu cầu
- Khảo sát các đặc tính nông sinh học, đánh giá mùi thơm các giống lúa nếp.
- Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo.
- Xác định sự có mặt của các gen kháng bạc lá Xa4, Xa7 ở các giống lúa nếp.
- Đánh giá đa dạng di truyền của các giống lúa nếp.
2
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
gió mà truyền lan tới các lá, các cây khác để tiến hành lây nhiễm lặp lại trong nhiều
đợt sinh trưởng. Cho nên tuy là một loại bệnh có cự ly truyền nhiễm lây lan hẹp, song
nó còn tùy thuộc vào mưa gió, giông bão xảy ra trong vụ mùa mà bệnh có thể truyền
lan với phạm vi không gian khá rộng, giọt keo vi khuẩn với số lượng nhiều, đó chính
là một nguyên nhân quan trọng làm bệnh phát triển mạnh sau những đợt mưa gió vào
cuối vụ lúa xuân và trong suốt vụ mùa ở nước ta.
2.1.2. Triệu chứng của bệnh bạc lá lúa
Năm 1960, Goto đã chỉ ra rằng: vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv.oryzae gây
ra ba triệu chứng điển hình của bệnh bạc lá lúa ở nhiệt đới: bạc lá, héo xanh (Kresek
hay Wilt) và vàng nhợt (Goto, 1960).Những nghiên cứu trong nhà lưới chứng tỏ: hiện
tượng héo và bạc lá khác nhau một cách rõ ràng và độc lập. Héo và bạc lá những triệu
chứng do ảnh hưởng ban đầu của sự nhiễm bệnh, triệu chứng vàng nhợt là ảnh hưởng
sau (Mew, 1987).
3
Theo Lê Lương Tề (1980) thì ở Việt Nam, bệnh bạc lá lúa phát sinh phá hại
suốt từ thời kỳ mạ đến chín nhưng có triệu chứng điển hình là ở thời kỳ lúa cây trên
ruộng từ sau đẻ - trỗ, chín sữa.
Trên mạ, triệu chứng thể hiện không đặc trưng như ở trên lúa, do đó cũng dễ
nhầm lẫn với các triệu chứng khác. Chủ yếu vi khuẩn hại mạ gây ra triệu chứng ở mút
lá hoặc mép lá mạ những vết dài ngắn khác nhau màu xanh vàng rồi nâu bạc, lá dễ bị
khô.
Trên lá lúa, triệu chứng bệnh thể hiện rõ hơn, tuy có thể biến đổi ít nhiều tuỳ
theo giống lúa và điều kiện bên ngoài nhưng nói chung vết bệnh có những đặc điểm
điển hình sau đây:
- Vết bệnh ở mép lá, mút lá lan dần vào phiến lá hoặc lan thẳng xuống gân
chính, ở một số trường hợp vết bệnh có khi bắt đầu ở ngay giữa phiến lá.
- Vết bệnh lan rộng theo đường gợn sóng hoặc thẳng, mô bệnh xanh tái, vàng
lục, cuối cùng cháy khô có màu nâu xám.
- Thông thường ranh giới giữa mô bệnh với mô khỏe trên phiến lá rất rõ rệt, có
giới hạn theo đường gợn sóng vàng hoặc không vàng, có khi chỉ một đường viền màu
Gạo nếp rất quan trọng trong đời sống của người dân Việt Nam, đặc biệt trong
những ngày lễ tết và các đám hiếu hỷ. Chúng được sử dụng để làm các loại bánh
truyền thống như bánh trưng, bánh dầy, bánh cốm, một số nơi nông dân còn dùng để
nấu các loại rượu ngon như rượu nếp cái, rượu nếp cẩm. Một số tỉnh lúa nếp được coi
là giống cây đặc sản như nếp cái hoa vàng ở Bắc Ninh, Nam Đinh và ở Miên Nam lúa
nếp cũng là một mặt hàng xuất khẩu đem lại lợi nhuận kinh tế cao. Tuy nhiên, công
tác chọn tạo giống lúa nếp chưa được quan tâm nhiều như các giống lúa tẻ. So với lúa
tẻ thì lúa nếp hiện có bộ giống còn khá nghèo nàn, có thể điểm ra một số giống đang
được trồng, tác giả chọn tạo và ưu nhược điểm của chúng.
Giống nếp 415 do viện Khoa học kỹ thuật Việt Nam chọn tạo từ tổ hợp lai
VN72 lai với một dòng lúa Japonica. Giống này thấp cây (90 – 100 cm), cảm ôn,
ngắn ngày cấy được cả 2 vụ trong năm, nhưng năng suất rất thấp, trung bình chỉ đạt 35
– 40 tạ/ha, cơm có dẻo nhưng không thơm. Nhiều giống lúa nếp đặc biệt là các giống
nếp địa phương (nếp cẩm, nếp cái hoa vàng…) bị nhiễm bệnh bạc lá, đạo ôn và rầy
nâu khá nặng, hiện vẫn được trồng ở một số nơi thuộc đồng bằng Bắc bộ. Giống nếp
D21, do Viện Di truyền Nông nghiệp lai tạo từ tổ hợp lai ĐV2 (nếp cái hoa vàng đột
5
biến) với nếp 412, được khu vực hóa từ năm 1998. Giống này cũng thấp cây, cảm ôn,
xôi dẻo và thơm nhưng năng suất cũng rất thấp chỉ đạt 30 – 35 tạ/ha, đặc biệt có thời
gian sinh trưởng quá dài vụ xuân tới 170 – 175 ngày, vụ mùa 135 – 140 ngày, nên hiện
không được nông dân ưa chuộng. Giống nếp cái hoa vàng, được trồng khá lâu năm ở
các tỉnh vùng đồng bằng sông Hồng, là giống cảm quang nên chỉ trồng được vụ mùa,
khá cứng cây, có chất lượng gạo tốt, xôi dẻo, thơm, cơm bóng, hạt to trung bình
26g/1000 hạt, nhưng năng suất thấp chỉ đạt 35 – 40 tạ/ha và chống chịu rầy nâu kém.
Giống này hiện một số nơi như Bắc Ninh, Bắc Giang… đang trồng như một giống lúa
đặc sản vì có chất lượng cao, giá bán đắt trên thị trường.
Giống nếp IRI 352 là giống nhập nội, được công nhận năm 1990, thấp cây (85 –
90 cm), là giống cảm ôn, thích ứng rộng, dạng hình khá đẹp. Giống có khả năng
chống chịu với rầy nâu tốt, chống đổ tốt, năng suất khá đạt 40 – 45 tạ/ha, xôi dẻo
nhưng không thơm. Hiện giống này đang được trồng khá phổ biến ở đồng bằng trung
hiện (Lee, 1986).
Cùng với việc xác định các gen kiểm tra tính chống bệnh, thì việc xác định NST
và vị trí sắp xếp của các gen đó trên nhiễm sắc thể phục vụ đắc lực cho công tác chọn
tạo giống chống bệnh. Áp dụng chỉ thị phân tử DNA (RFLP, RADP, STS, AFLP ) có
thể xác định vị trí từng gen trên NST thông qua đoạn DNA dò đặc hiệu liên kết với gen
đó với khoảng cách gen nhất định, các kết quả cho thấy vị trí của một số gen như sau:
gen Xa4 nằm trên NST số 11, liên kết với chỉ thị Npb181 với khoảng cách di truyền là
1,7 cM, liên kết với chỉ thị Npb78 với khoảng cách di truyền là 1,7cM (Yoshmura và cs,
1992) gen xa5 nằm trên NST số 5 liên kết với RG556 (0-1 cM)(Mclouch và cs,1991),
Xa13 nằm trên NST số 8 liên kết với đoạn Z28 (5,1 cM)(Zang và cs,1994), Xa21 nằm
trên NST số 11 liên kết vói pTA818, pTA248 (0-1cM)(Ronald và cs,1992), Xa14 nằm
trên NST số 4, gen Xa1 và Xa2 cũng trên NST số 4;Xa3 và Xa4 cùng nằm trên NST số
11; gen Xa7 liên kết với xa5 trên NST số 5-dẫn theo Phan Hữu Tôn, 2005. Tuy nhiên,
việc áp dụng phương pháp RFLP, RADP thường mất nhiều thời gian, lượng DNA cần
tinh khiết, nhiều khi phải dùng đến phóng xạ nên khó áp dụng rộng rãi. Để khắc phục
được nhược điểm này người ta đề xuất chuyển sang phương pháp chọn lọc gián tiếp trên
cơ sở nhân DNA bằng kĩ thuật PCR, sau đó chạy điện di rồi xác định sự đa hình giữa
kiểu gen kháng, nhiễm.
Tại Việt Nam, chỉ thị phân tử đã được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu bệnh
bạc lá và chọn tạo giống lúa kháng bệnh ở các trung tâm chọn giống.
7
Từ năm 1997-2004, Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long đã sử dụng phương
pháp sử dụng chỉ thị phân tử kết hợp với lây nhiễm nhân tạo bằng 9 race vi khuẩn phổ
biến trong đánh giá khả năng kháng bệnh của 348 giống lúa địa phương thu thập được
ở duyên hải Trung bộ và đồng bằng sông Cửu Long. Kết quả đã thu được 17 giống
mang gen xa13, 6 giống mang gen Xa4, 4 giống mang gen xa5, 3 giống mang gen Xa7,
3 giống mang gen Xa14. Kiểm tra độ tin cậy của phương pháp chỉ thị phân tử trong
nghiên cứu phát hiện gen kháng ở quần thể con lai giữa IR24/Barer đối với gen xa5
cho thấy độ chính xác lên tới 93,3% (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004). Bùi
Chí Bửu và cs cũng đã sử dụng chỉ thị phân tử để kiểm tra tổ hợp BC
gen kháng Xa4, xa5, Xa7, Xa21 là các gen có ý nghĩa quan trọng trong việc chọn tạo
giống lúa kháng bệnh, bởi chúng có khả năng kháng được hầu hết các chủng vi khuẩn
phổ biến ở nước ta. Nhưng trong số các gen kháng hữu hiệu, tại miền Bắc thì gen Xa7
có khả năng xuất hiện nhiều hơn xa5.
2.4. Nghiên cứu tính trạng mùi thơm
Trên thế giới, tính trạng mùi thơm đã đựợc nghiên cứu khoảng từ thập kỷ 80
của thế kỷ XX. Theo Lorieux et al. (1996) cho biết mùi thơm được tạo nên bởi hơn
một trăm loại chất dễ bay hơi khác nhau như hydrocarbon, aldehyde, keton, ester,
phenol, pyridine, pyrazine, 2-acetyl-1-proline và một số thành phần khác sinh ra khi
nấu cơm. Theo Bradbury et al. (2005a) thì mùi thơm chỉ có ở loài lúa trồng không có ở
các loài lúa dại, điều đó chứng tỏ mùi thơm do đột biến gen lặn gây lên xẩy ra trong
quá tiến hóa từ loài lúa dại thành loài lúa trồng. Có nhiều gen quy định các mùi thơm
khác nhau, và ít nhất có 6 nhiễm sắc thể chứa các gen quy định mùi thơm ở lúa đã
được xác định. Mỗi giống lúa có một kiểu chất thơm và do các gen khác nhau điều
khiển. Siddiq et al. (1986) đầu tiên đã phát hiện ra 2 gen lặn quy định mùi thơm trong
giống lúa Ấn độ T3 nằm trên nhiễm sắc thể số 5 và 9. Lorieux et al. (1996) lại xác
định có 3 locus gen lặn quy định mùi thơm ở lúa, một locus gen chính nằm trên nhiễm
sắc thể số 8 còn 2 locus kia, một nằm trên nhiễm sắc thể số 4 còn locus 3 nằm trên
nhiễm sắc thể số 12.
Sau đó, Tomar and Prassad (1997) đã phát hiện thêm một gen trội nữa quy
định mùi thơm ở giống lúa Baspatri, nằm trên nhiễm sắc thể số 11, là một giống lúa
địa phương của Ấn độ. Mặc dù vậy, theo Li et al. (2006) thì hầu hết mùi thơm của các
giống lúa đều được điều khiển bởi một gen lặn định vị nằm trên nhiễm sắc thể số 8 của
loài lúa O. sativa . Theo Buttery et al. (1983), thì chất 2-acetyl-1-proline (2-AP) là một
chất dễ bay hơi và là thành phần chính tạo nên mùi thơm của nhiều giống lúa. Đã có
rất nhiều công trình nghiên cứu chỉ ra rằng sự tổng hợp 2-AP có liên quan đến hoạt
tính của enzyme Betaine Aldehyde Dehydrogenase (BAD2). Lorieux et al. (1996) đã
9
áp dụng chỉ thị phân tử để nghiên cứu gen điều khiển tính trạng mùi thơm này trên
quần thể NILs và đã khẳng gen qui định mùi thơm do một gen lặn quy định, ký hiệu
Có 3 loại chỉ thị thường được sử dụng:
• Chỉ thị hình thái.
• Chỉ thị isozyme.
• Chỉ thị phân tử.
2.5.2. Chỉ thị hình thái
Gen chỉ thị bản chất di truyền sẽ được liên kết với một tính trạng hình thái nào đó
mà người ta có thể phát hiện được. Tuy nhiên, nếu dựa vào những chỉ thị này để lập bản
đồ gen và chọn lọc sẽ mất thời gian, số lượng chỉ thị ít do không phải những tính trạng
kiểu hình nào cũng có thể nhận diện được, đồng thời độ chính xác và độ tin cậy thấp.
2.5.3. Chỉ thị isozyme
Isozyme là các dạng khác nhau của một enzyme của một cá thể, cùng có chức
năng xúc tác cho một phản ứng( hoạt tính xúc tác tương tự hoặc giống nhau) nhưng lại
bị ức chế bởi những phân tử khác. Nói cách khác, isozyme là tất cả các dạng khác
nhau của 1 enzyme được mã hóa bởi một locus di truyền.
• Isozyme đơn gen.
• Isozyme đa gen.
Isozyme được dùng trong nhiều mục đích khác nhau, đặc biệt là trong nghiên
cứu đa dạng di truyền của động thực vật, khoảng cách lan rộng của hạt phấn, định
dạng giống
2.5.4. Chỉ thị phân tử - chỉ thị DNA( Phan Hữu Tôn, 2005)
Chỉ thị AFLP( Amplified Fragment Lenght Polymorphism – Đa hình
độ dài các đoạn được nhân bản chọn lọc)
AFLP được định nghĩa là sự đa hình các đoạn cắt khuếch đại, là kỹ thuật kết
hợp giữa RFLP và PCR. AFLP sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt DNA bộ gen, sử dụng
những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR.
AFLP có thể dùng để phân biệt các cá thể rất gần nhau, thậm chí ngay cả
những dòng đẳng gen. Sự khác nhau trong chiều dài các đoạn khuếch đại có thể do
những thay đổi của các base trong vùng trình tự mồi hoặc thêm, mất đoạn giữa hai vị
trí cắt.
11
12
Chỉ thi AP-PCR( Arbitrary Primer – PCR)
Phương pháp dùng 2 đoạn mồi bất kỳ để nhân DNA bằng PCR, để xác định sự
đa hình của các kiểu gen( Phan Hữu Tôn, 2005).
Chỉ thị RFLP( Restriction fragment length polymorphism)
RFLP là phương pháp được sử dụng lần đầu tiên vào năm 1975 để xác định đa
hình DNA nhằm lập bản đồ di truyền của 1 đột biến mẫn cảm nhiệt độ của các
serotype của adenovirus.
RFLP là phương pháp lai DNA – một kỹ thuật nhằm gắn liên kết có chọn lọc
những đặc thù của những sợi DNA đơn hoặc RNA dựa trên cơ sở ghép cặp bổ sung
những đoạn DNA sợi đơn tương ứng đã chuyển dính vào màng Nitrocellulose( Phan
Hữu Tôn, 2005).
Chỉ thị ALP( Amplicon length polymorphism)
Sự đa hình chiều dài những đoạn DNA được nhân bản trên cơ sở của phương
pháp PCR.
Chỉ thị RAPD( Random amplified polymorphic DNA)
Sự đa hình những đoạn DNA được nhân lên một cách ngẫu nhiên trên cơ sở
phương pháp PCR dùng một đoạn mồi.
Chỉ thị DAF( DNA amplification fingerpringting)
Phương pháp nhân DNA in vân tay dùng rất nhiều đoạn mồi đơn ngắn.
Chỉ thị SSCP( Single strand conformation polymorphism)
Sự đa hình về cấu trúc sợi DNA, trong genome có một số vị trí DNA tại đó mở
xoắn tạo thành 2 sợi đơn. Những vị trí này được sử dụng để nghiên cứu sự đa dạng
genome sinh vật. Ngoài ra, còn được dùng làm chỉ thị liên quan đến các gen tính trạng
khác.
13
PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Vật liệu nghiên cứu
- Vật liệu nghiên cứu gồm 50 mẫu giống lúa nếp bao gồm các giống lúa nếp
thường và nếp Cẩm đang được lưu giữ giống tại Trung tâm Bảo tồn và phát triển
- Các thí nghiệm ngoài đồng ruộng được bố trí tại ruộng thí nghiệm của Trung
tâm Bảo tồn và Phát triển nguồn gen cây trồng.
- Các thí nghiệm trong phòng được thực hiện tại phòng thí nghiệm sinh học
phân tử, Bộ môn Sinh học phân tử và CNSH Ứng dụng, khoa Công nghệ sinh học.
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Bố trí thí nghiệm đồng ruộng
Thí nghiệm được bố trí theo từng ô, mỗi ô một giống không nhắc lại: mỗi
giống cấy 5m
2
; hàng-hàng: 18-20cm; cây-cây: 10-11cm, cấy một dảnh; mật độ 42
khóm/m
2
.
3.2.2. Kỹ thuật trồng và chăm sóc
- Cày bừa, làm giầm đất, nhặt cỏ sách sẽ, san phẳng ruộng.
- Gieo mạ, gieo theo đúng luống, ô.
- Bón phân:
Lượng bón: 120kg N + 90kg P
2
O
5
+ 60kg K
2
O /ha
Cách bón:
+ Bón lót: 100% P
2
O
5
+ 20% N sau lần bừa cuối cùng.
điểm:thoát vừa; 3 điểm:thoát trung bình; 5 điểm: vừa đúng cổ bông; 7 điểm: thoát một
phần; 9 điểm: không thoát được.
- Chiều cao cây cuối cùng: Đo từ sát mặt đất đến mút đầu bông không kể râu
hạt của 10 cây. Theo “Hệ thống tiêu chuẩn đánh giá nguồn gen lúa” của IRRI, chiều
cao cây lúa được chia thành 3 mức ứng với thang điểm:
16
Copyright: Tài liệu đại học ©