TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
=====***=====
CHU THỊ THU HÀ
PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN
NGUỒN GEN BA KÍCH TÍM (MORINDA
OFFICINALIS HOW) QUẢNG NINH
BẰNG CHỈ THỊ ISSR
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
TS. LÂM ĐẠI NHÂN
HÀ NỘI - 2015
i
LỜI CẢM ƠN
Sau một thời gian thực tập tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện
Công nghệ sinh học, được sự quan tâm, giúp đỡ và dìu dắt tận tình của các
Thầy Cô giáo, các cán bộ tại phòng thí nghiệm của Viện, cùng với sự cố gắng
và nỗ lực của bản thân, tôi đã hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình.
Tôi xin cảm ơn tới các Ban Giám hiệu trường Đại học Sư phạm Hà Nội
2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh –KTNN trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
trường đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn chân thành tới TS. Lâm Đại
Nhân đã trực tiếp hướng dẫn tôi, luôn chỉ bảo tận tình trong quá trình thực
hiện khóa luận tốt nghiệp.
Chu Thị Thu Hà
iii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Kí hiệu và địa điểm thu thập mẫu Ba kích ..................................... 19
Bảng 2.2: Tên và trình tự các mồi ISSR sử dụng trong nghiên cứu ............... 20
Bảng 2.3: Các thiết bị cơ bản dùng trong nghiên cứu..................................... 21
ảng 2.4: Hóa chất pha đệm rửa ..................................................................... 21
ảng 2.5: Hóa chất pha đệm chiết .................................................................. 22
Bảng 2.6: Thành phần phản ứng PCR-ISSR ................................................... 25
Bảng 3.1: Bảng giá trị độ tinh sạch và nồng độ DNA của các mẫu Ba kích .. 28
Bảng 3.2: Sản phẩm đa hình ISSR của mồi ISSR 56 nhận được sau khi chạy
PCR với DNA tổng số của các mẫu Ba kích .................................................. 33
ảng 3.3: Giá trị PIC và t lệ băng đa hình của 39 mẫu a k ch với 6 mồi ISSR. ... 35
Bảng 3.4: Hệ số tương đồng 39 mẫu Ba kích nghiên cứu .............................. 38
iv
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Cây Ba kích (Morinda officinalis How) [1]...................................... 4
Hình 1.2: Công thức của một số hợp chất có trong rễ Ba kích ......................... 5
Hình 2.1: Chu kỳ nhiệt chạy phản ứng PCR-ISSR ......................................... 26
Hình 3.1: Ảnh điện di DNA tổng số 18 mẫu Ba kích ..................................... 29
Hình 3.2 A, B, C: Ảnh điện di sản phẩm PCR-ISSR với mồi ISSR50 ........... 31
Hình 3.3 A, B, C: Ảnh điện di sản phẩm PCR-ISSR với mồi ISSR56 ........... 32
Hình 3.4: Sơ đồ hình cây biểu diễn mối liên kết di truyền giữa các mẫu Ba
kích dựa vào chỉ thị ISSR................................................................................ 37
EtBr
Ethidium Bromide
Cs
Cộng sự
Bp
Base pair
CTAB Cetyltrimethyl amoniumbromide
EDTA Ethylene Diamin Tetra Acetate
dNTP
Deoxynucleosid triphosphat
TAE
Tris Acetate EDTA
vi
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề...................................................................................................... 1
2. Mục đ ch, yêu cầu ......................................................................................... 2
Chƣơng II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 19
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu............................................................ 19
2.2.Vật liệu ...................................................................................................... 19
2.2.1. Vật liệu thực vật .................................................................................... 19
2.2.2. Trình tự các mồi ISSR........................................................................... 20
2.2.3. Hóa chất và thiết bị ............................................................................... 21
2.3. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 21
2.3.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số................................................... 21
2.3.2. Phương pháp định lượng DNA bằng quang phổ kế .............................. 23
2.3.3. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose ........................................ 24
2.3.4. Phương pháp PCR-ISSR ....................................................................... 25
2.3.5. Phương pháp phân t ch số liệu .............................................................. 26
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 28
3.1. Kết quả tách chiết DNA ........................................................................... 28
3.2. Kết quả phân tích sự đa dạng di truyền Ba kích tím Quảng Ninh ........... 29
Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................... 40
4.1. Kết luận .................................................................................................... 40
4.2. Kiến nghị .................................................................................................. 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 41
viii
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Cây Ba kích (Morinda officinalis How) thuộc họ Cà phê (Rubiaseae) là
loại thảo dược quý, nơi phân bố của
a k ch chủ yếu mọc hoang ở những
1
gen Ba kích tím (Morinda officinalis How) Quảng Ninh bằng chỉ thị
ISSR”.
2. Mục đích, yêu cầu
2.1. Mục đích
Phân t ch đa dạng di truyền nguồn gen Ba kích tím Quảng Ninh.
2.2. Yêu cầu
Thu thập và tách chiết được DNA của các mẫu Ba kích.
Thực hiện các phản ứng PCR-ISSR và điện di sản phẩm PCR-ISSR
trên gel agarose.
Xử lý số liệu thống kê và đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen Ba kích
tím tại Quảng Ninh bằng phần mềm NTSYSpc 2.1.
3.Ý nghĩa của đề tài
3.1. Ý nghĩa lý luận
Nhằm góp phần đánh giá mức độ đa dạng nguồn gen và bổ sung thêm
các nghiên cứu về cây Ba kích ở Việt Nam.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Đánh giá mức độ đa dạng nguồn gen của quần thể Ba kích từ đó ứng
dụng vào công tác chọn tạo giống.
Từ kết quả nghiên cứu có thể ứng dụng trong công tác chọn lọc những
nguồn giống cây trồng khác nhau nhân rộng vào sản xuất, nhằm bảo tồn và
phát triển các nguồn gen quý.
2
NỘI DUNG
Chƣơng I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
núi các tỉnh ph a ắc, dưới tán một số kiểu rừng nhiệt đới ẩm lá rộng thường
xanh, nay trở nên thứ sinh gồm cây bụi và dây leo chằng chịt hoặc ở bờ
nương rẫy. Độ cao phân bố khoảng 100 m so với mặt biển. Càng lên cao cây
càng thưa dần, đến độ cao khoảng 1000 m thì hầu như hiếm gặp. Cây mọc
nhiều nhất ở các tỉnh Quảng Ninh, Phú Thọ, Hoà ình, Hà Giang, Lạng Sơn.
Ngoài ra nó còn có ở 1 số nước như Trung Quốc, Lào, Triều Tiên…
a k ch sinh trưởng và phát triển tốt ở những vùng có đặc trưng kh hậu
nhiệt đới ẩm, độ ẩm trung bình năm trên 80% và tổng lượng mưa cả năm đạt
1100 - 2000 mm.
a k ch sống th ch hợp trên các loại đất ẩm mát và thoát
nước tốt, thành phần cơ giới trung bình (cát pha đến thịt), tầng đất dày trên
1m, nhiều mùn, tơi xốp.
1.1.4. Hợp chất tự nhiên trong cây Ba kích (Morinda offcinalis How)
Củ Ba kích có chứa các thành phần hoạt chất ch nh như: Gentianine,
Carpaine,
Choline,
Trigonelline,
Diogenin,
Yamogenin,
Gitogenin,
Tigogenin, Vitexin, Orientin, Quercetin, Luteolin, Vitamin B1,Morindin,
Vitamin C. Trong rễ Ba kích còn chứa Antraglycozid, đường, nhựa, Acid
già hoặc những bệnh nhân không biểu hiện mệt mỏi, ăn kém, ngủ ít, gầy yếu
mà không thấy có những yếu tố bệnh lý gây nên và một số trường hợp có đau
mỏi các khớp, Ba kích có tác dụng tăng lực rõ rệt thể hiện qua những cảm
giác chủ quan như giảm mệt mỏi, ăn ngon, ngủ ngon và những dấu hiệu khách
quan như tăng cân nặng, tăng cơ lực. Đối với bệnh nhân đau mỏi các khớp thì
sau khi dùng Ba kích dài ngày cho thấy có hiệu quả [2]. Nước sắc Ba kích có
tác dụng tương tự như ACTH (adrenocorticotropic hormone). Rễ Ba kích
chiết xuất bằng rượu có tác dụng giảm áp huyết, có tác dụng nhanh đối với
các tuyến cơ năng, tăng cường não.
Ngoài ra Ba kích không có tính độc, LD50 của Ba kích được xác định
trên chuột nhắt trắng bằng đường miệng là 193g/kg (Trung dược dược lý, Độc
lý dữ lâm sàng) [6].
Theo y học cổ truyền, cây Ba kích có tác dụng bổ thận tráng dương,
mạng gân cốt, khử phong thấp. Từ xưa nhân dân ta đã biết sử dụng rễ Ba kích
trong nhiều bài thuốc dân gian để chữa bệnh, Ba kích là vị thuốc bổ trí não và
tinh khí, dùng trong các bệnh liệt dương, sớm xuất tinh, di mộng tinh, phụ nữ
kinh nguyệt không đều, phong thấp, huyết áp cao [1], [7]. Ở những nơi có cây
a k ch người dân thường đào củ về nấu với thịt gà, ăn để bồi bổ sức khỏe.
1.1.6. Giá trị kinh tế của cây Ba kích(Morinda offcinalis How)
Ba kích là loại dược liệu có giá trị kinh tế cao. Trên thị trường hiện nay
giá của
a k ch tươi là 200.000 nghìn/kg, giá Ba kích khô là 600.000
nghìn/kg. Chính vì vậy nhiều tỉnh ở nước ta đã triển khai trồng Ba kích nhằm
bảo tồn và phát triển cây a k ch, tăng nguồn thu nhập cho con người, tránh
tình trạng người dân phải mua Ba kích từ Trung Quốc mà Ba kích Trung
Quốc thường đã bị người dân Trung luộc lấy hết dược liệu, chỉ còn bã đem
phơi khô và bán cho người Việt Nam.
7
Ở thực vật, có nhiều loại chỉ thị phân tử đã được ứng dụng trong các
nghiên cứu. Các chỉ thị DNA phổ biến trong nghiên cứu sinh học phân tử ở
thực
vật
là:
RFLP
(Restriction
Fragment
Length
Polymorphism),
Microsatellite (hay SSR-Simple Sequence Repeat ), RAPD (Random
Amplified Polymorphic DNA), AFLP (Amplified Fragment Length
Polymorphism) và ISSR (Inter - Simple Sequence Repeat) (Semagn và cs,
2006). Trong đó chia thành hai nhóm ch nh là: Chỉ thị dựa trên các trình tự
nhận biết của enzyme giới hạn (RFLP), các chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản
DNA bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) như: AFLP, RAPD,
SSR, ISSR. Mỗi chỉ thị đều có những ưu điểm và nhược điểm nhất định,
không có loại chỉ thị nào đáp ứng được tất cả các chỉ tiêu nhưng có thể bổ
việc đánh giá sự sai khác di truyền, đặc biệt trong những loài t được biết về
đặc tính di truyền.
Chỉ thị RAPD dựa trên cơ sở phản ứng PCR do sự nhân bội những
đoạn DNA trong hệ gen, sử dụng những đoạn mồi đơn lẻ, ngẫu nhiên (random
primer) dài khoảng 10 nucleotit dưới nhiệt độ kết cặp thấp (khoảng 370C).
Khi sử dụng một mồi đơn lẻ, ngẫu nhiên có k ch thước ngắn khoảng 10
nucleotit để thực hiện phản ứng PCR cho một DNA bất kỳ, mồi sẽ bắt cặp
ngẫu nhiên và quá trình nhân bản sẽ xảy ra (ở một đoạn nào đó) khi hai mồi
bắt cặp đúng chiều (vào đầu 3’ của mỗi sợi) và khoảng cách giữa hai mồi
không quá 1-3 kb. Đồng thời trong quá trình nhân bản sẽ xảy ra ở nhiều vị tr
và cho các đoạn DNA có k ch thước khác nhau. Kết quả chạy điện di cho các
băng vạch khác nhau và qua đó sẽ đánh giá được sự khác biệt về DNA giữa
các mẫu nghiên cứu. Đồng thời cho thấy sự đồng dạng (số băng trùng nhau)
của DNA giữa các cá thể đem phân t ch.
Ưu điểm của kỹ thuật RAPD là thực hiện nhanh dễ làm, ít tốn kém nên
được ứng dụng rộng rãi trong việc phát hiện t nh đa dạng của sinh vật. Những
thay đổi trong gen, đột biến nhiễm sắc thể... đều làm thay đổi k ch thước của
9
đoạn nhân bản. Kỹ thuật này phù hợp với phân t ch đa dạng di truyền, lập bản
đồ gen.
Một trong những ứng dụng quan trọng nhất của kỹ thuật RAPD là xác
định nguồn gốc di truyền, mối quan hệ họ hàng của động vật, thực vật và vi
sinh vật nên kỹ thuật này còn được gọi là phương pháp phân loại học phân tử.
Tuy nhiên, kỹ thuật này còn có những hạn chế như: Số băng thu được sau khi
sử dụng các mồi ngẫu nhiên còn rất lớn và không chắc chắn khi có băng AND
giống nhau thể hiện cùng k ch thước trên bản gel có thực sự là ở cùng một vị
trí trên hệ genom hay không [4].
trưng, trước hết phải cắt các mẫu DNA cần nghiên cứu bằng enzyme cắt giới
hạn. Người ta thường dùng đồng thời 2 enzym giới hạn để cắt DNA. Sau khi
xử lý với các enzym giới hạn, DNA bị cắt thành nhiều đoạn có k ch thước
khác nhau nhưng trình tự các nucleotit ở hai đầu đoạn cắt giống nhau và đã
được xác định. Dựa vào trình tự đã biết ở hai đầu cắt, có thể thiết kế các đoạn
Oligonucleotit ngắn (gọi là các adaptor) và gắn chúng vào hai đầu cắt. Dựa
vào trình tự adaptor có thể thiết kế mồi PCR gồm hai phần: Phần có trình tự
bổ sung với adaptor và phần có một đến ba nucleotide tùy ý. Với mồi thiết kế
như vậy chỉ có các đoạn DNA có trình tự 2 đầu bắt cặp bổ sung với trình tự
mồi mới được nhân bản.
Các bước tiến hành kỹ thuật AFLP
ước 1: Tách chiết, tinh sạch DNA.
ước 2: Cắt các phân tử DNA bằng các enzyme giới hạn. Có thể dùng
2 enzym giới hạn để xử lý.
ước 3: Nối các đoạn DNA đã cắt với các adaptor.
ước 4: Nhân bản có chọn lọc các đoạn được nối ở trên bằng kỹ thuật PCR.
ước 5: Phân tích kết quả sản phẩm PCR bằng điện di và xử lý kết quả
bằng các phần mềm thông dụng để đánh giá sự khác biệt di
truyền và đa dạng sinh học của các mẫu nghiên cứu.
11
Những ưu, nhược điểm của kỹ thuật AFLP:
Ưu điểm:
Kỹ thuật AFLP có thể phân tích với bất kỳ hệ gen nào từ đơn giản đến
phức tạp. Phân tích sự đa dạng di truyền, đánh dấu các gen và ứng dụng để
lập bản đồ gen.
Kỹ thuật AFLP ít phức tạp hơn RFLP và phát hiện được một số lượng
lớn DNA đa hình trong thời gian ngắn và vì thế là một kỹ thuật hữu ích trong
ước 2: Tiến hành phản ứng PCR.
Tiến hành phản ứng PCR với các đoạn có trình tự bổ sung với các đoạn
DNA ở giữa 2 trình tự lặp lại liền kề nhau.
ước 3: Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose, sau đó nhuộm gel
bằng Ethidium bromide.
ước 4: Chụp ảnh phổ điện di và phân tích số liệu.
Những ưu điểm của kỹ thuật
Chỉ thị ISSR không cần biết trước thông tin về trình tự nhân để thiết kế mồi.
Phương pháp ISSR chỉ cần một lượng nhỏ DNA để tiến hành [17], [35].
Kĩ thuật PCR-ISSR đơn giản và nhanh chóng, dễ thực hiện.
Chỉ thị ISSR có sự đa hình cao và được sử dụng để nghiên cứu đa dạng
di truyền, đa dạng loài, lập bản đồ gen và nghiên cứu sự tiến hóa của sinh vật.
1.3. Tình hình nghiên cứu Ba kích(Morinda offcinalis How) trên thế giới
và trong nƣớc
1.3.1. Tình hình nghiên cứu Ba kích (Morinda offcinalis How) trên thế giới
Trên thế giới cây Ba kích có phạm vi phân bố hẹp nên có ít công trình
nghiên cứu về loài cây này, chỉ có một số công trình nghiên cứu điển hình ở
Australia, New Guinea và Trung Quốc.
Ở Trung Quốc, a k ch cũng được nhiều nhà khoa học nghiên cứu về
thành phần hóa học và tác dụng dược lý, theo nghiên cứu Ba kích có tác dụng
tăng cường năng lực nam giới, chữa bệnh liệt dương, vô sinh và chữa trị thấp
khớp, điều hòa kinh nguyệt ở nữ giới. Tác dụng hạ đường huyết của cây Ba
13
k ch cũng được Soon và cs nghiên cứu trên mô hình chuột gây đái tháo đường
typel bằng steptozotocin và tác giả kết luận rằng rễ Ba kích có tác dụng hạ đường
một số địa phương khác. Viện Khoa học lâm nghiệp Việt nam cũng đã có
những đề tài nghiên cứu thăm dò về gây trồng, bảo quản hạt và dược t nh của
14
cây a k ch như: Nghiên cứu gây trồng a k ch bằng hom dâm dưới tán rừng
và ngoài đất trống có dàn che của Nguyễn Đình Cầm (1972 - 1977) tại Trung
tâm Nghiên cứu Thực nghiệm lâm sinh Cầu Hai. Nghiên cứu thăm dò về bảo
quản hạt
a k ch và phương thức gieo ươm của Lê Đình Khả (1977). Tìm
hiểu về tác dụng của dịch chiết củ
a k ch của Thái Nguyễn Minh Tâm
(1975-1977)[42].
Ngoài ra còn có các nghiên cứu của Viện dược liệu và các trung tâm
nghiên cứu khác như:
+ Nghiên cứu tác dụng hướng sinh dục nam của Ba kích của Trần Mỹ
Tiên và cs(2012). Tác giả đã sử dụng cao chiết cồn 45% của rễ Ba kích và
tiến hành thí nghiệm trên chuột nhắt trắng bình thường và bị năng sinh dục.
Kết quả cho thấy trên cơ địa động vật, giảm năng sinh dục cao
a k ch đều
thể hiện tác dụng làm tăng nồng độ testosteron huyết, tăng trọng lượng của cơ
quan sinh dục đực và cơ hậu môn, tăng nồng độ toàn phần protein trong huyết
tương và không làm tăng thể trọng trong cơ thể. Tác dụng này cũng thể hiện
rõ trên động vật bình thường ở liều cao. Qua đó kết luận Ba kích thể hiện tác
quyền nhà nước đã có những ch nh sách để bảo vệ rừng, ngăn chặn nạn khai thác
rừng bừa bãi. Các dự án bảo tồn và phát triển cây Ba kích nhằm đem lại một
nguồn dược liệu chữa bệnh và tăng nguồn thu nhập cho con người.
Đã có nhiều công trình nghiên cứu đưa
a kích từ hoang dại thuần
hoá trở thành cây trồng trọt và Ba k ch được trồng ở các mô hình khác
nhau như trồng
a k ch dưới tán rừng thứ sinh, trồng xen với các cây
nông nghiệp như ngô, sắn trên các nương rẫy hoặc vườn hộ gia đình. Một
số dẫn liệu về nghiên cứu trồng Ba kích nhằm sản xuất dược liệu qua các
công trình nghiên cứu như:
Nghiên cứu trồng
a k ch dưới tán rừng thứ sinh ở Hoành Bồ (Quảng
Ninh) có độ che phủ khác nhau, không thấy chênh lệch về năng suất củ, nhưng
kém xa so với trồng a k ch ngoài đất trống không có tán che. Và sau 7 năm
trồng Ba kích, khối lượng củ mỗi bụi chỉ đạt 47 - 55 gam (tươi) tương ứng với
khối lượng thân. Nếu trồng a k ch có phân bón vô cơ và phân bón hữu cơ thì
sau 6 năm khối lượng củ cho mỗi bụi chỉ đạt dưới 100 gam. Như vậy, trồng Ba
16
k ch dưới tán rừng thứ sinh tuy có củ nhưng năng suất củ kém hơn nhiều so với
trồng ngoài đất được cải tạo trắng.
Nghiên cứu trồng thử nghiệm Ba kíchtrên đất đồi trống tại xã Chân
năm tuổi tại xã Thành Vân, huyện Thạch Thành, tỉnh Thanh Hoá với độ che
17
Copyright: Tài liệu đại học ©