TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
======
NGUYỄN NGỌC DIỆP
PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ
DÕNG NGÔ CÓ HÀM LƢỢNG PROTEIN CAO (QPM)
BẰNG CHỈ THỊ SSR KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Di truyền học Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
ThS. NGUYỄN VĂN TRƢỜNG HÀ NỘI - 2015


LỜI CAM ĐOAN

         c thc hin bng s
nghiên cu ca bi s ng dn ca Ths. Nguyng,
cán b phòng Công ngh sinh hc ca Vin nghiên c Các
hình nh, s liu, kt qu nêu trong khóa lun là trung thc trong
quá trình nghiên cu cc ai công b trong bt k
công trình nghiên cu nào khác.

Hà Nội, ngày tháng năm 2015
Sinh viên Nguyễn Ngọc Diệp
iv
MỤC LỤC

M U 1
NG QUAN TÀI LI KHOA HC 3
1.1. Tình hình sn xut ngô trên th gii và Vit Nam 3
1.1.1. Tình hình sn xut ngô trên th gii 3
1.1.2. Tình hình sn xut ngô  Vit Nam 3
1.2. Tng quan v ngô chng protein cao  QPM 5
1.2.1. Khái nim và hiu qu s dng ngô QPM 5
1.2.2. Tình hình nghiên cu ging ngô QPM 7
1.3. Ch th phân t trong nghiên cng di truyn và chn to ging ngô 9
1.3.1. Các loi ch th phân t 9
1.3.2. ng dng ch th phân t trong phân tích di truyn và chn to ging ngô 13
1.3.3. ng dng ch th phân t trong chn to ging ngô QPM 16
T LIU, NI DUNG U 17

Bng 3.3. T l khuyt s liu (M%) ca 29 mi SSR nghiên cu 31
Bng 3.4. T l d hp t (H%) và t l khuyt s liu (M%) ca các dòng ngô
a trên 29 ch th SSR 33
Bng 3.5. H s ng (Jacard) ca 30 dòng ngô nghiên cu da trên 29
ch th SSR 36 vi
DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 3.1. nh n di kim DNA tng s ca 30 dòng ngô trên gel agarose
0,8% 26
Hình 3.2. Kt qu di sn phm PCR mi umc1304 ca 30 dòng ngô trên gel
polyacrylamide 4,5% 29
Hình 3.3. Kt qu n di sn phm PCR mi phi101049 ca 30 dòng ngô trên
gel polyacrylamide 4,5% 29
Hình 3.4. Kt qu n di sn phm PCR mi phi029 ca 30 dòng ngô trên gel
polyacrylamide 4,5% 30
Hình 3.5. Kt qu n di sn phm PCR mi phi109188 ca 30 dòng ngô trên
gel polyacrylamide 4,5% 30
Hình 3.6.  ph h ca 30 dòng ngô nghiên cu da trên 29 ch th SSR
phân tích bng phn m UPGMA 37 vii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AFLP
Amplified Fragment Length Polymorphism
bp

1. Đặt vấn đề
 Vit Nam, ngô c coi là cây trng quan trng th hai sau cây lúa
và là cây màu quan trng nhc trng  nhiu vùng sinh thái khác nhau,
ng v mùa v gieo trng và h thng canh tác. Trong khong hai thp
niên g, do áp dng các ging ngô lai vào canh tác nên sn xut ngô 
c ta phát trin mnh c v dit và sng. Theo s liu
thng kê n3 ca Tng cc Thng kê [35] thì din tích ngô c c là
1172,5 nghìn ha bng 101,37% so v, t
bình quân t 44,3 t/ha và sng ngô là 5193,5 nghìn tn
t và 4,42% v sng so v
Công tác chn to ging ngô lai ca các nhà chn to gi
góp mt phn rt ln cho s phát trin ca nn sn xut ngô trong vic to ra
các ging ngô lai mi có kh ng chu vu kin ngoi cnh bt
thun và sâu bnh c bit là t cao, chng tt. Ngô cht
ng protein cao (QPM - High Quality Protein Maize) nh có m là
ng và chng protein cao nên chn to ging ngô lai QPM 
c  nh là mt trong nh  ng mi trong công tác chn to
ging ngô ca th gii và Vit Nam. Ngô QPM hic s dng trc tip
i ti các vùng có truyn th
ng ca th.
Trong chn to ging ngô lai nói chung và ngô QPM nói riêng thì vic
ng di truyn tng các ch th sinh hc phân t
n quan trng khc phc các v
ng các  và
ph h truyn thng. Các nhà chn to ging da trên thông tin
ng di truyn có th c mi quan h di truyn
ca t   u, h tr c lc cho vic lai to gi  ng
2
rung.
ng dng ch th phân t trong trong nghiên cu và chn to ging ngô

v din tích. Nh vai trò quan trng trong nn kinh t nên sn xut ngô trên
th gii c quan tâm và ngày càng phát trin. Ngô c trng trên
toàn th gii vào khong 155,57 trii sng 803,69
triu tn. Ngô chim mt v trí quan trng trong nn kinh t th gii và
i thc phm, thp. Hàng trii
trên th gis dng t thc phm ch yu và quan trng do
ng protein và calo cao (Vasal, 1999) [30].
Mc dù trong nh    n tích trng ngô trên toàn cu
i th k XX do din tích canh tác có gii h
sng ngô trên th gii vn liên tng. Nguyên nhân chính là do
c ci thin nh áp dng các ging ngô lai và các
bin pháp k thut canh tác tiên tin vào sn xut ( Ngc Quý, 2004) [11].
n tích trng ngô trên toàn th gii là 140,2 triu hecta v
sut bình quân là 4,3 tt tng sng trên 600 triu tn, t l din
tích trng ngô chim 20% trong tng din tích trc (Ngô Hu
Tình, 2002) [13]. Mn xut ngô
trên toàn th gin 2000 - 2010 v dit là
2,1% và sn tích gieo trng ngô trên toàn
th gii là 176,9 triu hecta vt trung bình là 4,94 tn/ha (gim so
v n/ha) và s t trên 875 triu tn  c
Quý, 2014) [11].
1.1.2. Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam
Cùng vi s phát trin ca th gii, vic phát trin sn xut ngô  Vit
4
Nam trong vài thp k g c nhng kt qu quan trng do
có nhng chính sách khuyn khích cc và vic áp dng thành công
nhng tin b khoa hc k thut v ging, k thut canh tác vào sn xut nên
c tin mnh v dit và sng.
t ngô Vin cui nh t 10 t/ha do
trng các gii k thut canh tác lc hu. T gia nhng

(nghìn ha)
1.096,1
1.140,2
1.089,2
1.125,7
1.121,3
1.156,6
1.172,5
t
(t/ha)
39,3
40,1
40,1
41,1
43,1
43,0
44,3
Sng
(nghìn tn)
4.303,2
4.573,1
4.371,7
4.625,7
4.835,6
4.973,6
5.193,5
Nguồn: Tổng cục thống kê [36]
Mc dù sn xuc liên tng v t và
st Nam vn phi nhp khu mng ngô khá
ln nhng cho nhu cu ngành công nghip thi

[33]. Các nghiên cu ca các nhà khoa hc ng gamma Zein
trong ngô QPM, góp ph l nng, trong khi hng lizin
và tryptophan vng. Ch ng protein ca
ngô có gen opaque-    ng 43% và giá tr casein là 95%
(Mertz, 1964, 1992) [25], [24].
y, QPM là ngô mang gen lc sa cha mt
s m, chng chu sâu bu kin bt thun
, úng, b sâu mt phá hoi nhiu khi bo qun, nhanh mt sc ny
m   t thp. Nh s dng h gen sa cha trong quá trình lai
truy     
cng, chng chu vi sâu bu kin bt thun tt ng
hm tt, ít b sâu mt phá hoo qun và ny mm
t  ng v
t, kh chng chng và chng protein cao
7
c bing lizin và tryptophan cao gng.
Graham và cng s t luc s dng là
ngun protein duy nht cung cng trong khu pha tr
em [20]. Clark và cng s (1977) chng minh rng ngô mang cp allen o2o2
p protein chng trong khu pha thanh niên [18].
Ngoài vic s di, khi dùng ngô QPM làm
thgia súc, gia cng tác dng rõ rt. Nghiên cu ca
 ra rng khi s dng lizin cao trong các thí
nghim v khu phn thn có th tit kic 22% bt cá. Hiu
qu s dng ci vc th hin  t 
trng ca ln khi dùng ngô QPM cao gp 2 ln so v
thun (không b sung bt c lom nào). Ch c
l ng axit amin cn thit cho ln, không cng lizin tng
hp (trích theo Châu Ngc Lý, 2012) [8].
Ti Vit Nam, nhng nghiên cu c Th [10]

Ngô hp tác vi CIMMYT và nhp ni mt s nguyên liu QPM và lai to
thành công gi nghim sn xut. Ging
HQ2000 mang nhim nông h tt, sch sâu bnh,
tic bing protein cao.
Din tích ngô lai HQ2000 nhanh chóng phát tring vào
sn xut 1.200 ha trên toàn qu
Tuy nhiên, thc t sn xut cho thy bên cnh nhc tính tt ca ging thì
HQ2000 vn tn ti mt s y l thi bp cao, chín chm trong
v  l ht/bp thp, nhanh b sâu mt trong quá trình bo qu
khc phm ca ging ngô QPM nói chung và ging HQ2000 nói
riêng, mo dòng QPM th h mc các nhà khoa hc
Vin Nghiên cu Ngô kh    o m 
9
dòng QPM mi b rình to ging và cht
ng protein cao ti Vit Nam (Châu Ngc Lý, 2008) [9].
     
           
- 

              

p
lysine trong p
 methionine trong protein

Trung Kiên, 2009) [7].
1.3. Chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền và chọn tạo
giống ngô
1.3.1. Các loại chỉ thị phân tử
ng di truyn là s ng v thành phn kiu gen gia các cá th

hình.
1.3.1.2. Chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản DNA bằng kĩ thuật PCR
Phn            
polymerasPolymerase Chain R
 (Taq polymerase) 
loài Thermus aquaticus 

          Taq  
de 

11





(Amplicon Length P
, 

  và Taq polymerase.
 Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
K thut s dng ch th RAPD da trên k thut PCR, bng cách s
dng nhn mi ngn (khong 10 nucleotide) có trình t bic, bt
cp và nhân bn ngu nhiên nhn DNA có trình t b sung vi trình t
ca các primer. Theo nguyên tc, hai cá th hoàn toàn ging nhau thì sau khi
thc hin phn ng RAPD  u ki to ra s ng n
DNA bng nhau và ching bt
bin làm xut hin hay mt v trí bt cp ngu nhiên s to ra s ng
và chin DNA khác nhau gia các cá th, vì vy k thut RAPD
có th phát hit bin. K thut RAPD giúp nhn din nhng ch th phân

Có hai loi trình t lp li là: 1) Trình t lp li phân tán và 2) Trình t
lp li lin k (tendem repeat).
S nucleotide trong m lp li có th t n hàng 
Da vào s nucleotide trong m lp ln ch th
sau:
+ S nucleotide trong m   lp li nh   i là ch th
SSR (Simple Sequence Repeats).
+ S nucleotide trong m lp li t n 25 gi là ch th STR
13
(Short Tendem Repeats).
+ S nucleotide trong m lp li li là ch th VNTR
(Variable Number Tendem Repeats).
D     n) c  n lp li có trình t rt
c bit và thng nht chung cho cùng mn DNA trên gen không phân
bit cá th trong cùng mt a các cá th trong cùng mt loài s
ln lp li c lp li là khác nhau. T t k các cp mi c
hi nhân bn các cp DNA trên gen cha các trình t lp ln di sn
phm PCR cho phép phân bic s ging và khác nhau gia các cá th
trong cùng loài.
SSR là công c hu ích trong phân tích h  th ng
tri có kh t cac s dng nghiên cu
mt s tính trt, bnh hnh gii tính, phân
tích quan h di truyn, lp b gen Ch th SSR là ch th chính xác và
hu hiu trong xnh quan h di truyn, phân loi thc vt, xây dng bn
 liên kt và ch   lai. Các ch th SSR là ch th
n, d thc hin và cho kt qu chính xác. Tuy nhiên thì ch
th SSR có mt s  cn nhiu thao tác khi tin hành, thit k
mi cho phn ng nhân SSR phc tp và thc hin ch th SSR 
i tn kém.
1.3.2. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong phân tích di truyền và chọn tạo giống

ng s [22] 
22 dòng QPM t CIMMYT và 24 dòng ca Trung Quc vi ch th SSR. Mc
tiêu ca nghiên cu này là nghiên cu s ng di truyn gia các 46 dòng
thung cách di truyn gia các dòng ngô thun QPM  vùng
cn nhii và Trung Quc tính các mi quan h di truyn gia QPM
cn nhii và dòng thung Trung Quc. Tác gi s dng 64 mi
15
  ng 46 dòng ngô. Giá tr trung bình (0,66) ca ch s 
hình ca mi vi các locus SSR cung c kh 
ng di truyn gia các dòng thun. H s ng di truyn trung bình
(GS) c ng ca Trung Quc (0,344) và trong s 6 dòng
QPM Trung Qu (P < 0,01) so vi giá tr trung bình
GS trong s 22 dòng QPM ca CIMMYT (0,310). ng Trung
Quc coi là có mt s ng di truyn hi
dòng QPM t CIMMYT.
ng s [21 th phân t  
giá s ng di truyn ca 63 dòng QPM ph bin. Trong s 48 dòng thì có
37 dòng cho thy s ng cnh t 37
ch th SSR trong 63 dòng ngô QPM. S ng trung bình ca mi allen locus
là 4,08. S allen bin thiên t n 6. Các giá tr ng t 0 - 0,75,
giá tr trung bình 0,48. Trong nghiên cu này, tác gi 
thành 2 nhóm l thit k t hp lai thích hp.
 và Hossain [27 th phân t 
ng di truyn ngô QPM. Trong nghiên cu này có tng s 256
c phát hin trên 75 SSR locus. S allen mi locus bin thiên t 2
n 7, vi trung bình là 3,41 allen mi locus. Các giá tr ng t
n 0,79 vi trung bình là 0,50. Các d hp t quan sát trong s các du
SSR dao 0,00 - 0,17, vi giá tr trung bình là 0,03.
Nguyn Th  dng ch th  nghiên cu
ng di truyn và d  lai ca 30 dòng ngô có ngun gc khác
17
Chƣơng 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
Vt liu nghiên cc trng ti Vin Nghiên
cu Ngô - ng - Hà Ni ( bng 2.1).
Bảng 2.1: Dang sách 30 dòng ngô QPM sử dụng trong nghiên cứu
Nghiên c    dng 29 cp mi SSR (bng 2.2) do
AMBIONET cung cp các loi hoá cht thit b cn thit khác trong sinh hc
phân t.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Tách chit ADN tng s ca các dòng ngô.
- Kho sát 29 ch th SSR trên 30 dòng ngô QPM, ánh giá h s PIC ca các mi.
- giá  thun ca các dòng ngô.
- ng di truyn gia các ngun vt liu.
- La chn  lai to gia các dòng có th  lai cao phc v công
tác chn to ging rung. STT
Tên
dòng
Mã kí
hiu
STT
Tên
dòng
Mã kí
hiu

L885
L23
4
L797
L4
14
L861
L14
24
L1521
L24
5
L804
L5
15
L863
L15
25
L889
L25
6
L817
L6
16
L867
L16
26
L891
L26
7

L880
L20
30
L2045
L30
18
Bảng 2.2: Danh sách 29 chỉ thị SSR sử dụng trong nghiên cứu
STT
Tên mồi
Trình tự mồi
Trình
tự lặp
lại
Kích
thƣớc
1
phi057
F: CATCAGTGCCGTCGTCCAT
R: CAGTCGCAAGAAACCGTTGCC
GCC
158-165
2
umc1066
F, GGAGCACGTCATCTCAATGG
R: GCAGCAGCAACGTCTATGACA
(GCCAG
A)5
127-135
3
phi299852

phi96342
F: GTAATCCCACGTCCTATCAGCC
R: TCCAACTTGAACGAACTCCTC
ATCC
234-250
9
umc1136
F: CTCTCGTCTCATCACCTTTCCCT
R: CTGCATACAGACATCCAACCAAAG
GCA
132-159
10
phi084
F: AGAAGGAATCCGATCCATCCAAGC
R:CACCCGTACTTGAGGAAAACCC
GAA
150-156
11
umc1196
F: CGTGCTACTACTGCTACAAAGCGA
R:AGTCGTTCGTGTCTTCCGAAACT
CACAC
G
137-161
12
phi029
F:TTGTCTTTCTTCCTCCACAAGCAGCGAA
R:ATTTCCAGTTGCCACCGACGAAGAACTT
AG/AGC
G***