TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN
===SQCQG3===
NGUYỄN NGỌC DIỆP
PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ
DÒNG NGÔ CÓ HÀM LƯỢNG PROTEIN CAO (QPM)
BÂNG CHỈ THỊ SSR
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC • • • •
Chuyên ngành: Dỉ truyền học
Người hướng dẫn khoa học ThS.
NGUYỄN VĂN TRƯỜNG
HÀ NỘI – 2015
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, ngoài sự nỗ lực phấn đấu của
bản thân, tôi còn nhận được rất nhiều được sự quan tâm, giúp đỡ và dìu dắt
tận tình của các Thầy Cô giáo, cán bộ tại phòng thí nghiệm của Viện Nghiên
cứu Ngô.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ths. Nguyễn Văn Trường đã dành
nhiều thòi gian, tâm huyết chỉ bảo, giúp tôi có thêm niềm đam mê với nghiên
cứu khoa học.
Tôi xin chân thành cản ơn các thầy giáo, cô giáo, cán bộ tong Bộ môn
Sinh học, Khoa Sinh - KTNN - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo
điều kiện thuận lợi cho tôi trong thòi gian thực tập tốt nghiệp vừa qua.
Tôi cũng xin cảm ơn các cán bộ phòng Công nghệ sinh học thuộc
Viện nghiên cứu Ngô đã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi có thể
hoàn thành khoá luận này.
Tôi xin gửi lòi cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những ngưòi luôn bên
cạnh động viên, quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực
hiện khóa luận này.
Mặc dù đã có nhiều cố gắng để thực hiện khóa luận một cách hoàn
chỉnh nhất. Song do buổi đầu làm quen với công tác nghiên cứu khoa học
nên không tránh khỏi những thiếu sót mà bản thân tôi chưa thấy được. Tôi

14, SSR Simple Sequence Repeat
15, Unweighted Pair Group Method using arithmetic
16, UPGMA
17, Averages ƯTL ưu thế lai
MỤC LỤC
6
18,
19,
20,
21,
22,
23,
24,
25,
26, MỞ ĐẦU
1. Đăt vấn đề
27, Ở Việt Nam, ngô được coi là cây trồng quan trọng thứ hai sau
cây lúa và là cây màu quan ttọng nhất được trồng ở nhiều vùng sinh thái
khác nhau, đa dạng về mùa vụ gieo trồng và hệ thống canh tác. Trong
khoảng hai thập niên gàn đây, do áp dụng các giống ngô lai vào canh tác
nên sản xuất ngô ở nước ta phát triển mạnh cả về diện tích, năng suất và sản
lượng. Theo số liệu thống kê năm 2013 của Tổng cục Thống kê [35] thì
diện tích ngô cả nước là
1172,5 nghìn ha bằng 101,37% so với năm 2012 (1156,6 nghìn ha),
năng suất bình quân đạt 44,3 tạ/ha và sản lượng ngô là 5193,5 nghìn
tấn, tăng 3,02% về năng suất và 4,42% về sản lượng so với năm
2012.
28, Công tác chọn tạo giống ngô lai của các nhà chọn tạo giống đã
đóng góp một phần rất lớn cho sự phát triển của nền sản xuất ngô trong việc
tạo ra các giống ngô lai mới có khả năng chống chịu với điều kiện ngoại

thiết kế sơ đồ lai tạo, giảm thiểu công việc trong công tác chọn tạo giống và
nhanh chóng chọn được những giống ngô lai QPM có năng suất cao, chất
lượng tốt phục vụ sản xuất.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
8
3.1. Ỷ nghĩa khoa học
33, Đánh giá đa dạng di truyền của các nguồn yật liệu ngô QPM,
giúp cung cấp số liệu, thông tin khoa học và tạo cơ sở lý luận cho công tác
nghiên cứu chọn tạo giống ngô QPM.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
34, Kết quả phân tích của đề tài sẽ rút ngắn thời
gian đánh giá dòng, giảm bớt khối lượng công việc
lai tạo trên đồng ruộng. Dựa trên cơ sở đa dạng di
truyền của các dòng ngô, các nhà chọn tạo giống có
thể chọn ra các dòng ưu tú phục yụ cho công tác chọn
tạo giống ngô có chất lượng protein cao.
9
35, CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ cơ SỞ KHOA
HỌC
1.1. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và Việt Nam
1.1.1. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới
36, Trong ba loại cây ngũ cốc phổ biến nhất là ngô, lúa mì và lúa
nước thì cây ngô (Zea mays L.) đang đứng đầu về năng suất và sản lượng,
đứng thứ hai về diện tích. Nhờ vai trò quan trọng trong nền kinh tế nên sản
xuất ngô trên thế giới luôn được quan tâm và ngày càng phát triển. Ngô
được trồng trên toàn thế giới vào khoảng 155,57 triệu hecta hàng năm với
sản lượng 803,69 triệu tấn. Ngô chiếm một vị trí quan trọng trong nền kinh
tế thế giới và thương mại thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và công nghiệp.
Hàng triệu người trên thế giới đang sử dụng ngô như một thực phẩm chủ
yếu và quan trọng do ngô có hàm lượng protein và calo cao (Vasal, 1999)

lên gần 15 tạ/ha vào đầu những năm 1990 (Nguyễn Văn
Ba, 2013) [1]. Tuy nhiên, ngành sản xuất ngô nước ta
thực sự có những bước tiến nhảy vọt là từ đầu những
năm 1990 đến nay, gắn liền với việc mở rộng giống
lai và cải thiện các biện pháp kỹ thuật canh tác.
Năm 1991, diện tích trồng giống lai chưa đến 1% trên
hơn 400 nghìn hecta trồng ngô thì đến năm 2007 giống
lai đã chiếm khoảng 95% trong số hơn 1 triệu hecta.
Năm 1994, sản lượng ngô Việt Nam vượt ngưỡng 1 triệu
tấn, năm 2000 vượt ngưỡng 2 triệu tấn và năm 2007 có
diện tích, năng suất, sản lượng đạt cao: diện tích
1.096,1 nghìn ha, năng suất 39,3 tạ/ha, sản lượng
vượt ngưỡng 4 triệu tấn và đến năm 2013, với diện
tích trồng ngô 1172,5 nghìn ha, năng suất đạt 44,3
tạ/ha và sản lượng vượt ngưỡng 5 triệu tấn (bảng 1).
Các giống ngô lai như LVN10, LVN4, LVN99 đã ừở
thành giống ngô chủ lực trong sản xuất ngô của Việt
Nam. Những thành công của chương trình ngô lai đã
góp phần quan trọng trong việc đưa năng suất ngô
trung bình cả nước năm 2013 đạt cao nhất từ trước
tới nay 44,3 tạ/ha, rút ngắn khoảng cách với năng
suất ngô trung bình của thế giới là 55,2 tạ/ha
(FAOSTART, 2015) [34].
41, _ r
42, Bảng 1.1: Diện tích, năng suât, sản lượng ngô ở Việt Nam giai
đoạn 2007 -
1
1
43,
44, Mặc dù sản xuất ngô trong nước liên tục tăng trưởng

9, 20
13
10,
Diện tích
(nghìn ha)
11, 1.0
96,1
12, 1.1
40,2
13, 1.08
9,2
14, 1.1
25,7
15, 1.1
21,3
16, 1.1
56,6
17, 1.1
72,5
18, Năng
suất (tạ/ha)
19, 39,
3
20, 40,
1
21, 40,1 22, 41,
1
23, 43,
1
24, 43,

dụng không được mở rộng. Để khắc phục những hạn chế trên, một chương
trình cải tạo dòng QPM thế hệ mới được đề cập ừên cơ sở chuyển gen
opaque-2 từ các dòng ngô thường. Giá tri dinh dưỡng thấp của nội nhũ và
chất lượng nông học kém của ngô có gen opaque-2 đã được sửa chữa thành
ngô có chất lượng protein cao với nội nhũ cứng được nghiên cứu bởi các
nhà khoa học của Trung tâm nghiên cứu ngô và lúa mì Quốc tế (CIMMYT)
qua chương trình tạo giống (Vasal và cộng sự, 1993; Vasal, 2002; Vivek và
cộng sự, 2008) [31], [32], [33]. Các nghiên cứu của các nhà khoa học làm
tăng hàm lượng gamma Zein trong ngô QPM, góp phàn tăng tỉ lệ nội nhũ
cứng, trong khi hàm lượng lizin và tryptophan vẫn tăng gấp đôi so với ngô
thường. Chất lượng protein của ngô có gen opaque-2 cao hơn ngô thường
43% và giá tri casein là 95% (Mertz, 1964, 1992) [25], [24].
48, Như vậy, QPM là ngô mang gen lặn o2o2 nhưng đã được sửa
chữa một số đặc tính như: nội nhũ mềm, chống chịu sâu bệnh và các điều
kiện bất thuận như hạn, đổ, úng, bị sâu mọt phá hoại nhiều khi bảo quản,
nhanh mất sức nảy mầm và năng suất thấp. Nhờ sử dụng hệ gen sửa chữa
trong quá trình lai truyền gen o2o2 thành công mà các đặc tính trên đã có
được như nội nhũ cứng, chống chịu với sâu bệnh và các điều kiện bất thuận
tốt hơn, chất lượng hạt ngô thương phẩm tốt, ít bị sâu mọt phá hoại hơn khi
1
3
bảo quản và nảy mầm tốt như ngô tẻ thường. Như vậy, ngô QPM có ưu
điểm như ngô tẻ thường về năng suất, khả năng chống chịu nhưng hàm
lượng và chất lượng protein cao hơn, đặc biệt là hàm lượng lizin và
tryptophan cao gấp đôi ngô thường.
49, Graham và cộng sự (1989) đã kết luận ngô QPM khi được sử
dụng là nguồn protein duy nhất cung cấp 60% năng lượng ttong khẩu phần
ăn của trẻ em [20]. Clark và cộng sự (1977) chứng minh rằng ngô mang cặp
alien o2o2 cũng cung cấp protein chất lượng ttong khẩu phần ăn của thanh
niên [18].

for Agricultural Research - ICAR), chọn giống bằng chỉ thị phân tử đã được
áp dụng để cải tiến phẩm chất protein của giống Vivek Hybrid 9. Vivek
Hybrid 9 đã được phát triển và cho thấy năng suất vượt trội hơn giống bố
mẹ ở các bang thuộc vùng Himalayan (58 tạ/ha), ở vùng bán đảo Ân Độ (54
tạ/ha). Hơn nữa, giống Vivek Hybrid 9 có phẩm chất tốt hơn với hàm lượng
lysine cao hơn 30% và hàm lượng tryptophan cao hơn 44%.
55, Chương trình chọn tạo giống ngô QPM ở Trung Quốc là một
trong những chương trình mạnh nhất ở châu Á, một số giống thụ phấn tự do
và giống lai đã được tạo ra như Zhongdan 206, Zhongdan 3850, Zhongdan
3710 đang được trồng ở phía Bắc. Cho đến nay diện tích ngô QPM tại
Trung Quốc đã mở rộng đến hàng trăng ngàn hecta. Kế hoạch sẽ mở rộng
diện tích ngô QPM đến 30% diện tích ngô của Trung Quốc vào năm 2020
(Gill, 2008) [19].
56, Chương trinh nghiên cứu chọn tạo giống và phát triển ngô
QPM của Việt Nam đã được triển khai có hiệu quả từ năm 1999 khi Viện
Nghiên cứu Ngô họp tác với CIMMYT và nhập nội một số nguyên liệu
QPM và lai tạo thành công giống lai đơn HQ2000 và đưa vào thử nghiệm
sản xuất. Giống HQ2000 mang nhiều đặc điểm nông học quý như chống đổ
1
5
tốt, sạch sâu bệnh, tiềm năng năng suất cao, đặc biệt có hàm lượng protein
cao.
57, Diện tích ngô lai HQ2000 nhanh chóng phát triển khi đưa
giống vào sản xuất, năm 2001 đạt 1.200 ha trên toàn quốc và trên 6.500 ha
năm 2003. Tuy nhiên, thực tế sản xuất cho thấy bên cạnh những đặc tính tốt
của giống thì HQ2000 vẫn tồn tại một số yếu điểm như tỷ lệ thối bắp cao,
chín chậm trong vụ đông, tỷ lệ hạt/bắp thấp, nhanh bị sâu mọt trong quá
trình bảo quản. Để khắc phục nhược điểm của giống ngô QPM nói chung và
giống HQ2000 nói riêng, một chương trình tạo dòng QPM thế hệ mới đã
được các nhà khoa học Viện Nghiên cứu Ngô khởi động và cho đến nay đã

62, + Chỉ thị phân tử dựa trên cơ sở lai DNA hay chỉ thị RFLP
63, + Các chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản DNA bằng kĩ thuật PCR
như RAPD, AFLP, SSR, STS
1.3.1.1. Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)
64, Kỹ thuật sử dụng chỉ thị RFLP là kỹ thuật nghiên cứu tính đa
hình chiều dài của các phân đoạn DNA dựa trên điểm cắt các enzym giới
hạn (Restriction Enzyme, RE). Khi ủ DNA với enzym giới hạn ữong dung
dịch đệm ở pH, nhiệt độ thích hợp sẽ tạo ra những phân đoạn DNA với kích
thước khác nhau, từ đó lập nên các bản đồ gen. Kỹ thuật này được sử dụng
phổ biến từ thập niên 80 đến nay.
65, Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên độ đặc hiệu của các
enzym cắt giới hạn đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA bộ gen. Sự
khác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau.
1
7
66, Chỉ thị RFLP là chỉ thị đồng hợp trội, nghĩa là có khả năng
biển hiện tất cả các alien của cùng một locus gen. Do vậy có thể phân biệt
được các cá thể đồng hợp tử và các cá thể dị hợp tử. Đây là ưu điểm của
loại chỉ thị này. Hạn chế của phương pháp này là tốn nhiều thời gian và
công sức, đòi hỏi trang thiết bị phòng thí nghiệm, đặc biệt là tiêu hao một
lượng lớn DNA mà số lượng đa hình thu được rất ít, thậm chí một số loài
còn khó nhận được đa hình.
1.3.1.2. Chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản DNA bằng kĩ thuật PCR
67, Phản ứng PCR được Kary phát minh ra năm 1985. Phản ứng
chuỗi polymerase thường được viết tắt là PCR (Polymerase Chain
Reaction). Nhờ vào việc phát hiện ra loại enzym chịu nhiệt (Taq
polymerase) được tách từ loài vi khuẩn Thermus aquatỉcus sống ở suối
nước nóng mà kĩ thuật PCR mới thật sự được ứng dụng và trở nên phổ biến.
68, Kỹ thuật PCR dựa ừên sự xúc tác của enzym Taq polymerase
để khuếch đại một đoạn DNA nhờ hai đoạn mồi oligonucleotide (primer)

hành nên phương pháp này hiện được dùng rất phổ biến trong nghiên cứu
cây trồng ở nước ta.
• Chỉ thị AFLP (Amplified Fragments Length Polymorphism)
71, Kỹ thuật AFLP được hiểu là sự đa dạng của các đoạn DNA
được nhân lên có định hướng sau khi bị cắt bởi 2 enzym giới hạn, sử dụng
những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR. Vos và
cộng sự đã phát triển kỹ thuật AFLP vào năm 1995. Kỹ thuật này là một
công cụ hữu ích để xác nhận nhiều locus của đa hình DNA mà không cần
biết trước thông tin về trình tự DNA của chúng (Michelmore và Meyers,
1998) [26]. Phương pháp này có thể đưa ra nhanh chóng một ước lượng độ
đa dạng di truyền trong và giữa những quần thể với nhau.
1
9
72, Ưu điểm của phương pháp AFLP là tốn ít thòi gian, không
phức tạp như RFLP nhưng vẫn khảo sát được toàn bộ gen. Các mồi sử dụng
cũng không càn đặc hiệu loài. Vì AFLP tạo ra một lượng lớn thông tin cần
phải được phân tích tự động nên cần sự trợ giúp của kĩ thuật máy tính cao.
Tuy nhiên thì AFLP là một chỉ thị trội, vì vậy không thể phân biệt được cá
thể đồng hợp và dị hợp.
• Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeats)
73, Trong cấu trúc hệ gen của sinh vật nhân chuẩn có những đoạn
DNA bao gồm những đoạn trình tự giống nhau và lặp đi lặp lại nhiều lần
gọi là các đoạn trình tự lặp lại. Trình tự trong cấu trúc các đoạn lặp lại gọi là
đơn vị lặp lại.
74, Có hai loại trình tự lặp lại là: 1) Trình tự lặp lại phân tán và 2)
Trình tự lặp lại liền kề (tendem repeat).
75, Số nucleotide trong một đơn vị lặp lại có thể tò hai đến hàng
ừăm base. Dựa vào số nucleotide trong một đơn vị lặp lại chia ra thảnh các
đoạn chỉ thị sau:
76, + Số nucleotide trong một đơn vị lặp lại nhỏ hơn 5 gọi là chỉ

cùng một quần thể hoặc các quần thể chéo nhau. Các nghiên cứu ở mức độ
phân tử cũng cho thấy mức độ đa dạng của ngô cao hơn 3 -10 làn so với
những loài thân thảo khác (Buckler và cs, 2001) [17]. Các nhà chọn giống
đã dựa vào sự đa dạng tự nhiên để lựa chọn các giống loài tốt, từ đó cải tiến
nhằm nâng cao chỉ tiêu về số lượng và chất lượng của giống. Ở ngô, năng
suất hiện tại cao gấp 55 lần so với năng suất của các giống ngô tổ tiên
(Buckler và cs, 2001) [17].
82, Xây dựng tập đoàn dòng thuần có khả năng kết hợp cao về
năng suất, ổn định chống chịu tốt với điều kiện bất thuận là một trong
những mục tiêu của chương trình tạo giống ngô lai. Ở ngô, nghiên cứu tính
2
1
đa hình tập đoàn dòng thuần và đánh giá khả năng chịu hạn là hai hướng
được tập trung nhiều nhất. Đe nghiên cứu tính đa hình di truyền ở ngô, một
ttong những chỉ thị di truyền được sử dụng rộng rãi là chỉ thị SSR. Chỉ thị
SSR có khả năng cung cấp đầy đủ thông tin về phả hệ, mức đa hình di
truyền, phân nhóm ưu thế lai, khả năng áp dụng tiện lợi và hữu ích (Bùi
Mạnh Cường, 2007) [4].
83, Năm 2003, Bantte và Prasanna [16] sử dụng 43 chỉ thị SSR
nằm trên toàn bộ 10 nhiễm sắc thể, vói ít nhất ba chỉ thị trên mỗi nhiễm sắc
thể, ngoại trừ trong trường hợp nhiễm sắc thể 6 và 10 cho nghiên cứu đa
dạng di truyền tập đoàn dòng ngô thuần. Tổng cộng 117 alien đã được phát
hiện trong 36 locus SSR, trung bình 3,25 alien mỗi locus. Các giá trị trung
bình PIC ước tính trên tất cả các locus SSR đa hình là 0,54. Bảy locus SSR
cho giá trị PIC là 0,70. Giá trị PIC có thể bị ảnh hưởng bởi các yếu tố khác
nhau như số dòng thuần phân tích, các locus SSR sử dụng và phương pháp
sử dụng để phát hiện alien.
84, Năm 2006, Li và cộng sự [22] đã nghiên cứu 46 dòng ngô,
trong đó có 22 dòng QPM từ CIMMYT và 24 dòng của Trung Quốc vói chỉ
thị SSR. Mục tiêu của nghiên cứu này là nghiên cứu sự đa dạng di truyền

dòng ngô nghiên cứu biến động từ 0,47 - 0,86 và được phân thành 3 nhóm
ưu thế lai [5].
89, Phan Xuân Hào và cộng sự (2004) [6] đã sử dụng 41 mồi SSR
để phân tích đa dạng di truyền của 88 dòng ngô (51 dòng có nguồn gốc Việt
Nam, 1 dòng từ Mỹ và 36 dòng từ CIMMYT). Trong đó có 16 dòng QPM,
6 dòng tham khảo từ AMBIONET. Kết quả xác định được sơ đồ phả hệ
giữa các dòng ngô nghiên cứu, phân chia bộ dòng thành 2 nhóm lớn.
Nghiên cứu cũng kết luận những dòng rút ra từ cùng một nguồn thì đứng
gần nhau trong sơ đồ phả hệ, các dòng QPM đứng gần nhau trong nhóm thứ
cấp.
2
3
1.3.3. ửng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống ngô QPM
90, Các bản sao và đặc tính của các gen opaque-2 tiếp theo được
phát hiện bởi ba mồi SSR (phi057, phill2 và umcl066) trong gen (Lin và
cộng sự, 1997) [23], dẫn đến sự khác biệt hiệu quả của gen trội 02 và gen
lặn o2 (Bantte và Prasanna, 2003) [16]. Mỗi một chỉ thị phân tử đánh dấu có
một đặc điểm khác nhau: các chỉ thị umcl066 và phi057 phát hiện được sự
có mặt của gen o2 (QPM) và 02 (ngô thường); chỉ thị phill2 chỉ phát hiện
được sự có mặt của gen 02 (ngô thường). Nếu nguồn ngô đó là QPM thì sẽ
không xuất hiện băng, do đó chỉ thị phil 12 phù hợp với các kiểu hình kiểm
tra của QPM (Babu và Prasanna, 2014) [15].
91, Dựa trên cơ sở các chỉ thị sinh học trên, Vergara và Cordova
đã áp dụng phương pháp biến đổi ngô thường thành ngô QPM từ năm 2008
tại CIMMYT bằng cách kết hợp phương pháp lai trở lại (backcross) truyền
thống và phương pháp chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử (MAS - Marker
Assisted Selection). Phương pháp này giúp các nhà tạo giống không cần
định kỹ phân tích sinh hóa đảm bảo lysin và tryptophan ở mỗi thế hệ YÌ sự
có mặt của gen opaque-2 đã được khẳng định bằng các chỉ thị, giúp rút ngắn
thòi gian cải tạo dòng và tránh sai số khi chọn gen mục tiêu [33]. Vì vậy

Mã kí
hiệu
2
4
107,
1
108,
L769
109,
LI
110,
11
111,
L845
112,
Lll
113,
21
114,L
882
115,
L21
116,
2
117,
L787
118,
L2
119,
12

135,
L797
136,
L4
137,
14
138,
L861
139,
L14
140,
24
141,L
1521
142,
L24
143,
5
144,
L804
145,
L5
146,
15
147,
L863
148,
L15
149,
25

165,
L872
166,
L17
167,
27
168,L
895
169,
L27
170,
8
171,
L837
172,
L8
173,
18
174,
L875
175,
L18
176,
28
177,L
918
178,
L28
179,
9

195,L
2045
196,
L30
197,
198, AMBIONET cung cấp các loại hoá chất thiết bị cần thiết khác
trong sinh học phân tử.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Tách chiết ADN tổng số của các dòng ngô.
- Khảo sát 29 chỉ thị SSR trên 30 dòng ngô QPM, đánh giá hệ số PIC của các
mồi.
- Đánh giá độ thuần của các dòng ngô.
- Phân tích đa dạng di truyền giữa các nguồn vật liệu.
- Lựa chọn sơ đồ lai tạo giữa các dòng có thể cho ưu thế lai cao
phục vụ công tác chọn tạo giống ừên đồng mộng.
199, S
TT
200,
Tên mồi
201, Trình tự mồi
202, Trì
nh tự lặp
lại
203, Kí
ch
204, thư
ớc
205, 1206, phi05
7
207, F: CATCAGTGCCGTCGTCCAT R: