Nghiên cứu khoa học

PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI
TRUYỀN HỆ GEN NHÂN
CỦA LOÀI MỠ HẢI NAM
(MANAGLIETIA
HAINANENSIS DANDY)
BẰNG CHỈ THỊ RAPD VÀ
cpSSR

.

Page 1 PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN HỆ GEN NHÂN CỦA LOÀI MỠ HẢI NAM (MANAGLIETIA
HAINANENSIS DANDY) BẰNG CHỈ THỊ RAPD VÀ cpSSR.
Nguyễn Hoàng Nghĩa, Trần Thanh Trăng

Mỡ Hải Nam (Manglietia hainanensis Dandy) là cây thường xanh, cao tới 25-30m, đường kính ngang ngực
25-35cm. Gỗ Mỡ Hải Nam được dùng làm đồ mộc gia dụng, cột nhà, là loài cây có giá trị kinh tế. Mỡ Hải Nam là
cây bản địa của miền Bắc Việt Nam, phân bố ở các tỉnh Yên Bái, Hà Giang, Tuyên Quang, Phú Thọ và ở miền
Trung như Thanh Hóa, Hà Tĩnh, Quảng Bình. Cây Mỡ Hải Nam không còn được phát hiện nhiều ở các rừng tự
nhiên, vì vậy việc bảo tồn nguồn gen cho Mỡ Hải Nam là điều cần thiết. Để phục vụ cho công tác bảo tồn nguồn gen
loài cây này, các nguồn giống từ Trung Quốc đã được nhập nội và gây trồng ở nước ta do vậy cần phải có sự đánh
giá về mức độ đa dạng di truyền của các xuất xứ thu thập từ các địa phương khác nhau, nhất là các nguồn gen được
thu từ Trung Quốc.
Phân tích đánh giá mức độ đa dạng di truyền của các loài cây lâm nghiệp đã được tiến hành nhiều ở Việt
Nam bằng việc sử dụng các chỉ thị phân tử, như nghiên cứu đa dạng di truyền các xuất xứ cây Lim xanh
(Erythrophloeum fordii Oliv.) (Quách Thị Liên và cs. 2004; Nguyễn Hoàng Nghĩa và cs., 2005), nghiên cứu mối
quan hệ di truyền của một số loài họ Dầu (Dipterocarpaceae) (Nguyễn Đức Thành và cs., 2005) và của 12 loài thuộc
chi Dầu (Dipterocarpus) (Nguyễn Thuý Hạnh và cs., 2005), phân tích đa dạng di truyền loài Sao hình lá tim (Hopea
cordata Vidal) (Nguyễn Hoàng Nghĩa và cs. 2006) và loài Gõ đỏ (Afzelia xylocarpa (Kurz) Craib.) (Nguyễn Hoàng
Nghĩa và cs., 2007).
Nghiên cứu này đánh giá mức độ đa dạng di truyền của 50 mẫu lá Mỡ Hải Nam thu thập từ các địa phương
khác nhau của Trung Quốc và Việt Nam dựa vào các chỉ thị RAPD và chỉ thị lục lạp cpSSR.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu nghiên cứu
Năm mươi mẫu lá cây Mỡ Hải Nam (Bảng 1) thu ở 3 vùng địa lý khác nhau của Trung Quốc và Việt Nam,
bảo quản trong tủ lạnh sâu -85°C được sử dụng làm vật liệu nghiên cứu. ADN của 50 mẫu lá Mỡ được tách chiết và
phân tích bằng chỉ thị RAPD. Sau khi phân tích bằng chỉ thị RAPD, ADN của 10 mẫu lá Mỡ Hải Nam (Bảng 1) đại
diện trong 3 nhóm được phân tích bằng chỉ thị cpSSR.


19 II
19
36 III
5-1
2 I
9
3 II
3
20 II
20
37 III
5-2
3 I
20
4 II
4
21 II
21
38 III
5-3
4 II
1

5 II
5
22 I
1
39 III
7-1
5 II

9
26 III
1-2
43 III
10-1
9 III
5-2

10 II
10
27 III
1-3
44 III
10-2
10 III
10-3

11 II
11
28 III
2-1
45 III
10-3

12 II
12
29 III
2-2
46 III
11-1

17
34 III
4-2(*Ký hiệu I: mẫu Mỡ Hải Nam thu từ Southern Jiangfeng Mountain – Trung Quốc, II: mẫu thu từ Tianlake
Jiangfeng Mountain – Trung Quốc, III: mẫu thu từ Ba Vì – Việt Nam)
Các mồi và enzyme sử dụng trong nghiên cứu
Bao gồm 5 mồi RAPD, một cặp mồi đặc hiệu đối với hệ gen lục lạp trnD – trnT (của hãng Fermentas), năm
enzyme hạn chế: BamHI, HaeIII, HinfI, PstI và TaqI được dùng để phân tích đa dạng di truyền của các mẫu lá Mỡ
trong nghiên cứu này. Trình tự nucleotide của các mồi RAPD và cặp mồi cpSSR với kích thước lý thuyết của phân
đoạn ADN trình bày trong Bảng 2.

Bảng 2. Trình tự nucleotide của 5 mồi RAPD và cặp mồi cpSSR sử dụng trong nghiên cứu
Mồi RAPD
TT Mồi Trình tự nucleotide TT Mồi Trình tự nucleotide
1 OPB10 5’CTGCTGGGAC3’ 4 RA159 5’GTCCACACGG3’
2 OPB18 5’CCACAGCAGT3’ 5 RA46 5’CCAGACCCTG3’
3 RA142 5’CAATCGCCGT3’
Mồi cpSSR
Tên mồi Trình tự các nucleotide
Kích thước lý thuyết
trnD 5’ACCAATTGAACTACAATCCC3’ 1600bp
trnT 5’CTACCACTGAGTTAAAAGGG3’ 1600bp

Phương pháp nghiên cứu
Tách chiết và chuẩn độ ADN
ADN của 50 mẫu lá Mỡ Hải Nam được tách chiết và tinh sạch theo phương pháp của Doyle và Doyle
(1990) có cải tiến. ADN sau khi tách chiết được kiểm tra trên gel Agarose 0,8%, xác định hàm lượng trên
máy đo quang phổ và pha loãng về nồng độ sử dụng 10ng/µl.

C–1 phút; Bước 2 đến bước 4 được lặp lại 34 chu kỳ; bước 5: 72
0
C–10 phút; bước 6: giữ sản phẩm ở 4
0
C (Heinze
2007).

Page 3 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
M 1 2 3 4 5 6 7 8 910 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
M 1 2 3 4 5 6 7 8 910 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
M 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50
M 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50
OPB10
RA46
Phản ứng cắt enzyme hạn chế: Sản phẩm PCR-cpSSR được cắt bằng các enzyme hạn chế với thành phần
như sau: 10 µl sản phẩm PCR, 2 µl 10X buffer, 2 µl enzyme và 6 µl ddH
2
O. Phản ứng cắt được thực hiện ở 37
0
C
trong thời gian 16 giờ.
Phân tích số liệu
Phân tích số liệu theo quy ước: 1= phân đoạn ADN xuất hiện và 0 = phân đoạn ADN không xuất hiện, khi
điện di sản phẩm RAPD với các mồi ngẫu nhiên. Xác định hệ số tương đồng di truyền theo phương pháp của Nei và
Li (1979).
hình
Tỉ lệ % đa hình PIC
1 OPB10 150 0 0,0 0,00
2 OPB18 400 4 1,00 0,54
3 RA142 200 0 0,0 0,00
4 RA159 250 2 0,80 0,15
5 RA46 550 3 0,55 0,34

Hình 1: Điện di sản phẩm PCR-RAPD trên gel Agarose 1,8% của hai mồi
c
b
a
a
Sij


2
2

Page 4 OPB10 và RA46
(M: Thang chuẩn ADN kích thước 1kb; 1-50: tên của các mẫu Mỡ như trong bảng 1)

Mối quan hệ di truyền giữa các mẫu Mỡ dựa trên phân tích kết quả RAPD
Kết quả phân tích với 3 mồi ngẫu nhiên ở 50 mẫu Mỡ Hải Nam cho thấy hệ số tương đồng di truyền của từng
cặp dao động trong khoảng từ 0,823 đến xấp xỉ 1,00. Mức độ khác nhau đựơc biểu hiện bằng hệ số sai khác di
truyền khi so sánh giữa các mẫu cây Mỡ. Để có bức tranh tổng quát về quan hệ giữa các mẫu nghiên cứu ở mức độ
phân tử, sự đa dạng di truyền được thể hiện trên sơ đồ hình cây (Hình 2).

II-2
II-10
II-11
II-12
II-13
II-3
II-17
I-9
III12-1
III11-2
III10-3
III12-3
III11-3
III5-2
III5-1
III11-1
III3-1
I-20
III4-3
III8-1
III5-3
II-15
II-16
II-18
II-14
III3-2
III9-2
III4-2
III4-1
III3-3

tối ưu hoá.

A

B
C
D
2

1 Page 6
Hình 3: Sản phẩm của cặp mồi trnD-trnT ở nhiệt độ bắt mồi 52
o
C (hàng trên) và 54
0
C (hàng dưới). M – thang
ADN 1 kb, các chữ số tương ứng là tên các mẫu được ký hiệu trong bảng 1
Sản phẩm PCR của cặp mồi trnD-trnT với độ dài khoảng 1600 bp. Kết quả này tương tự như các kết quả đã
được công bố bởi Pardo và cs. (2004) và Nicolosi và cs. (2000) khi họ dùng các cặp mồi này để nghiên cứu nguồn
gốc và phát sinh loài ở các loài thuộc họ cam quýt và cũng tương tự như kết quả được các tác giả đã công bố trước
đây khi dùng các cặp mồi này để khảo sát trên một số loài cây họ Dầu (Nguyyễn Thúy Hạnh, 2005). Sản phẩm của
cặp mồi này có độ dài tương tự nhau ở tất cả 10 mẫu nghiên cứu. Như vậy, về kích thước sản phẩm PCR của mồi
lục lạp không cho thấy sự đa hình giữa các mẫu (Hình 4).
Để khẳng định một lần nữa tính đa dạng của các sản phẩn cpSSR, một số enzyme hạn chế BamHI, HaeIII,
HinfI, PstI và TaqI đã được dùng để cắt các sản phẩm nhận được sau khi nhân bản. Nếu ở các mẫu có sự khác nhau


KẾT LUẬN
Trong phân tích đa dạng di truyền các mẫu cây Mỡ Hải Nam bằng chỉ thị RAPD, 5 mồi ngẫu nhiên được sử
dụng trong đó có 3 mồi cho tính đa hình về các phân đoạn ADN được nhân bản. Số phân đoạn nhân lên tương ứng
với 110 băng vạch và có 27 băng vạch cho tích đa hình về phân đoạn ADN nhân bản chiếm 24,5%. Mồi cho tính đa
hình cao nhất là OPB18, hai mồi RA142 và OPB10 không cho tính đa hình về phân đoạn ADN nhân bản.
Trong 50 mẫu Mỡ Hải Nam nghiên cứu, mẫu II-6 tách biệt so với 49 còn lại và có độ tương đồng là 58,3%.
Các mẫu còn lại có độ tương đồng dao động từ 83-100% và phân bố trong các phân nhóm nhỏ. Mặc dầu vậy sự đa
dạng di truyền cũng thể hiện ngay trong cùng một vùng địa lý thu thập mẫu: các mẫu thuộc cây mẹ III-1 và III-2
(xuất xứ Ba Vì) lập thành một nhóm khác biệt với các nhóm khác tới 16,5%, các mẫu thuộc các cây mẹ II-1, II-7, II-
5, II-8, II-21 và II-19 (xuất xứ Tianlake Jiangfeng) lập thành nhóm khác biệt với các nhóm khác khoảng 11%. Trong
khi đó, 3 mẫu thuộc xuất xứ Southern Jiangfeng (I) có hai mẫu I-9 và I-20 có độ tương đồng cao xấp xỉ 100% và có
sự khác biệt lớn so với mẫu I1. Một số mẫu có mức độ sai khác di truyền thấp bởi vì chúng được thu hái từ cùng cây
mẹ hoặc các cây mẹ có quan hệ di truyền gần gũi nhau (như các mẫu thu từ Ba Vì).
Trong 3 vùng nghiên cứu, các mẫu thuộc xuất xứ Ba Vì (trừ 2 cây mẹ III-1 và III-2 lập thành phân nhóm
riêng) tập trung trong các phân nhóm C và D với mức độ tương đồng cao, các mẫu nhóm thuộc xuất xứ Tianlake
Jiangfeng tập trung ở hai phân nhóm 1 và 2. Sự đa dạng di truyền thể hiện ngay trong cùng một vùng địa lí thu thập
mẫu.
Cặp mồi đặc hiệu cpSSR dùng trong phân tích ADN lục lạp của 10 mẫu Mỡ Hải Nam đã không chỉ ra tính
đa hình cả khi phân tích bằng các enzyme hạn chế. Kết quả nhận được cho phép khẳng định thêm sự bảo thủ di
truyền rất cao trong hệ gen lục lạp ở loài cây này.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Devos N, Tyteca D, Raspe O, Wesselingh R.A., and Jacquemart A.L. (2003) Patterns of chloroplast diversity among
western European Dactylorhiza species (Orchidaceae). Plant Syst Evol 243: 85-97.
Doyle J.J. and Doyle J.L. (1990) Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12: 13-15
Heinze B. (2007) A database of PCR primers for the chloroplast genomes of higher plants. Plants Methods 2007: 3-
4.
James R. F. (1998) NTSYSpc Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System Version 2.0. Exeter
software Setauket, New York: 11733-2870.


Nguyễn Thuý Hạnh, Nguyễn Đức Thành, Nguyễn Hoàng Nghĩa (2005) Nghiên cứu mối quan hệ di truyền của 12
loài thuộc chi Dipterocarpus (họ Dipterocarpaceae) dựa trên các chỉ thị phân tử. Kỷ yếu Hội nghị khoa học toàn
quốc “Công nghệ sinh học trong nghiên cứu cơ bản”, Trường Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội, 2005. 89-92.
Nicolosi E, Deng ZN, Gentle A., Mafa SL, Continella G, Tribulato E (2000) Citrus phylogeny and genetic origin of
important species as investigated by molecular marker. Theor Appl Genet 100: 1155-1166.
Pardo C, Cubas P, and Tahiri H (2004) Molecular phylogeny and systematics of Genista (Leguminose) and related
genera based on nucleotide sequences of nrDNA (ITS region) and cpDNA (trnL-trnF intergenic spacer). Plant Syst
Evol 244: 93-119.
Quách Thị Liên, Nguyễn Đức Thành, Nguyễn Hoàng Nghĩa (2004) Sử dụng các chỉ thị RAPD và ADN lục lạp trong
nghiên cứu quan hệ di truyền của một số xuất xứ cây Lim Xanh Erythrophleum fordii Oliv. Báo cáo khoa học, Hội
nghị toàn quốc 2004: Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nhà xuất bản Khoa học và Kĩ thuật:
464-468.
Ravinsanka KV., Lahitha A., Dinesh MR (2000) Assement of genetic relatedness among mango cultivals of India
using RAPD marker. Hort Sci Biot: 87 – 89.
Trương Quang Vinh, Nguyễn Thị Tâm, Đỗ Tiến Phát, Nguyễn Thanh Danh (2008) Đánh giá sự đa hình ADN một
số giống khoai tây (solanum tuberosum L.) bằng kỹ thuật RAPD. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông Thôn, số
1: 20-25.

GENETIC DIVESITY ANALYSIS OF MANAGLIETIA HAINANENSIS DANDY BY RAPD AND CPSSR
MARKERS
Nguyen Hoang Nghia, Tran Thanh Trang
Forest Science Institute of Vietnam
Do Tien Phat, Nguyen Van Phuong, Le Van Son, Chu Hoang Ha
Biotechnology Institute

Summary
Fifty leaf samples collected from a Manglietia hainanensis Dandy provenance trial established with different
provenances (two from China and one from Vietnam) were genetically analyzed by molecular markers (RAPD and
cpSSR markers) in order to suggest suitable measures for genetic conservation of the species in the future. Among