Nghiên cứu khoa học

PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI
TRUYỀN LOÀI GIỔI
XƯƠNG (MICHELIA
BAILLONII (PIERRE) FIN.
et GAGNEP.) BẰNG CHỈ
THỊ PHÂN TỬ RAPD VÀ
cpSSR
1
PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN LOÀI GIỔI XƯƠNG (MICHELIA BAILLONII (PIERRE) FIN.
et GAGNEP.) BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ RAPD VÀ cpSSR

Nguyễn Hoàng Nghĩa
Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam
Nguyễn Đức Thành, Lê Thị Bích Thuỷ
Viện Công nghệ Sinh học

TÓM TẮT
Giổi xương (Michelia baillonii (Pierre) Fin. et Gagnep.) là loài cây gỗ lớn thuộc họ Ngọc lan
(Magnoliaceae), có phân bố tự nhiên ở Nam Trung Quốc, Lào, Myanma và Việt Nam. Một số
xuất xứ Giổi xương đã được nhập từ Trung Quốc vào khảo nghiệm ở nước ta và việc đánh giá
đa dạng di truyền của các xuất xứ này là cần thiết. Nghiên cứu cho thấy các mẫu Giổi có mức độ

Báo cáo này trình bày kết quả phân tích đa dạng di truyền bằng kỹ thuật chỉ thị phân tử
RAPD và cpSSR đối với một loài cây rừng có tiềm năng của nước ta là loài Giổi xương từ các
nguồn giống được thu tại Việt Nam và Trung Quốc, góp phần làm tăng nền tảng di truyền của
loài phục vụ trồng rừng và bảo tồn.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu
26 mẫu Giổi gồm 23 mẫu Giổi xương: I16, I2, I4, I15, I19 (Puwen), II3, II4, II7, II14, II16
(Jiangcheng), III 2, III3, III6, III13, III14 (Menghai), IV10, IV12, IV13, IV14, IV15 (Jinghong), DL1,
DL2, DL3 (Đà Lạt) và 3 mẫu Giổi xanh: PT1, PT2, PT3 (Phú Thọ).
Mồi sử dụng cho nhân PCR là các mồi ngẫu nhiên RAPD của hãng OPERON (Mỹ) gồm: OPB17,
OPC13, OPC9, OPC8, OPC20 (bảng 1). Cặp mồi lục lạp trn S-trnfM của hãng Operon (Mỹ)
2

(bảng 2). Enzyme sử dụng cắt sản phẩm PCR của các mồi lục lạp của hãng Fermentas (Mỹ)
gồm: TagI, HinfI, HaeIII.

Bảng 1. Trình tự mồi RAPD
TT Tên mồi Trình tự
1 OPC1 5’- CTGCTGGGAC -3’
2 OPC13 5’-AAGCCTCGTC-3’
3 OPC8 5’- TGGACCGGTG -3’
4 OPC20 5’-ACTTCGCCAC-3’
5 OPB17 5’-AGGGAACGAG-3’

Bảng 2. Trình tự mồi lục lạp
TT Tên mồi lục lạp Trình tự
1 trn S
trnfM
5’-GGT TCG AAT CCC TCT CTC TC-3’

bước: 94
oC
- 4phút; 94
oC
- 1phút; 57
oC
- 1phút; 72
oC
- 2phút, lặp lại 45 chu kỳ từ bước 2 đến bước
4; 72
oC
- 7phút; giữ nhiệt độ ở 4
oC
. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5 %, quan sát
dưới đèn cực tím.
Phân tích số liệu
Các băng ADN được ghi nhận dựa trên sự có mặt hay vắng mặt của chúng ở các mẫu nghiên
cứu theo ADN chuẩn (ADN marker). Nếu có thì ký hiệu là 1, còn không có thì ký hiệu là 0. Các số
liệu này được đưa vào sử lý theo chương trình NTSYS pc để tính ma trận tương đồng giữa các
đôi mẫu (Rohlf, 1993). Việc tính toán ma trận tương đồng dựa trên công thức:
Jij

= a/(n-d)
a: Số băng ADN có ở hai dòng i và j
d: Số băng ADN không có băng cả hai dòng i và j
n: Tổng số băng thu được
Jij: Hệ số tương đồng Jaccard giữa hai dòng i và j
Sau đó các mẫu nghiên cứu được sử lý tiếp trong NTSYS - SIMQUAL để tính hệ số tương đồng
di truyền và được biểu hiện trên biểu đồ quan hệ di truyền giữa các mẫu Giổi xương.



Hình 2. Sản phẩm PCR ADN genome của các mẫu Giổi
với mồi OPC20 ( M: Marker, tiếp theo là các mẫu Giổi).
I16 I2 I4 I15 I19 II3 II4 II7 II14 II16 III III12 III13
I16
.
I2 I4 I15 I19 II3 II4 II7 II14
II16
III10 III12 III13
Hình 4. Sản phẩm PCR ADN genome của các mẫu Giổi
với mồi OPC13 ( M: Marker, tiếp theo là các mẫu Giổi) I16 I2 I4 I15 I19 II3 II4 II7 II14 II16 II2 III3 III6 III13 III14 IV10 IV12 IV13 IV14 IV15 DL1 DL2 DL3 PT1 PT2 PT3
M I16 I2 I4 I15 I19 II3 II4 II7 II14 II16 II2 III3 III6 III13 III14 IV10 IV12 IV13 IV14 IV15 DL1 DL2 DL3 PT1 PT2 PT3
M I16 I2 I4 I15 I19 II3 II4 II7 II14 II16 II2 III3 III6 III13III14 IV10 IV12IV13 IV14 IV15DL1DL2DL3PT1PT2 T3
Hình 3. Sản phẩm PCR ADN genome của các mẫu Giổi
với mồi OPB17
4
Kết quả phân tích các mồi lục lạp với enzym giới hạn
Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi lục lạp trnS-trnM của các mẫu Giổi cho thấy về kích
thước của sản phẩm nhận được phân đoạn đặc trưng và không có đa hình. Điều này cho thấy
mối quan hệ di truyền rất gần nhau của các mẫu Giổi. Để nhận biết rõ hơn về sự khác nhau giữa
các xuất xứ Giổi xương, sản phẩm PCR với cặp mồi lục lạp trên được tiếp tục cắt với 3 enzyme
TaqI, HinfI, HaeIII với mục đích tìm ra sự khác nhau trong trình tự ADN. Sau khi cắt enzyme, xét
về độ dài sản phẩm cắt enzyme của các mẫu Giổi, ở cặp mồi lục lạp trnS-trnM đều không có đa
hình. Không xuất hiện đa hình ở cặp mồi lục lạp trnS-trnM với các enzyme HinfI, TaqI và HaeIII
cho thấy trong các mẫu Giổi không có sự khác nhau trong trình tự gen trnS-trnM. Chứng tỏ gen
lục lạp của các mẫu Giổi có mối quan hệ di truyền rất gần nhau. Riêng 3 mẫu Phú Thọ (loài Giổi
xanh) không cắt được với enzym HaeIII, có thể là 3 mẫu này trong trình tự không có đoạn tương
ứng với đầu cắt của enzym đó vì đây là loài khác biệt.

Các sản phẩm PCR ADN lục lạp của các mẫu với mồi lục lạp không nhận được đa hình, chứng
tỏ về mặt tiến hoá thì các mẫu Giổi xương có cùng nguồn gốc (cùng loài) vì các đoạn gen lục lạp
rất bảo thủ và mang tính đặc trưng của loài. Để có thể phân tích sâu sắc và toàn diện hơn về sự
khác nhau giữa các dòng Giổi, nên tiếp tục phân tích các mẫu với một số mồi lục lạp khác và tất
cả các sản phẩm PCR với các mồi lục lạp cần được cắt với các enzym giới hạn với mục đích tìm
ra sự khác nhau trong trình tự cpADN.

KẾT LUẬN
Các mẫu Giổi nghiên cứu có mức độ đa dạng di truyền gen nhân cao có thể là do tác động của
điều kiện sinh thái lên các tính trạng thích nghi của từng vùng cụ thể trong một loài (Giổi xương)
để tạo nên các xuất xứ khác biệt nhau và đặc điểm khác biệt của loài Giổi xanh (các mẫu Phú
Thọ). Các xuất xứ Giổi có mối quan hệ di truyền rất khác nhau (hệ số tương đồng di truyền chỉ là
6

30%) và chia thành 4 nhóm chính, quan hệ di truyền khác nhau tới 45%. Nhóm 1 gồm phần lớn
các mẫu xuất xứ Puwen (I) và Jiangcheng (II) và hai xuất xứ này cũng tách riêng thành hai nhóm
phụ khác hẳn nhau. Nhóm 2 gồm các mẫu xuất xứ Đà Lạt và Phú Thọ, và hai xuất xứ này cũng

ADN lục lạp trong nghiên cứu quan hệ di truyền của một số xuất xứ cây Lim xanh (Erythrophleum
fordii Oliv.). Báo cáo khoa học, Hội nghị toán quốc 2004: Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong
khoa học sự sống. Nhà xuất bản Khoa học và Kĩ thuật: 464-468.
Rohlf F. J., 1993. “NTSYS-pc Numerical taxonomomy and multivariate analysis system”, Version
1.80. Applied Biostatitics, New York.
Saghai Maroof M. A., Biyashev R. M., Yang G. P., Zhang Q., Allard R. W., 1994, Extraodirnarily
polymorphic microsatellite DNA in barley: species diversity, chromosome location, and population
dynamics, Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 91: 5466-5470.
ANALYSIS OF THE GENETIC DIVERSITY OF MICHELIA BAILLONII (PIERRE) FIN et
GAGNEP. BY RAPD AND cpSSR MARKERS

Nguyen Hoang Nghia
Forest Science Institute of Vietnam
Nguyen Đuc Thanh, Le Thi Bich Thuy
Biotechnology Institute
SUMMARY
Michelia baillonii (Pierre) Fin. et Gagnep. is a species of Magnoliaceae which has its natural
distribution in south China, Laos, Myanmar and Vietnam. Some provenances of the species were
introduced for trials and evaluation of genetic their diversity is necessary. Twenty-three (23) leaf
7

samples collected from different provenances (three from China and one from Vietnam) of
Michelia baillonii and three samples of Michelia mediocris were genetically analyzed by RAPD
and cpSSR markers. Analysis has shown clear differences between provenances within Michelia
baillonii and between the two Michelia species. Genetic similarity between provenances was only
30% and they divided into four groups with a difference of 45% in genetic relationship. Group
No.1 includes samples from Puwen (I) and Jiangcheng (II) and these two provenances also