BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Trần Đức Trung Nghiên cứu đánh giá sự đa dạng di truyền các giống/dòng chè
(Camellia sinensis (L.) O. Kuntze) ở Việt Nam
bằng chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử microsatellite (SSR)

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Luận văn Thạc sỹ Công nghệ sinh học Người hướng dẫn khoa học: TS. Lã Tuấn Nghĩa

Hà Nội- 2009

itrường.
Nhândịpnày,tôicũngxingửilờicảmơnchânthànhtớicáccánbộ
công tác tại Viện Khoa học kỹ thu ật Nông‐Lâm nghiệp miền núi phía Bắc
(NOMAFSI)đãnhiệt
tìnhgiúpđỡtôitrongthờigianthuthậpsốliệuvàvật
liệunghiêncứutạiViện.
Tôixinchânthànhcảmơncáccánbộ,anhchịemtrongNhómnghiên
cứuĐad ạngditruyền
vàCôngnghệsinhhọcNôngnghiệp,ViệnDitruyền
Nôngnghiệp,đãgiúpđỡvàđộngviêntôitrong quátrìnhcôngtácvànghiên
cứukhoahọcvừaqua.
Cuốicùng,tôixinchânthànhcảmơngiađìnhvà
bạnbèđãnhiệttình
độngviên,giúpđỡtôitrongquátrìnhhọctập,nghiêncứukhoahọccũng
nhưtrongcuộcsống.
LuậnvănnàyđượcthựchiệnvớinguồnkinhphítừCh
ươngtrìnhCông
nghệsinhhọcNôngnghiệp.
Xinchânthànhcảmơn!
HàNội,tháng10năm2009


TrầnĐứcTrung
i

Lờicamđoan



Mở đầu
1
Chương 1: Tổng quan
4
1.1. Khái quát chung về cây chè Camellia sinensis (L.) O. Kuntze
4
1.1.1. Lược sử ngành sản xuất- chế biến chè trên thế giới
và Việt Nam 4
1.1.2. Nguồn gốc và phân bố của cây chè 5
1.1.3. Phân loại thực vật và
đặc điểm hình thái của cây chè 8
1.1.4. Đặc điểm di truyền của cây chè
Camellia sinensis (L.) O. Kuntze 14
1.1.5. Ngành sản xuất, chế biến chè trên thế giới và Việt Nam 17
1.1.6. Công tác lai tạo giống chè 19
1.1.6.1. Phương pháp truyền thống 19
1.1.6.2. Áp dụng công nghệ sinh học
trong chọn tạo giống chè 21
1.2. Chỉ thị trong đánh giá đa dạng di truyền 22
1.2.1. Chỉ thị hình thái 23
1.2.2. Chỉ thị
hóa sinh 24
1.2.3. Chỉ thị DNA 25
1.2.3.1. Chỉ thị dựa trên cơ sở lai DNA- chỉ thị RFLP
(Restriction Fragment Length Polymorphism) 29
1.2.3.2. Chỉ thị DNA ngẫu nhiên 30
1.2.3.3. Chỉ thị DNA dựa trên đa hình các vị trí nhận biết
giới hạn 31
1.2.3.4. Chỉ thị DNA dựa trên các trình tự lặp 33

ền chè bằng chỉ thị SSR 73
3.2.1. Trích ly DNA tổng số 73
3.2.2. Nhận dạng di truyền chè bằng chỉ thị SSR 75
3.2.3. Phân tích tính đa dạng di truyền của các locus SSR 81
3.2.4. Phân tích đa dạng di truyền giữa 9 quần thể chè
bằng chỉ thị SSR 84
3.2.5. Phân tích đa dạng di truyền 96 giống/dòng chè
bằng chỉ thị SSR 91
3.2.5.1. Phân nhóm di truyền dựa trên
mức độ tương đồng Jaccard 92
3.2.5.2. Phân nhóm di truyền dựa trên
khoảng cách di truyền Nei72 98
3.3. Kết hợ
p chỉ thị hình thái và chỉ thị SSR
trong phân tích đa dạng di truyền các giống/dòng chè 106
Kết luận và kiến nghị
109
Tài liệu tham khảo
111
Phụ lục
122
iv


Bảng chữ viết tắt
AFLP Amplification Fragment Length Polymorphism
APS Amonium persulfate
CAPs Cleaved Amplification Polymorphism Sequence
cs Cộng sự
CTAB Cetyl trimethylammonium bromide

Bảng 2.2: 9 quần thể chè nghiên cứu 52
Bảng 2.3: Danh sách các cặp mồi SSR sử dụ
ng trong nghiên cứu 53
Bảng 2.4: 12 đặc điểm hình thái được sử dụng để đánh giá
các giống/dòng chè 56
Bảng 2.5: Thành phần phản ứng SSR-PCR 59
Bảng 2.6: Thành phần gel polyacrylamide 12% 60
Bảng 3.1: Giá trị đặc trưng của 90 thành phần trong phân tích PCA
(khoảng cách di truyền Euclidean của 90 giống/dòng chè) 71
Bảng 3.2: Tần số alen của 21 locus SSR 82
Bảng 3.3: Thống kê các chỉ số đa dạng di truyền của 21 locus SSR 83
Bảng 3.4: Kết quả đánh giá đa dạng di truyền giữa 9 quần thể chè 85
Bảng 3.5: Khoảng cách di truyền giữa 9 quần thể chè nghiên cứu 87
Bảng 3.6: Giá trị đặc trưng của 96 thành phần trong phân tích PCA
(khoảng cách di truyền Nei72 của 96 giống/dòng chè) 102

vi


Danh mục hình ảnh minh họa

Trang
Hình 1.1: Các nước trồng chè dựa vào sản lượng được thống kê
năm 2007 7
Hình 1.2: Phân bố tự nhiên các thứ chè theo Stuart (A) và Barua (B) 10
Hình 1.3: Cây chè Trung Quốc (C.sinensis var. sinnensis) 12
Hình 1.4: Cây chè Assam (C. sinensis var. assamica) 13
Hình 1.5: Cây chè Cambod (C. sinensis var. assamica sub sp.
lasiocalyx) 13
Hình 1.6: Tiêu bản nhiễm sắc thể ở kỳ giữa của cây chè

cho mồi CamsinM6 (SSR-6) 75
Hình 3.10: Ảnh điện di xác định nhiệt độ gắn mồi tối ưu
cho mồi MSCjaH46 (SSR-17) và MSCjaF37 (SSR-20) 76
Hình 3.11: Kết quả nhận dạng di truyền 96 giống/dòng chè
bằng chỉ thị SSR CamsinM1và CamsinM4 77
Hình 3.12: Kết quả nhận dạng di truyền 96 giống/dòng chè
bằ
ng chỉ thị SSR CamsinM8 và CamsinM13 78
Hình 3.13: Kết quả phản ứng PCR của 96 giống/dòng chè
với 21 cặp mồi SSR 80
Hình 3.14: Sơ đồ phân nhóm di truyền 9 quần thể chè
dựa trên khoảng cách di truyền Nei72 88
Hình 3.15: Phân tích PCA biểu diễn quan hệ nhóm của 9 quần thể chè
trong không gian ba chiều 88
Hình 3.16: Sơ đồ cây phân loại 96 giống/dòng chè
bằng phương pháp UPGMA 94
Hình 3.17: Phân tích PCA 96 giống/dòng chè thuộc 9 quần thể chè
dựa trên mức độ tương đồng di truyền Jaccard 97
Hình 3.18: Sơ đồ cây phân nhóm 96 giống/dòng chè
bằng phương pháp Weighted- Neighbor Joining 99
Hình 3.19: Phân tích PCA 96 giống/dòng chè thuộc 9 quần thể chè
dựa trên khoảng cách di truyền Nei72 103
Hình 3.20: Cây phân nhóm 96 giống/dòng chè
dựa trên khoảng cách di truyền Nei72
(xây dựng bằng phần mềm PHYLIP 3.69 và Dendroscopes) 105
1
Luậnvănthạcsỹcôngnghệsinhhọc

đang được áp dụng rộng rãi không chỉ trong chọn tạo giống cây trồng mà còn
2
Luậnvănthạcsỹcôngnghệsinhhọc
Trần Đức Trung – Cao học CNSH khóa 2007-2009, ĐH Bách khoa Hà Nội
cả trong chăn nuôi. Nhờ các chỉ thị phân tử mà các nhà khoa học xác định
được sự khác biệt về mặt di truyền của quần thể giống khởi đầu, từ đó xác
định các cặp lai có khoảng cách di truyền phù hợp có thể cho ưu thế lai cao
nhất. Việc tiếp cận ở mức độ phân tử cho phép đánh giá các giống bố mẹ một
cách chính xác, không bị tác động bởi các điều kiện ngo
ại cảnh, rút ngắn thời
gian và nâng cao hiệu quả công tác lai tạo.
Ở Việt Nam, cây chè và các sản phẩm từ chè đã được người dân trồng và
chế biến từ lâu. Nước ta có nhiều vùng trồng và chế biến chè nổi tiếng như
Mộc Châu, Thái Nguyên hay B’lao- Lâm Đồng, cùng với nhiều giống chè quý
như chè Shan ở Hà Giang, Suối Giàng; chè Tân Cương ở Thái Nguyên… Bên
cạnh đó, nhằm đáp ứng nhu cầu phát triển của ngành sản xuất chế
biến chè,
nhiều giống/dòng chè đã được nhập từ các nước trên thế giới như Ấn Độ,
Srilanka, Trung Quốc, Nhật Bản… Đây là nguồn vật liệu rất có giá trị đối với
chương trình chọn tạo giống chè.
Hiện nay cây chè được xác định là một trong những cây trồng chủ lực
trong quy hoạch phát triển kinh tế các tỉnh trung du và miền núi phía Bắc
nước ta. Tuy nhiên, để thâm canh cây chè đạt hiệu quả cao, tránh lãng phí
trong đầu tư ban đầu thì việc phải có những giống chè cho năng suất cao, chất
lượng tốt, phù hợp với điều kiện khí hậu- thổ nhưỡng là một yêu cầu cần được
quan tâm. Trong bối cảnh đó, công tác đánh giá đa dạng di truyền cây chè ở
nước ta- có vai trò rất quan trọng trong khai thác hiệu quả nguồn gen, vẫn còn
nhiều hạn chế. Cho đến nay việc nghiên cứu đánh giá sự đa d
ạng nguồn gen
cây chè trên quy mô lớn để có thể cung cấp cơ sở di truyền ban đầu và hỗ trợ

1.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ CÂY CHÈ Camellia sinensis (L.) O.
Kuntze
1.1.1. Lược sử ngành sản xuất- chế biến chè trên thế giới
và Việt Nam
Chè từ lâu đã quen thuộc với đời sống của người dân các nước châu Á.
Các tài liệu của Trung Quốc đều cho rằng cây chè được phát hiện một cách
tình cờ bởi Thần Nông (một vị vua trong truyền thuyết) vào khoảng năm 2737
trước Công nguyên. Tuy nhiên, cũng có những giả thuyết cho rằng ngay khi
người Trung Qu
ốc biết đến các giá trị y học của cây chè thì nhu cầu về các
sản phẩm từ chè đã nảy sinh và cùng với đó là sự ra đời ngành trồng và chế
biến chè ở tỉnh Tứ Xuyên- Trung Quốc từ cách nay khoảng 3000 năm. Về
sau, kiến thức về canh tác cây chè đã được phổ biến rộng rãi cùng với những
cuộc hành hương và di cư của các tín đồ đạo Phật, từ rất lâu trước khi sự
phát
tán cây chè được ghi nhận.
Tại Ấn Độ năm 1823, thiếu tá Robert Bruce tìm thấy cây chè dại đầu tiên
ở tỉnh Assam, nhưng cho đến năm 1834, các hạt giống chè vẫn được nhập từ
Trung Quốc (bởi Gordon) để phục vụ nhu cầu thành lập các vườn trồng chè
thương mại. Về sau, các cây chè bản xứ đã được đưa vào trồng nhiều hơn nhờ
C.A. Bruce, người quản lý trang trại chè thuộc chính phủ Anh tạ
i thuộc địa
Ấn Độ. Lợi ích thương mại từ cây chè ngày càng gia tăng và cho đến 12-02-
1839, công ty chè đầu tiên- Công ty chè Assam- đã được thành lập ở Jorhat,
Assam dưới sự điều hành của Nghị viện Anh. Đây chính là mốc đánh dấu sự
ra đời ngành công nghiệp chè ở Ấn Độ cũng như trên thế giới [47]. Hiện nay
trên toàn thế giới đã có hơn 30 quốc gia trồng và sản xuất chè, trong đó tập
5
Luậnvănthạcsỹcôngnghệsinhhọc
Trần Đức Trung – Cao học CNSH khóa 2007-2009, ĐH Bách khoa Hà Nội

Luậnvănthạcsỹcôngnghệsinhhọc
Trần Đức Trung – Cao học CNSH khóa 2007-2009, ĐH Bách khoa Hà Nội
giống, đất đai và nguồn lao động, chè được xác định là ngành kinh tế chủ đạo
ở các tỉnh trung du và miền núi nước ta [2, 6, 78]
1.1.2. Nguồn gốc và phân bố của cây chè
Cho đến nay, nguồn gốc phát sinh chính xác của cây chè vẫn còn là đề
tài tranh cãi của các nhà nghiên cứu. Tuy nhiên, tất cả đều khẳng định rằng
Đông Nam Á là quê hương khởi nguồn của cây chè. Theo Wight (1959), xuất
phát điểm nguyên thủy của cây chè được cho là ở khoảng 29 độ vĩ B
ắc và 98
độ kinh Đông, thuộc vùng thượng nguồn sông Irrawaddy- là vùng đất giao
nhau giữa Assam, bắc Myanmar, tây nam Trung Quốc và Tây Tạng. Trong
khi đó, trong một nghiên cứu công bố sớm hơn, Kingdon và Ward (1950) lại
cho rằng xuất phát điểm của cây chè là ở đông nam Trung Quốc, vùng tiếp
giáp với hai bang Mizoram và Meghalaya ở đông bắc Ấn Độ (tỉnh Vân Nam).
Bởi vậy, các khu vực địa lý trên đều được xem như là nơi khởi nguồn và phát
tán của chi Camellia nói chung (Sealy, 1958) [46, 47]. Khoảng 20 n
ăm sau,
trong những nghiên cứu phân loại cây chè dựa trên thành phần catechin,
Djemukhatze (1961-1976) đã kết luận rằng thành phần catechin chủ yếu của
các giống chè dại Việt Nam đơn giản và gần giống nhất với các giống chè
mọc hoang dại từ cổ xưa. Từ đó ông đưa ra kết luận mới: nguồn gốc của cây
chè chính là ở Việt Nam [1, 2, 78].
Các kết luận trên có được từ những nghiên cứu khác nhau và mặc dù
ch
ưa có một thống nhất cuối cùng về nguồn gốc thì ngày nay cây chè đã được
phổ biến rãi tới nhiều quốc gia và vùng địa lý trên thế giới, trải rộng từ 45 độ
vĩ Bắc đến 34 độ vĩ Nam, thích nghi với nhiều tiểu vùng khí hậu khác nhau và
khác xa với khu vực nguyên sản ban đầu (Đông Nam Á) (hình 1.1)
7

lái buôn người Anh đã du nhập và trồng thành công cây chè ở châu Âu
(Aiton, 1789; Booth, 1830); từ đây, cây chè được du nhập vào các nước châu
Phi vào cuối thế kỷ 19. Ngày nay, cây chè đã được trồng ở hơn 52 quốc gia
trên toàn thế [47].
1.1.3. Phân loại thực vật và đặc đi
ểm hình thái của cây chè
Carl Linnaeus (1707-1778)- nhà động-thực vật học người Thụy Điển- là
người đầu tiên xây dựng hệ thống phân loại thực vật trong đó có cây chè.
Trong cuốn sách “Các loài thực vật” (The Species of Plant) xuất bản năm
1753, Carl Linnaeus đã đề xuất chi Camellia thay cho Thea như trước đây để
tưởng nhớ những đóng góp của Georg Kamel (tên Latin là Camellia ) đối với
ngành thực vật học (Georg Kamel (?-1708) là một thầy tu dòng Jesuit ngườ
i
Czech đã có nhiều khám phá về thực vật trong thời gian truyền giáo ở các
nước châu Á như Philippin, Trung Quốc ). Cũng trong cuốn sách này, Carl
Linnaeus đã mô tả hai loài trong chi Camellia là cây chè Camellia sinensis
(sinensis trong tiếng Latin có nghĩa là Trung Quốc- lúc đó được cho quê
hương của cây chè) và cây chè (hoa) Camellia japonica. Đến năm 1958, trong
cuốn chuyên khảo “A Revision of the Genus Camellia”, J. Robert Sealy đã hệ
thống lại và định danh cho các loại thực vật liên quan tới chi Camellia đã
được nhận dạng vào lúc đó. Ông phân chia chi Camellia ra 12 nhóm và mô tả

đặc điểm hình thái của 87 loài [56]. Ngày nay, các nhà khoa học thừa nhận
Camellia C. L. là một chi trong hệ thống phân loại thực vật và tên khoa học
chính thức của cây chè là Camellia sinensis (L.) O. Kuntze (để tưởng nhớ nhà
thực vật học người Đức Otto Carl Ernst Kuntze, 1843-1907) [16].
9
Luậnvănthạcsỹcôngnghệsinhhọc
Trần Đức Trung – Cao học CNSH khóa 2007-2009, ĐH Bách khoa Hà Nội
Trong chi chè Camellia có đến hơn 100 loài khác nhau [80, 81], bao gồm

Hệ thống phân loại này phân chia các giống chè theo vùng địa lý rất rõ
ràng (hình 1.2). Tuy nhiên về sau, khi bản chất di truyền pha trộn của cây chè
được nghiên cứu kỹ hơn thì hai thứ chè Trung Quốc lá to và chè Shan được
cho là dạng lai giữa hai thứ chè Trung Quốc và Assam. Đặc điểm hình thái
của chè Trung Quốc lá to (giống với thứ chè Trung Quốc lá nhỏ) và chè Shan
(giống với thứ chè Assam) có thể là do sự pha trộn vật chất di truyền không
cân bằng tại các vùng địa lý mà chè Trung Quốc lá nhỏ chiế
m ưu thế (nam
Trung Quốc) hoặc chè Assam chiếm ưu thế (Đông Nam Á).
Hệ thống phân loại các thứ chè theo Stuart hiện nay vẫn được áp dụng
rộng rãi ở Việt Nam. Tuy nhiên, trên thế giới cách phân loại này ít được sử
dụng. Một số cơ sở dữ liệu về phân loại thực vật chỉ công nhận chè Trung
Quốc và Assam là hai thứ chè thuộc loài chè Camellia sinensis (L.) O.
Kuntze. Các thứ chè khác tuy được liệt kê nhưng không được công nhận
chính thức. Theo cơ sở dữ liệu ITIS (Integrated Taxonomic Information
System), cây chè được phân loại như sau [12]:
Giới thực vật – Plantae
Ngành hạt kín – Magnoliophyta
Lớp hai lá mầm – Magnoliopsida
Bộ chè - Theales
Họ chè – Theaceae
Chi chè – Camellia
Loài chè – Camellia sinensis (L.) O.Kuntze
Thứ/giống - Camellia sinensis var. assamica
Camellia sinensis var. sinensis
12
Luậnvănthạcsỹcôngnghệsinhhọc
Trần Đức Trung – Cao học CNSH khóa 2007-2009, ĐH Bách khoa Hà Nội
Như vậy, theo cơ sở dữ liệu này, cây chè có hai thứ chính có tên khoa học đã
được công nhận là thứ chè Assam- Camellia sinensis var. assamica (Masters)

Luậnvănthạcsỹcôngnghệsinhhọc
Trần Đức Trung – Cao học CNSH khóa 2007-2009, ĐH Bách khoa Hà Nội
đưa vào canh tác sớm nhất. Các giống chè Trung Quốc là nguyên liệu chủ yếu
để chế biến chè xanh.
Thứ chè Assam (C. sinensis
var. assamica): Cây cao từ 10 đến 15
m với hệ thân đẻ nhánh mạnh. Lá
tương đối lớn và mỏng, bề mặt bóng
với chóp lá biến đổi từ dạng tù đến
nhọn. Lá có hệ gân mép nổi rõ và bản
lá có hình elip rộng. Lá chè giống
Assam thường dài 8-20 cm và rộng
3,5-7,5 cm. Hoa thường mọc đơn lẻ
hoặc theo c
ặp có 3 lá bắc con màu
xanh. Hoa có nhiều nhị, 5-6 lá đài bền
với 7-8 cánh hoa màu trắng (hình 1.4).
Camellia sinensis var. assamica là thứ
chè bản địa vùng Assam-Ấn Độ được
tìm ra vào thế kỷ 19. Các giống chè
Assam được sử dụng chế biến chè đen.
Thứ chè Cambod (C. sinensis
var. assamica sub sp. lasiocalyx):
Thân cây đứng thẳng cao 6-10 m, ít
phân nhánh, các cành thường phát triển
ngang. Lá mọc thẳng đứng có màu biến
thiên từ xanh nhạt đến vàng đồng hay
đỏ phớt hồng, mặ
t lá bóng. Kích thước
lá trung gian giữa thứ chè Trung Quốc

1pg= 980Mbp nên kích thước bộ gen chè theo kết quả của Hanson vào
khoảng 15.298 Mbp [47]. Tuy nhiên gần đây, nghiên cứu của Tanaka và
Taniguchi (năm 2007) trên các giống chè Nhật Bản lại cho thấy kích thước bộ
gen của cây chè được ước tính khoảng 4 Gbase [63]. Nghiên cứu tế bào học
các giống chè của Kondo (1979) đã xác định cây chè là loài thực vật lưỡng
bội (2n=30, số nhiễm sắc thể cơ sở là 15) và kiểu nhân (karotype) biến đổi
15
Luậnvănthạcsỹcôngnghệsinhhọc
Trần Đức Trung – Cao học CNSH khóa 2007-2009, ĐH Bách khoa Hà Nội
khác nhau giữa các giống chè [36] (hình 1.6); điều này đã khẳng định lại kết
quả nghiên cứu của Bezbaruah (1971) với các giống chè Ấn Độ [47].

Hình 1.6: Tiêu bản nhiễm sắc thể ở kỳ giữa của cây chè
(C.sinensis var. sinensis).
Kiểu nhân 1: 2n=30=18m=12sm
Kiểu nhân 2: 2n=30=21m+6sm+2sm
sat
+1
st

Kiểu nhân 3: 2n=30=21m+2m
sat
+5sm+2sm
sat

Kiểu nhân 4: 2n=30=20m+10sm
Kiểu nhân 5: 2n=30=18m+2m
sat
+6sm+1sm
sat