Nghiên cứu chế tạo Multiplex PCR mix phát hiện đồng thời hai tác nhân
Chlamydia trachomatis và Neissera gonorrhoeae
P. H. Van
(1)
, N. P. N. Ha
(2)
, N. T. M. Thu
(3)
, D. T. T. Thuy
(4)
Tóm tắt
Với hai chủng vi khuẩn N. gonorrhoeae và C. trachomatis trong tay, các tác giả đã nghiên cứu thành
công để chế tạo được multiplex PCR mix phát hiện đồng thời hai tác nhân vi khuẩn trên với độ nhạy phát
hiện từng tác nhân riêng lẻ đạt đến 1 DNA bộ gen vi khuẩn trong thể tích phản ứng, và độ nhạy phát hiện
hai tác nhân vi khuẩn trong cùng một phản ứng được tiên đoán là rất thuận lợi trong thực tế trên bệnh
nhân.
Summary
“Prepare the Multiplex PCR mix detecting Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae
sulmutaneously” With two strains of N. gonorrhoeae and C. trachomatis in hand, the authors have
prepared successfully the multiplex PCR mix detecting these two bacteria sulmutaneously with the
sensitivity in detecting these bacteria separately reaches 1 DNA genome of the target bacteria in the
volume of reaction; and the study also revealed that the sensitivity in detecting Chlamydia trachomatis
and Neisseria gonorrhoeae simultaneously is favored for the detecting of these bacteria from infected
patients.

Đặt vấn đề
C. trachomatis và N. gonorrhoeae là hai tác
nhân vi khuẩn gây nhiễm trùng đường sinh dục rất
thường gặp với các hậu quả cũng khá nặng nề nếu
không phát hiện và chữa trị
(1,2)

chúng tôi đã có kit phát hiện C. trachomatis
nhưng vì hiện vẫn có nhiều khách hàng muốn
được chúng tôi cung cấp thêm kit PCR phát hiện
đồng thời C. trachomatis và N. gonorrhoeae cho
tiện sử dụng, nên đơn vị R&D của chúng tôi cũng
đã đặt ra mục tiêu chế tạo kit PCR phát hiện đồng
thời hai tác nhân này. Mục tiêu của công trình này
là tìm hiểu độ nhạy cảm và độ đặ
c hiệu của kit
PCR này trên các chủng vi khuẩn C. trachomatis
và N. gonorrhoeae thật sự.
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Mẫu thử trong nghiên cứu là các trích biệt
DNA từ các huyền dịch vi khuẩn N. gonorrhoeae
và C. trachomatis. Vi khuẩn N. gonorrhoeae là
chủng vi khuẩn được phân lập trên bệnh nhân,
được định danh chính xác nhờ hình ảnh song cầu
Gram [-], tính chất oxidase [+], và chỉ lên men
đường glucose trong thử nghiệm lên men đường
nhanh Cummitech 4. Vi khuẩn được phòng R&D
của công ty Nam Khoa bảo quản
ở -70
o
C. Để
chuẩn bị cho thử nghiệm, vi khuẩn được cấy phân
lập lại trên thạch nâu, ủ 37
o
C trong tủ ấm CO
2


-5
, và 10
-6
được đặt tên là G
0
, G
1
,
G
2
, G
3
, G
4,
G
5
và G
6
tương đương 10
4
/10µl,
10
3
/10µl, 10
2
/10µl, 10/10µl, 1/10µl và 0.1/10µl.
Vi khuẩn C. trachomatis là hai dòng vi khuẩn 1 và
2 xin từ Khoa Sinh Học, Đại Học Royal Holloway
thuộc Đại Học London, Anh. Hai dòng này được
cung cấp dưới dạng huyền dịch có nồng độ vi

trachomatis và N. gonorrhoeae do phòng R&D
của công ty Nam Khoa điều chế gồm các thành
phần chính: Taq polymerase và PCR buffer của
Biorad, dNTP của Roche, dUTP và UNG của
Amersham, mồi
đặc hiệu (đặt Invitrogen tổng
hợp) cho đoạn DNA dài 241bp trên crytic plasmid
của C. trachomatic, mồi đặc hiệu (đặt Invitrogen
tổng hợp) cho đoạn DNA dài 390bp trên crytic
plasmid của N. gonorrhoeae, MgCl
2
của Biorad.
Có hai loại multiplex PCR mix được pha, loại
chứa hàm lượng mồi 50pm/thể tích phản ứng, và
loại chứa hàm lượng mồi 25pm/thể tích phản ứng.
Hai loại PCR mix này được đặt tên là Multiplex
CHL-GNC PCR mix 50pm và Multiplex CHL-
GNC PCR mix 25pm. Thể tích của PCR mix là
40µl, để thể tích của mẫu thử cho vào là 10µl, và
như vậy thể tích phản ứng là 50µl.
Trước hết chúng tôi tìm hiểu phương pháp
trích biệt DNA của huyền dịch C. trachomatis
bằng ph
ương pháp BOOM và bằng phương pháp
đun cách thuỷ, phương pháp nào tốt hơn?. Đồng
thời chúng tôi cũng tìm hiểu hàm lượng mồi 50pm
và 25pm đặc hiệu C. trachomatis và N.
gonorrhoeae, hàm lượng nào cho kết quả khuếch
đại tốt hơn?. Để trả lời hai câu hỏi này chúng tôi
thực hiện thử nghiệm PCR với các mẫu trích biệt

10
C (-) 10

Các PCR mix sau khi đã cho các mẫu thử
được cho vào máy PCR, chúng tôi sử dụng máy
iCycler loại Dual-block của Biorad, và chạy PCR
theo chương trình luân nhiệt sau: 40
o
C/10 phút,
95
o
C/5 phút, 40 chu kỳ 94
o
C/45 giây – 55
o
C/45
giây – 72
o
C/1 phút, 72
o
C/7 phút. Sản phẩm
khuếch đại được phát hiện bằng điện di trên thạch
agarose 2% pha trong TBE 0.5X và có trộn thêm
0.01mg ethidium bromide trong 50ml thạch.
Thạch điện di được pha từ bộ thuốc thử điện di
AGE do công ty Nam Khoa sản xuất theo hướng
dẫn đi kèm. Thang DNA được chạy điện di song
song với sản phẩm PCR cũng do công ty Nam
Khoa sản xuất, đây là thang 100-1000bp với
khoảng cách mỗi vạch là 100bp.

, tương đương 10
3
/10µl, 10
2
/10µl,
10/10µl, và 1/10µl. (2) Cho các độ pha loãng của
trích biệt DNA của C. trachomatis vừa chuẩn bị
và các độ pha loãng của trích biệt DNA của N.
gonorrhoeae đã chuẩn bị trước đó (các mẫu G
0
,
G
1
, G
2
, G
3
, G
4,
G
5
và G
6
) vào các PCR mix, lượng
mẫu cho vào là 10µl. (3) Chạy PCR theo chương
trình luân nhiệt sau: 40
o
C/10 phút, 95
o
C/5 phút, 40

c yêu cầu này.
Bảng 2: Các pha loãng mẫu trích biệt DNA và thể tích mẫu (µl) được cho vào PCR mix

PCR mix
1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 12 13 14 15 16 17
C
0
(µl)
5 5 5 5
C
1
(µl)
5 5 5 5
C
2
(µl)
5 5 5 5
C
3
(µl)
5 5 5 5
G
3
(µl)
5 5 5 5
G
4
(µl)
5 5 5 5
G

định độ nhạy cảm của Multiplex CHL-GNC
PCR mix.
Kết quả điện di trong hình 2 cho thấy
Multiplex CHL-GNC PCR mix 50pm có độ nhạy
cảm phát hiện N. gonorrhoeae và C. trachomatis
riêng lẻ đạt đến 1 bộ gen vi khuẩn trong một thể
tích mẫu cho vào tube phản ứng. Tuy nhiên, kết
quả điện di trong hình 3 thì cho thấy trong phát
hiện hai tác nhân vi khuẩn này cùng một lúc thì
với các mẫu thử có hàm lượng DNA bộ gen C.
trachomatis cao thì sẽ ức chế khả năng phát hiệ
n N.
gonorrhoeae. Trong khi các mẫu có hàm lượng
DNA bộ gen của N. gonorrhoeae dù rất cao (đến
10
4
bộ gen DNA trong thể tích phản ứng) vẫn
không ảnh hưởng đến khả năng phát hiện C.
trachomatis. Kết quả này rất thuận lợi trong thực
tế phát hiện bệnh vì thông thường nếu một người
nhiễm C. trachomatis thì số lượng vi khuẩn trong
mẫu thử sẽ rất thấp, trong khi đó nếu nhiễm N.
gonorrhoeae thì số lượng vi khuẩn trong mẫu thử
sẽ cao hơn.

3

4

C

C. trachomatis đến nồng độ C
3
, tương
đương 1 bộ gen vi khuẩn trong thể tích
10µl mẫu trích biệt DNA cho vào tube
phản ứng.
1 2 mk 3 4 5 6 7 8 9 mk
PCR mix 50pm
10 11 12 13 14 15 16 mk
PCR mix 25pm
Hình 1: K ết quả điện di sản phẩm PCR, gel bên trái là PCR mix 50, gel bên phải là PCR mix
25. Giếng 1,3, 10, 12: trích biệt DNA của C. trachomatis bằng phương pháp Boom;
giếng 2, 4, 11, 13 là trích biệt DNA của C. trachomatis bằng phương pháp đun cách
thuỷ; Giếng 5 đến 16 là trích biệt DNA của N. gonorrhoeae bằng phương pháp đun
cách thuỷ với giếng 5, 14 là G1; giếng 6, 15 là G2; giếng 7, 16 là G3; giếng 8 là G4.
G
3
G
4
G
5
G
6
G
3
G
4
G
5
G

C
1
C
1
C
2
C
2
C
2
C
2
C
3
C
3
C
3
C
3

Hình 3: Kết quả xác định độ nhạy cảm của Multiplex CHL-GNC PCR mix 50 trong
phát hiện cùng một lúc hai tác nhân C. trachomatis (vạch khuếch đại 241bp) và
N. gonorrhoeae (vạch khuếch đại 390bp).
Bàn luận
Chlamydia trachomatis là một trong các tác
nhân nhiễm trùng lây truyền bằng đường tình dục
phổ biến nhất tại các nước đang phát triển
(1)
. Bởi

. Cũng như vậy,
nhiễm N. gonorrhoeae mạn tính hay không triệu
chúng là một trong các yếu tố gây lây lan lậu trong
cộng đồng
(8)
. Lậu không triệu chứng hay mạn tính
có ở cả đàn ông và phụ nữ
(9,10)
. Một trong các tiếp
cận tốt nhất để kiểm soát và loại trừ được bệnh lậu
chính là việc phải phát hiện và điều trị cho được
các trường hợp mang mầm bệnh này vì đây chính
là các nhân tố nguy cơ cao.
Độ nhạy của các phương pháp truyền thống
như nuôi cấy hay phát hiện kháng nguyên để phát
hiện C. trachomatis hiện nay đã bị các phương
pháp khuếch đại nucleic acid qua mặt. Cũng như

vậy, phương pháp nuôi cấy vi sinh truyền thống đã
bị chứng minh là không đủ nhạy cảm để phát hiện
được N. gonorrheae trong các đối tượng nhiễm
lậu không triệu chứng hay mạn tính, do vậy các
phương pháp khuếch đại nucleic acid hiện đang
rất được quan tâm để áp dụng. Có nhiều phương
pháp khuếch đại nucleic acid đã được đưa ra
thương mại như các phương pháp dựa vào kỹ
thuật LCR (Abbott), PCR (Roche)
(11)
, TMA
(Bayer), hay SDA (BD). Trong các phương pháp

ỏ ra không hiệu quả.
Điều này hoàn toàn có thể giải thích được nếu
chúng ta hiểu được nguyên tắc trích biệt DNA của
phương pháp BOOM, đó là dùng triton X100 để
phá huỷ tế bào giải phóng DNA, dùng Guanidine
thiocyanate để bất hoạt các men nuclease. Các
DNA tự do sẽ bám vào các hạt silica nhờ vậy mà
trích biệt được DNA. Tuy nhiên vì trong dịch cấy
C. trachomatis là dịch cấy tế bào, do vậy bên cạnh
DNA của C. trachomatis, vẫn có nhiều DNA của
tế bào và chính các DNA này đã cạnh tranh vớ
i
DNA của C. trachomatis khi bám vào các hạt
silica do vậy khả năng DNA của C. trachomatis
được trích biệt sẽ thấp đi nhiều. Do vậy, dù chúng
tôi là những người đầu tiên mang về Việt Nam kỹ
thuật BOOM để trích biệt DNA nhưng không áp
dụng BOOM một cách máy móc vào tất cả các
bệnh phẩm mà phải xác định các bệnh phẩm nào
không lẫn nhiều DNA tạp nhiễm mới dùng
BOOM.
Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy là trong
phát hi
ện đồng thời cả hai tác nhân N.
gonorrhoeae và C. trachomatis; nếu C.
trachomatis trong mẫu thử có lượng DNA bộ gen
là 10
3
thì ngưỡng phát hiện N. gonorrhoeae là 10
DNA bộ gen trong mẫu thử, nếu C. trachomatis

Kết luận
Nghiên cứu đã thành công trong việc chế tạo
được multiplex phát hiện đồng thời cả hai tác nhân
C. trachomatis và N. gonorrhoeae trong mẫu thử,
ngoài ra còn xác định được độ nhạy cảm trong
phát hiện hai tác nhân vi khuẩn này một cách
riêng lẻ hay đồng thời. Thành công này là chìa
khóa để có thể tiến tới chế được bộ thử nghiệm
PCR phát hiện C. trachomatis và N. gonorrhoeae
trong các bệnh phẩm lấy từ đường ti
ết niệu và sinh
dục bệnh nhân.
Tài liệu tham khảo
1. Centers for Disease Control and Prevention. 2001.
Sexually transmitted disease surveillance 2000
supplement: Chlamydia Prevalence Monitoring Project.
U.S. Department of Health and Human Services, CDC,
Atlanta, Ga.
2. Centers for Disease Control and Prevention. 2002.
Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2002.
Morb. Mortal. Wkly. Rep. 51:1–78.
3. Burstein, G., C. A. Gaydos, M. Diener-West, M. R.
Howell, J. Zenilman, and T. C. Quinn. 1998. Incident
Chlamydia trachomatis infections among inner city
adolescent females: implications for frequency of
chlamydial screening. JAMA 280:521–526.
4. Burstein, G., G. Waterfield, A. Joffe, J. M. Zenilman, T.
C. Quinn, and C. A. Gaydos. 1998. Screening for
gonorrhea and chlamydia by DNA amplification in
adolescents attending middle school health centers:
6