19
3.3.2. Cách lấy mẫu và bảo quản mẫu
- Dùng muỗng vô trùng lấy phần giữa cục phân (khoảng 10 -12 g) mà bò, heo
vừa mới thải ra, cho vào túi nylon vô trùng, buộc kỹ, bảo quản 4 - 8
0
C và chuyển về
phòng thí nghiệm càng nhanh càng tốt. Phân tiêu chảy có thể được lấy bằng cách dùng
tăm bông, cho vào môi trường chuyên chở Carry Blair, chuyển về phòng thí nghiệm.
- Quét bề mặt thịt bò bằng gạc hoặc tăm bông vô trùng, cho vào ống nghiệm
chứa sẵn nước pepton đệm.
3.3.2. Nuôi cấy và phân lập E. coli
3.3.2.1. Môi trường nuôi cấy
 Môi trường tăng sinh
Do số lượng E.coli nhóm STEC, đặc biệt là E. coli gây bệnh hiện diện trong
thực phẩm rất ít, cho nên trước khi phân lập chúng tôi sử dụng môi trường tăng sinh
pepton đệm có bổ sung kháng sinh cefixime (0,0125mg/L) và vancomycin (8mg/L)
(FDA, 2002) để ức chế các vi khuẩn gram dương và vi khuẩn sống hoại sinh khác.
 Môi trường phân lập
Để xác định môi trường nào cho kết quả tốt khi phân lập E. coli nhóm STEC
mang gen độc lực, chúng tôi sử dụng 3 loại môi trường MAC, SMAC và CT - SMAC.
Môi trường phân lập là môi trường MacConkey (MAC), Sorbitol MacConkey
(SMAC), và Sorbitol MacConkey (CT - SMAC) có bổ sung kháng sinh cefixime
(0,05mg/L) và tellurite (2,5mg/L) (FDA, 2002). Khoảng 90% E. coli đều lên men
đường lactose, trên môi trường MAC, E. coli điển hình có khuẩn lạc màu đỏ hồng.
Trên môi trường SMAC và CT - SMAC, E. coli không lên men đường sorbitol nên
cho khuẩn lạc màu trắng, những dòng E. coli lên men sorbitol cho khuẩn lạc màu
hồng.
Việc tầm soát E. coli nhóm STEC trên phân, bệnh phẩm trên thạch SMAC, CT -
SMAC là công cụ ban đầu phát hiện serotype O157 thuộc nhóm STEC.
3.3.2.2. Qui trình phân lập, định tính

riêng biệt để giữ gốc riêng lẻ. Thu phần khuẩn lạc còn lại của mỗi nhóm, gom chung
vào 1 eppendorf chứa sẵn 0,4 – 0,5 ml nước cất khử ion vô trùng.
(3) Thử sinh hóa
Sử dụng nghiệm pháp IMViC (FAO, 1992) cho từng khuẩn lạc riêng lẻ thuộc
nhóm đó để xác định E. coli .
3.3.3. Li trích DNA
Theo Cebula và ctv (1995), kết hợp với ý kiến của Cerna (2003) và Botteldoorn
(2003), việc ly trích DNA được thực hiện như sau: thu khoảng 6 -10 khuẩn lạc E. coli
trên môi trường thạch (MAC hoặc SMAC hoặc CT - SMAC hoặc NA) cho vào eppendorf
đựng sẵn 0,4 - 0,5 ml nước cất hai lần vô trùng, đun sôi 10 phút, lấy ra và chuyển vào
tủ âm -70
0
C giữ trong 10 phút. Sau khi rã đông hoàn toàn, ly tâm 13000 vòng trong 3

21
phút. Để yên và hút phần dung dịch ở phía trên làm DNA khuôn mẫu (DNA xét
nghiệm).


MAC
(37
o
C/24h)
Phân
Thịt
Mẫu
Chọn 6 - 10 khuẩn lạc theo
từng nhóm riêng: trắng hoặc
đỏ hồng hoặc cả hai
SMAC
(37
o
C/24h)
(-)
Ly trích DNA riêng theo
từng ống NA
Loại bỏ ống NA đã giữ gốc
Multiplex- PCR
Ly trích DNA (DNA nhóm khuẩn lạc)
Multiplex - PCR
(+)
)

Thử IMViC (+/-;+;-;-)
C
ấy từng khuẩn lạc đ
ư
ợc chọn v
ào t

GTTTATTCTGGGGCAGGCTC
CTTCACGTCACCATACATAT
158
Stx1 - F
Stx1 - R
CAGTTAATGTGGTGGCGAAGG
CACCAGACAATGTAACCGCTG
348
Stx2 - F
Stx2 - R
ATCCTATTCCCGGGAGTTTACG
GCGTCATCGTATACACAGGAGC
584
Uid - F
Uid - R
GCGAAAACTGTGGAATTGGG
TGATGCTCCATCACTTCCTG
252
(Feng và Monday, 2000)
(2) Các thành phần của phản ứng PCR: (Feng và Monday, 2000)
Mỗi phản ứng là 25 l, gồm các thành phần sau: PCR buffer 1,1X; MgCl
2
3mM;
mỗi dNTP 200 M; mỗi loại primer 7,5 pmol; Taq 2,5 l; DNA 2 l; và nước cất vừa
đủ 25 l.
(3) Chu kỳ nhiệt (Feng và Monday, 2000)
- Tiền biến tính 95
0
C/5 phút
- Biến tính 94

24
Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân bò tiêu
chảy
Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli trong từng nhóm khuẩn lạc phân lập
được từ phân bò tiêu chảy được ghi nhận ở bảng 4.1.
Trong 10 mẫu phân bò tiêu chảy có 5/10 mẫu (50%) phát hiện E. coli mang gen
độc lực thuộc nhóm stx. Gen ehxA được phát hiện với tỉ lệ cao nhất (100%); kế đến là
stx2 (4/10 mẫu – 40%), stx1 (1/10 mẫu – 10%); và không phát hiện được gen uid và
eae. Như vậy, phân bò tiêu chảy là nguồn lưu cữu STEC mang gen stx2. Theo Paton
và Paton (1998) đã nhận định rằng những dòng STEC mang stx2 thì thường liên kết
bệnh nặng hơn so với những dòng STEC chỉ mang stx1.
Do kinh phí hạn chế, mỗi loại môi trường phân lập chúng tôi chỉ chọn 2 khuẩn
lạc riêng lẻ nhưng có kiểu hình giống nhau để xác định gen độc lực (li trích DNA từ
gốc khuẩn lạc riêng lẻ đã nhân và giữ gốc trên thạch NA), kết quả được trình bày ở
bảng 4.2.
Kết quả ở bảng 4.2 cho thấy:

1

HM _ + _ + _
HS

_ + _ + _
TS _ + _ + _

2

HM _ + _ + _
HS _ + _ _ _
TS _ + _ + _

3

HM _ + _ + _
HS _ + _ _ _
TS _ + _ + _

4

HM _ + _ _ _
HS _ + _ _ _
HCT _ _ _ _ _
5

HM _ + _ _ _
HS _ + _ _ _
6

HM6 _ + _ + _
HM8 _ + _ + _
HS4

_ + _ + _
HS6 _ + _ + _
TS4 _ + _ + _
TS5 _ + _ + _
2

HM1 _ + _ _ _
HM3 _ + _ _ _
TS1 _ _ _ _ _
TS2 _ + _ + _
3

HM1 _ + _ _ _
HM3 _ + _ _ _
TS3 _ + _ _ _
TS7 _ + _ _ _

4.2. Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân heo con cai
sữa tiêu chảy
Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli từ 9 mẫu phân heo cai sữa tiêu chảy
được trình bày ở bảng 4.3.
Bảng 4.3 cho ta thấy có 4/9 mẫu (44,4%) mang gen stx, trong đó có ¼ mẫu
mang gen stx1 (25%) và ¾ mẫu mang gen stx2 (75%), không có mẫu nào mang gen
uid và eae, 9/9 mẫu (100%) mang gen ehxA. Blanco và ctv (1997) kết luận rằng gen
stx1 thường hiện diện tỉ lệ thấp trên heo.
Có 6/25 (24%) nhóm khuẩn lạc được phân lập từ 9 mẫu phân heo cai sữa tiêu

HS _ + _ _ _
TS _ + _ _ _
4

HM _ + _ _ _
HS _ + _ _ _
TS _ + _ + _
5

HS _ + _ + _
TS _ + _ + _
6

HM _ + _ + _
HS _ + _ _ _
TS _ + _ + _
7

HM _ _ _ _ _
HS _ + _ _ _
TS _ + _ _ _
8
HM _ _ _ _ _
HS _ + _ _ _
TS _ + _ _ _
9
HM _ _ _ _ _
HS _ + _ _ _
TS _ + _ _ _