Phần 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Escherichia coli (E. coli) là một trong những vi khuẩn phổ biến trong đường tiêu
hóa của người và động vật máu nóng. Hầu hết các dòng E. coli tồn tại một cách tự nhiên
và không gây hại trong đường tiêu hóa. Tuy nhiên, trong một số trường hợp, nhất là khi
sinh lý cơ thể thay đổi, stress, loạn khuẩn xảy ra, …thì một số dòng E. coli độc có thể
gây bệnh trên người và một số loài động vật.
Dựa vào đặc điểm gây bệnh, người ta chia E. coli thành nhiều nhóm. Mỗi nhóm
đều có những yếu tố độc lực khác nhau và được quy định bởi những gen độc lực khác
nhau. Một số gen độc lực quan trọng của E. coli như: gen ehxA, stx1, stx2, và uid của
nhóm STEC (Shiga toxigenic E. coli); gen eae của nhóm STEC và EPEC
(Enteropathogenic E. coli); …
Nhìn chung, E. coli có thể được phân lập dễ dàng ở khắp nơi trong môi trường ô
nhiễm phân. Ngoài ra, E. coli còn có thể phân lập được từ những vùng nước ấm, không
bị ô nhiễm hữu cơ; vi sinh vật này có thể tồn tại và phát triển rất lâu trong môi trường.
Với sự phân bố rộng rãi như vậy, E. coli dễ dàng vấy nhiễm vào nguyên liệu thức ăn
hay nguồn nước nếu quy trình sản xuất không đảm bảo vệ sinh nghiêm ngặt. Từ đó, có
thể gây nên các bệnh rối loạn đường tiêu hóa, và nhiễm trùng đường tiết niệu, có trường
hợp gây tử vong cho người và gia súc.
Do vậy, việc xác định các gen độc lực của E. coli trong phân gia súc bình thường
hoặc tiêu chảy là cần thiết, góp phần trong việc chẩn đoán bệnh trên động vật và đánh
giá nguy cơ truyền lây sang người qua con đường thực phẩm. Từ đó, có những biện
pháp phòng ngừa hữu hiệu nhằm bảo vệ sức khỏe cho con người và vật nuôi. Những
tiến bộ của công nghệ sinh học hiện nay với phương pháp PCR sẽ giúp chúng ta chẩn
đoán chính xác, hiệu quả trong thời gian ngắn hơn so với phương pháp truyền thống
(nuôi cấy, phân lập, …). Vì vậy, đề tài tiến hành sử dụng kỹ thuật multiplex – PCR để
phát hiện đồng thời các gen độc: stx1, stx2, eae, ehxA, và uid của E. coli phân lập được
1
từ phân bò, heo tiêu chảy và thịt bò. Hy vọng trong tương lai, đề tài sẽ được ứng dụng
vào thực tiễn chẩn đoán và tầm soát bệnh cho gia súc cũng như cho con người qua con
đường thực phẩm.

nghiệm IMViC. E. coli cho kết quả IMViC là: + + - - hay - + - - (FAO, 1992).
2.1.2. Yếu tố kháng nguyên
Vi khuẩn đường ruột E. coli có cấu trúc kháng nguyên phức tạp. Dựa vào tính
chất kháng nguyên, người ta phân chia các vi khuẩn cùng loại thành các tuýp huyết
thanh (serotype) khác nhau (Bộ môn vi sinh, Khoa Y, Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí
Minh, 1996):
Kháng nguyên thân O (somatic antigen) là kháng nguyên của vách tế bào, cấu
tạo bởi lipopolysaccharide, có trên 150 loại khác nhau. Đặc tính của kháng nguyên O là:
Chịu được nhiệt, không bị hủy khi đun nóng 100
o
C trong 2 giờ.
Kháng cồn, không bị hủy khi tiếp xúc với cồn 50%.
Bị hủy bởi formol 5%.
Rất độc, chỉ cần 0,05 mg đủ để giết chuột nhắt sau 24 giờ.
3
Khi kháng nguyên O gặp kháng huyết thanh tương ứng sẽ xảy ra phản ứng ngưng
kết O. Kháng nguyên O giữ vai trò nhất định đối với khả năng gây bệnh của dòng vi
khuẩn và có tính chất chuyên biệt cho từng loài vật chủ.
Kháng nguyên lông H (flagellar antigen): có trên 50 loại khác nhau, cấu tạo bởi
protein và có tính chất không chịu nhiệt, bị hủy bởi cồn 50% và các proteinase, không bị
hủy bởi formol 5%. Khi kháng nguyên H gặp kháng thể tương ứng sẽ xảy ra hiện tượng
ngưng kết H.
Kháng nguyên giáp mô K (capsular antigen): có hơn 100 loại khác nhau và
nằm ngoài kháng nguyên O. Kháng nguyên K là polysaccharide hay là protein. Nếu
kháng nguyên K che phủ hoàn toàn thân vi khuẩn thì sẽ ngăn cản phản ứng ngưng kết
O. Kháng nguyên giáp mô K (capsular antigen) giúp E. coli bám vào tế bào biểu mô
trước khi xâm lấn đường tiêu hóa hay đường tiết niệu.
Kháng nguyên tiêm mao F (fimbrial antigen): có dạng hình sợi, dài khoảng 4
µm, thẳng hay xoắn, đường kính 2,1 – 7 nm, giúp vi khuẩn bám vào tế bào niêm mạc
ruột nên rất quan trọng trong khả năng gây bệnh của vi khuẩn .

Phi). Thuật ngữ Enterohemorrhagic E. coli ( EHEC) chỉ những dòng E. coli gây HC và
HUS (Nataro và Kaper, 1998). Và thuật ngữ Shiga toxin-producing E. coli (STEC) chỉ
những serotype E. coli sản sinh độc tố gây độc tế bào giống như độc tố của vi khuẩn
Shigella (Calderwood và ctv, 1996).
STEC và VTEC là hai thuật ngữ tương đương nhau, và cả hai đều đề cập đến E.
coli sản sinh một hay nhiều độc tố gây độc tế bào. Tuy nhiên, không phải chỉ có gen sản
sinh độc tố là có thể gây bệnh nếu không có các yếu tố độc lực khác. Những dòng E.
coli mang gen sản sinh độc tố cũng hiện diện trong ruột gia súc khỏe mạnh với số lượng
rất ít, nhưng những dòng này thiếu một hay vài yếu tố độc lực khác của STEC (Beutin
và ctv, 1995). Do đó, không phải tất cả STEC đều có khả năng gây bệnh (Nataro và
Kaper, 1998).
2.2.2. Các yếu tố liên quan đến đặc tính gây bệnh của STEC
2.2.2.1. Độc tố Shiga (Stx)
5
Shigella dysenteriae do Kiyoshi Shiga phát hiện năm 1897, sản sinh độc tố
thường được gọi là Shiga. Và sau này người ta phát hiện ở STEC cũng sản xuất độc tố
tác động tương tự như Shiga (Shiga-like toxin) (Nataro và Kaper, 1998).
Stx là một ngoại độc tố không bền với nhiệt, tác động lên ruột lẫn hệ thần kinh
trung ương. Ở ruột, E. coli gây tiêu chảy, đồng thời ức chế hấp thu đường và các axit
amin ở ruột non. Ở hệ thần kinh, nó gây biểu hiện lâm sàng trầm trọng có thể tử vong
(Bộ môn vi sinh, Khoa Y, Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh, 1996). Trong số hơn 200
serotype E. coli có thể sản sinh độc tố Stx thì có hơn 50 serotype gây HC hay HUS ở
người (Nataro và Kaper, 1998).
Cấu trúc và tổ chức các gen stx: họ độc tố Stx ở STEC gồm hai nhóm chính
không phản ứng chéo với nhau là Stx1 và Stx2. Trong khi Stx1 có tính bảo tồn cao
thì Stx2 rất thay đổi về trình tự, tạo ra nhiều biến chủng như Stx2c, Stx2hp, Stx2e ...
Một dòng STEC có thể sản sinh Stx1 hay Stx2, hoặc cả Stx1 lẫn Stx2, và thậm chí
nhiều dạng của Stx2.
Những nghiên cứu đầu thập niên 80 đã xác định Stx1 và Stx2 được mã hóa trên
thực khuẩn thể và thực khuẩn thể này chèn vào nhiễm sắc thể của E. coli (O’Brien và

(globotriaosylceramide),
dạng thụ thể glycolipid, trên nhung mao của tế bào biểu mô ruột ở động vật (Stx2e có
thụ thể là Gb
4
). Gb
3
hoặc Gb
4
còn tìm thấy ở tế bào nội mô thận, tế bào Vero, tế bào
Hela... Nhờ tính đặc hiệu của tương tác này và sự phân bố của các thụ thể thay đổi
theo loại tế bào đã ảnh hưởng chính đến cách sinh bệnh (Lingwood, 1996).
Sau khi làm hư hại các tế bào biểu mô, Stx xuyên qua hàng rào biểu mô, xâm
nhập vào dòng máu và tiến đến các mô đích khác nhau có chứa thụ thể glycolipid, gây
tổn thương tế bào nội mạch, tế bào thận … Cụ thể là những tiểu đơn vị B sẽ giúp độc tố
kết hợp với các thụ thể đặc hiệu này. Sau khi được chuyển vào bên trong tế bào, tiểu
đơn vị A đến tế bào chất và tác động lên tiểu phần 60S của ribosome, rồi cắt một gốc
adenin khỏi rRNA 28S của ribosome, do đó gây trở ngại cho sự tổng hợp protein. Vì
không tổng hợp được protein, những tế bào bị Stx tác động sẽ chết. Hậu quả là gây tiêu
chảy, viêm kết tràng xuất huyết (HC) và hội chứng huyết niệu (HUS). Trong khi đó, hậu
quả do Stx2e là hiện tượng phù thủng ở heo sau cai sữa (trích dẫn của Lê Thị Mai
Khanh, 2004).
Ảnh hưởng của các loại Stx trong sinh bệnh: Các nghiên cứu dịch tễ đã chỉ ra
rằng những dòng STEC chỉ sản sinh Stx2 thì gây bệnh trầm trọng hơn so với những
dòng STEC chỉ sản sinh Stx1, bệnh càng nặng hơn nếu dòng STEC sản sinh cả Stx1
lẫn Stx2, chẳng hạn như HUS (Paton và Paton, 1998).
7
2.2.2.2. Enterohemolysin (haemolysin)
Enterohemolysin tồn tại ở nhiều dạng (α, β và …) trong các E. coli xâm lấn hay
sinh độc tố đường ruột (Manil và Daube, 2005). Độc tố này được tìm thấy ở hầu hết các
dòng O157:H7 và các dòng STEC không phải O157:H7. Enterohemolysin thuộc nhóm độc tố

 β-intimin có ở những dòng E. coli thuộc nhóm EPEC và EHEC ở người và thỏ.
 γ-intimin chủ yếu ở nhóm STEC của người và động vật, ở EPEC của người.
 ε-intimin hiện diện trong những dòng E. coli thuộc nhóm EHEC ở bò và người
(Oswald và ctv, 2000).
Có sự liên quan chặt chẽ giữa gen eae và khả năng gây bệnh trầm trọng của các
dòng STEC trên người như HC và HUS. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng tỉ lệ của các dòng
mang gen eae ở bệnh phẩm người cao hơn trên gia súc. Hơn nữa, sự hiện diện dòng
STEC mang gen eae trên gia súc thường liên quan đến các dòng vi khuẩn E. coli độc lực
trên người mà khoa học đã từng biết, chúng thuộc serotype O157, O26, O111, …
(Sandhu và ctv, 1996).
Ngoài ra còn có các yếu tố liên quan đến sự bám dính của các tác nhân khác gây
bệnh đường ruột bao gồm fimbriae, OMPs (outer membrance proteins) và LPS
(lipopolysaccharide).
2.2.3. Cách sinh bệnh
Cách sinh bệnh là một quá trình gồm nhiều bước, liên quan đến sự tương tác phức
tạp giữa số lượng vi khuẩn và các yếu tố của vật chủ. Cấp STEC qua đường miệng (chỉ
cần liều rất thấp) thì vi khuẩn phải sống sót trong điều kiện môi trường khắc nghiệt của
dạ dày và chúng phải cạnh tranh với các vi khuẩn khác ở đường ruột để thiết lập sự định
cư. Vi khuẩn STEC sống sót trong đường ruột, nhân lên và sản sinh Stx rồi được hấp
thu qua tế bào biểu mô ruột, dẫn truyền vào dòng máu. Điều này cho phép toxin đặc
hiệu đến bề mặt tế bào đích gồm cả tế bào ruột lẫn các nội quan khác (Paton và Paton,
1998).
Định cư vào ống tiêu hoá: vi khuẩn có khả năng bám vào tế bào biểu mô ruột và
định cư trong ống tiêu hoá người là một trong những yếu tố quyết định độc lực.
Người ta ước tính liều gây nhiễm của vài dòng STEC (O111:H- và O157:H7) khoảng
1–100 CFU (colony forming unit) (Paton và ctv, 1996).
9
Sức đề kháng acid của STEC: Nét đặc trưng của các dòng STEC là khả năng
định cư ở ống tiêu hóa người, với số lượng cảm nhiễm thấp. STEC đề kháng được
pH acid của dạ dày. Do đó, dòng STEC O157:H7 vẫn còn sống sót trong các thực

kém ở hai lứa tuổi này. Sự cải thiện trong kiểm soát lâm sàng và kỹ thuật thẩm tách thận
đã làm giảm tỉ lệ chết do HUS từ 50% xuống hơn 10% trong hai – ba thập niên vừa qua.
Tuy nhiên, số lượng người sống sót (khoảng 30%) phải chịu đựng ốm yếu triền miên,
bao gồm suy thận mãn tính, tăng huyết áp và suy yếu hệ thần kinh.
Tiến trình bệnh do STEC gây ra có hay không có biến chứng tùy thuộc vào sự tác
động qua lại giữa vi khuẩn và vật chủ. Trong một ổ dịch, tuổi của người bệnh ảnh
hưởng đến tỉ lệ mắc cũng như tỉ lệ chết. Những nghiên cứu gần đây về các ổ dịch lớn
gây ra bởi STEC thuộc serotype O157:H7 cho thấy khoảng 5 – 10% bệnh nhân tiêu chảy
tiến triển để hình thành HUS do STEC (Paton và Paton, 1998).
2.2.5. Dịch tễ học
Trong nhiều năm qua, người ta thừa nhận rằng những dòng STEC gây bệnh trên
người thuộc các tuýp huyết thanh O:H phổ rộng. Karmali (1989) đã liệt kê 32 serogroup
O (tương đương với 60 tuýp O:H khác nhau). Trên khắp thế giới, các dòng STEC thuộc
serotype O157:H- là nguyên nhân chính gây bệnh cho người. Việc phân lập các serotype
này thường dựa vào khả năng không lên men sorbitol nên đã góp phần đánh giá quá cao
tỉ lệ mắc phải nhóm này so với các serotype khác. Khi một tuýp được phân lập là O157,
có lẽ có khuynh hướng bỏ qua tầm quan trọng tiềm năng gây bệnh của các tuýp khác.
Trong khi đó, các serotype STEC không thuộc O157:H7 cũng là nguyên nhân nổi bật
gây bệnh cho người.
Nguồn lây nhiễm: Nhiều cuộc điều tra dịch tễ đã chứng minh rằng các dòng
STEC hiện diện trong đường ruột của nhiều loài vật nuôi như bò, cừu, heo, dê, chó, mèo
(Beutin và ctv, 1995) và cả ngựa (Chalmer và ctv, 1997). Do đó, STEC tồn lưu trong gia
súc chính là nguồn quan trọng gây bệnh cho người, và nguồn quan trọng nhất là từ trâu
bò.
STEC lây truyền qua người chủ yếu bằng con đường thực phẩm, nước và từ
người qua người. Cụ thể, STEC có thể xâm nhập vào chuỗi sản xuất thực phẩm cho con
người từ nguồn gốc vật nuôi, vấy nhiễm thông thường nhất cho thịt là phân hoặc các
thành phần trong ruột sau khi hạ thịt (Paton và Paton, 1998).
11
Truyền lây STEC giữa người và người xảy ra trong các đợt bộc phát bệnh. Thời

thấy serotype này nguy hiểm hơn, dễ lây lan bệnh hơn so với các serotype khác. Lần đầu
tiên, serotype O157:H7 được phân lập và định danh vào năm 1982. E. coli O157:H7
ngày càng có tác động lớn ở Mỹ và châu Âu. Hàng năm, ở Mỹ có trên 73000 ca ngộ độc
thực phẩm do nhiễm phải O157:H7, trong đó có 61 trường hợp tử vong. Nguyên nhân
do ăn phải thịt bò chưa nấu chín hay đã bị vấy nhiễm, do uống sữa tươi hay do truyền
lây giữa người và người sau khi đi bơi trong các hồ đã bị nhiễm (USA Department of
Agriculture’s Food safety and Inspection Service, 2004). Từ đó, người ta xem O157:H7
là nguyên nhân phổ biến nhất cho HC và HUS.
Serotype này có một số đặc điểm khác biệt so với các serotype E. coli khác:
- Nhạy cảm với nhiệt độ, không phát triển được ở nhiệt độ 44 – 44,5
0
C (Jay, 2000).
- Không có khả năng lên men D-sorbitol trong 24 giờ. Trong khi đó có đến 75 –
94% những dòng E. coli khác lại lên men sorbitol. Do đó, người ta thay thế môi trường
MacConkey có lactose bằng SMAC chọn lọc chứa 1% sorbitol để phân lập (Smith và
Scotland, 1993).
- Không biểu hiện hoạt tính β-D-glucuronidase (GUD): Điểm khác biệt về sinh
hóa của dòng O157:H7 là không cho GUD dương tính, trong khi đó khoảng 90 – 95%
chủng E. coli cho GUD dương tính. Và người ta dựa vào đặc tính này để phân biệt
O157:H7 với các dòng E. coli khác (Monday và ctv, 2001).
GUD là enzyme xúc tác sự thủy phân β-D-glucuronide thành rượu và
glucuronate. Mặc dù không biểu hiện GUD nhưng các serotype O157:H7 vẫn mang
đoạn gen uid hoàn chỉnh (gồm cả vùng điều hòa) trên nhiễm sắc thể. Kiểu hình đặc
trưng này là do đã xảy ra các đột biến trên gen uid. Hầu hết các đột biến trên uid ở
O157:H7 là đột biến thoái hóa, ví dụ như đột biến điểm thay thế T bằng G ở vị trí 92 so
với E. coli thuộc chủng hoang dại (wild-type) (Feng và Lampel, 1994) hay đột biến do
sự chèn thêm hai base G-G ở vị trí +686 trên uid ở serotype O157:H7 (Monday và ctv,
2001). Tóm lại, những đột biến này có thể ảnh hưởng đến khả năng hoạt động của
GUD, O157:H7 vẫn sản sinh GUD nhưng GUD bị bất hoạt, không thực hiện chức năng
thủy phân của nó được. Và điều này vẫn chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn.

94 – 95
0
C
Bước 2: là giai đoạn lai (hybridization), nhiệt độ dao động trong khoảng
40
0
C – 70
0
C.
14
Bước 3: là giai đoạn kéo dài (elongation hay extension), thường ở nhiệt độ
72
0
C.
Một chu kì gồm 3 bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, và sau mỗi lần lặp lại
sẽ làm tăng gấp đôi lượng DNA của lần trước. Số chu kì thường theo kinh nghiệm và có
thể trong khoảng 25 – 30 chu kì, tùy theo lượng của mẫu DNA lúc bắt đầu và độ nhạy
mong muốn.
2.4.3. Các thành phần cần thiết của phản ứng PCR
- Dung dịch đệm: thành phần của dung dịch đệm có thể thay đổi tùy loại enzyme
sử dụng, quan trọng nhất là ion Mg
2+
. Nó hình thành một phức hợp hòa tan với dNTP,
rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme polymerase, làm tăng nhiệt
độ nóng chảy (Tm) của DNA mạch đôi. Nồng độ MgCl
2
trong hỗn hợp phản ứng cuối
cùng thường biến thiên từ 0,5 – 5 mM (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998).
- Các dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate): là hỗn hợp 4 loại dATP, dTTP,
dCTP, dGTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp DNA.

có nguyên tắc chung hay thành phần chuẩn nào cho việc tối ưu hóa phản ứng multiplex
– PCR. Do vậy, ứng với mỗi một điều kiện phản ứng, cần phải điều chỉnh cho phù hợp
với mục đích mong muốn.
2.4.6. Ứng dụng
Hiện nay, thành tựu của PCR mở ra nhiều triển vọng cho sinh học phân tử, với
nhiều ứng dụng trong sinh học, y khoa, nông nghiệp, khảo cổ, pháp y và hình sự.
Trong nghiên cứu genome, PCR được ứng dụng trong nhân bản vô tính, multiplex
PCR, cloning cDNA bằng PCR đảo (inverse PCR), recombinant PCR,...
Trong y khoa và thú y, PCR được sử dụng để chẩn đoán các mầm bệnh virus, vi
khuẩn, protozoa lẫn ký sinh trùng đa bào.
Trong nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm, sử dụng PCR để phát hiện gen
halothan, gen thụ thể estrogen, gen thụ thể prolactin … trong công tác chọn giống vật
nuôi, phát hiện các vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm : E. coli, Salmonella,
Staphylococcus aureus, Campylobacter, ...
16