Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Escherichia coli (E. coli) là vi khuẩn sống cộng sinh chiếm ưu thế trong hệ vi
sinh vật đường ruột của người và động vật. Tuy nhiên, khi có điều kiện thích hợp, một
số nhóm E. coli gây độc tăng sinh mạnh, trở thành nguyên nhân gây tiêu chảy nghiêm
trọng trên người và gia súc, đặc biệt là gia súc non. E. coli được xem là vi khuẩn chỉ
danh ô nhiễm thực phẩm và nước dựa vào số lượng của chúng. E. coli thải qua phân ra
môi trường bên ngoài. Nếu quá trình vệ sinh kém thì E. coli dễ vấy nhiễm vào thịt tươi,
nhất là trong quá trình giết mổ. Từ đó nếu việc bảo quản và chế biến thực phẩm không
thích hợp thì ngộ độc thực phẩm do E. coli hoàn toàn có thể xảy ra.
E. coli được chia thành nhiều nhóm như STEC, EPEC, ETEC, EAEC...Trong đó,
nhóm STEC (Shiga Toxin Producing E. coli) mang nhiều gen độc lực như gen eae chịu
trách nhiệm sản sinh intimin giúp vi khuẩn bám dính vào niêm mạc ruột; gen hly sản
sinh độc tố gây dung giải hồng cầu; gen stx1, stx2 sản sinh các độc tố shiga gây hội
chứng viêm kết tràng xuất huyết (HC = hemorrhagic colitis) và hội chứng huyết niệu
(HUS = hemolytic uraemic syndrome) ở người, gen stx2e sản sinh độc tố vero gây bệnh
phùng thủng và tiêu chảy ở heo cai sữa. Trong khi đó, nhóm ETEC (Enterotoxigenic E.
coli ) mang gen lt sản sinh độc tố ruột kém chịu nhiệt (heat labile toxin = LT) và gen st
sản sinh độc tố ruột chịu nhiệt (heat stable toxin = ST) gây tiêu chảy trên người và vật
nuôi. Nhóm EPEC (Enteropathogenic E. coli) mang gen eae sản sinh protein intimin, …
Trước đây, để phát hiện E. coli, người ta sử dụng phương pháp nuôi cấy truyền
thống. Phương pháp này gặp khó khăn là tốn thời gian, dịch bệnh đã lây lan rồi thì mới
có kết quả. Hơn nữa, E. coli là vi khuẩn bình thường ở đường ruột và cũng thường có
mặt trong thực phẩm nên việc phân lập được vi khuẩn E. coli trong phân để tìm nguyên
nhân gây bệnh hay xác định số lượng vi khuẩn trong thực phẩm hoàn toàn không phản
ánh được khả năng gây độc của chúng. Do vậy, việc phát hiện các gen gây độc của E.
coli bằng kỹ thuật PCR là bước cần thiết góp phần đánh giá nguy cơ gây bệnh trên vật
nuôi và con người. PCR là phương pháp nhanh, đặc hiệu, cho kết quả trong thời gian
ngắn, kịp thời phát hiện mầm bệnh để góp phần ngăn chặn tác hại của dịch bệnh.
1

2.1.2. Nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa
- Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 35 -37
o
C, pH thích hợp 6,4 – 7,5 (tối ưu là 7,2 –
7,4).
- E. coli có thể được phục hồi dễ dàng từ những mẫu có nguồn gốc khác nhau
trên môi trường chọn lọc ở 37
o
C trong điều kiện hiếu khí. E. coli thường được phân lập
bằng môi trường Mac Conkey (MAC) hoặc eosin methylene blue agar (EMB). Trên môi
trường thạch EMB, E. coli cho khuẩn lạc tím ánh kim; trên môi trường thạch Mac
Conkey, E. coli cho khuẩn lạc đỏ hồng. Ngoài ra, ta có thể sử dụng môi trường SMAC
(Sorbitol Mac Conkey) để phân biệt nhóm STEC không lên men đường sorbitol. Trên
môi trường SMAC, nhóm STEC cho khuẩn lạc điển hình màu trắng, hơi nhầy, còn các
nhóm E. coli lên men sorbitol cho khuẩn lạc màu hồng (FDA, 2002).
- E. coli mọc tốt trên môi trường thạch dinh dưỡng (NA: nutrient agar), sau 24
giờ hình thành những khuẩn lạc dạng S (smooth) màu xám trắng, tròn, ướt, bề mặt bóng,
kích thước khoảng 2 – 3mm.
- Trong môi trường lỏng, sau 4 – 5 giờ, E. coli làm đục nhẹ môi trường, càng để
lâu càng đục, có mùi hôi thối; sau vài ngày có thể có ván mỏng trên mặt môi trường.
3
- Để phân biệt E. coli và các vi khuẩn đường ruột khác, người ta dùng phản ứng
IMViC (Indol, Methyl Red, Voges Proskauer, Citrate). E. coli cho kết quả là + + - -
(biotype 1) hoặc - + - - (biotype 2) (FAO, 1992).
2.1.3. Yếu tố kháng nguyên
Phân loại huyết thanh học dựa vào kháng nguyên thân O (somatic), kháng
nguyên H (flagellar) và kháng nguyên bề mặt K (capsular). Có trên 700 loại serotype
của E. coli đã được công nhận dựa vào những kháng nguyên O, H, K. Theo Jay (2000),
E. coli có trên 200 type kháng nguyên đã được công nhận và tồn tại khoảng 30 type
kháng nguyên H.

haemolytic uraemic syndrome) (Nataro và Kaper, 1998).
- Tên Shiga toxin - producing E. coli (STEC) (trước đây gọi là Shiga like
toxin - producing E. coli - SLTEC) chỉ rõ khả năng sinh độc tố gây độc tế bào giống như
độc tố Shiga (Calderwood và ctv, 1997). Tên gọi STEC được sử dụng nhiều trong các
tạp chí khoa học ở Mỹ.
STEC và VTEC là hai thuật ngữ tương đương nhau và cả hai đều chỉ ra rằng
nhóm E. coli sản sinh ra một hay nhiều loại độc tố gây độc tế bào. Mặc dù vậy, không
phải có gen sản sinh độc tố là có thể gây bệnh nếu không có các yếu tố độc lực khác.
Những dòng E. coli mang gen sản sinh độc tố cũng hiện diện trong ruột gia súc khỏe
mạnh với một số lượng rất ít, nhưng những dòng này thiếu một vài hay tất cả những yếu
tố độc lực khác nhau của STEC (Beutin và ctv, 1995). Do đó, không phải tất cả STEC
đều có khả năng gây bệnh (Nataro và Kaper, 1998).
b. Shiga toxin và những yếu tố khác ảnh hưởng đến đặc tính gây bệnh của STEC
* Shiga toxin
Những dòng STEC sản sinh độc tố Shiga toxin (Stx), hay còn được gọi là
Verotoxins (VT) hoặc Shiga – like toxins (Slt).
Họ độc tố Stx gồm hai nhóm chính không phản ứng chéo với nhau là Stx1 và
Stx2, được mã hóa bởi gen stx1 và stx2. Cả hai độc tố này được cấu tạo từ 5 tiểu đơn vị
B (được mã hóa bởi stxB) và 1 tiểu đơn vị A (được mã hóa bởi stxA). Cả hai gen stxA và
stxB được định vị trên bacteriophage ôn hòa được chèn vào trong nhiễm sắc thể (NST)
của STEC. Một dòng STEC chỉ sản xuất độc tố Stx1, hoặc Stx2, hoặc cả hai, hoặc thậm
chí nhiều dạng Stx2. Ba dạng Stx2 được xác định: Stx2, Stx2c, và Stx2e (Pierard và ctv,
1998). Subtype Stx2e gây bệnh phù thủng ở heo hơn là gây bệnh ở người. Nhưng thỉnh
thoảng những dòng này cũng có thể được phân lập từ bệnh nhân HUS (Thomas và ctv,
1994). Nhiều khi người ta có thể thay thế giữa thuật ngữ Stx và VT (ví dụ: Stx1 = VT1
= Slt1, Stx2e = VT2e = Slt2e v.v…) (Caldervood và ctv, 1997). Hầu hết những phương
5
pháp chẩn đoán phân tử đều có mục tiêu phát hiện gen mã hóa Stx của nhóm STEC
(Cocolin và ctv, 2000).
* Những yếu tố độc lực khác ảnh hưởng đến đặc tính gây bệnh của STEC

- glucuronidase. Vì thế, ở nhiều quốc gia, chẩn đoán STEC chỉ dựa vào
6
việc phát hiện E. coli không lên men sorbitol. O157:H7 và các serotype không phải
O157 liên quan đến việc gây bệnh ở người gồm O26:H11, O103:H2, O111:H
NM
và
O113:H21 (WHO, 1994).
c. Nguồn lây nhiễm
STEC có thể được tìm thấy trong phân nhiều loài động vật như trâu, bò, cừu, dê,
heo, chó, mèo (Beutin và ctv, 1993; Chapman và ctv, 1997) và ngựa (Chalmers và ctv,
1997) và ngay cả chim hải âu (Makino và ctv, 2000). Loài động vật quan trọng nhất
trong việc lây nhiễm cho người là bò. Đường lây nhiễm chủ yếu của STEC vào chuỗi
thực phẩm là việc vấy nhiễm những thành phần trong ruột và phân trong quá trình giết
mổ (Butler, 1996).
STEC thường lây truyền sang người qua thực phẩm, nước và từ người này sang
người khác. Hầu hết các trường hợp bệnh là do ăn thực phẩm đã bị nhiễm, đặc biệt là
thực phẩm có nguồn gốc động vật. Trong đó thịt bò là nguyên nhân chủ yếu
(Keskimaki, 2001).
2.1.5.2. Nhóm EPEC
Thuật ngữ enteropathogenic E. coli được gọi tên đầu tiên bởi Neter và ctv (1955)
để chỉ những dòng E. coli gây tiêu chảy ở trẻ em.
a. Đặc điểm
Cũng như STEC, EPEC có mang gen eae mã hóa protein intimin giúp vi khuẩn
bám dính vào niêm mạc ruột và gây hư hại (A/E); nhưng EPEC không sản xuất độc tố
Shiga.
b. Sự bám dính và phá hủy (AE) của những dòng EPEC
Dấu hiệu của sự nhiễm bệnh do EPEC là hình thành bệnh tích kiểu A/E, có thể
quan sát được trên mẫu sinh thiết ruột từ những bệnh nhân hay thú bị nhiễm và trong
nuôi cấy tế bào (Nataro và Kaper, 1998). Dạng tổn thương này được đặc trưng bởi sự hư
hại của các vi nhung mao và sự kết dính chặt giữa vi khuẩn và màng tế bào biểu mô.

oligopeptide khoảng 86 kDa, được cấu tạo bởi 1 tiểu đơn vị A 28 kDa và 5 tiểu đơn vị B
11,5 kDa. Tiểu đơn vị A chịu trách nhiệm như một enzym, gồm peptide A
1
và peptide
A
2
liên kết nhau bởi cầu nối disulfur. Những tiểu đơn vị B sắp xếp thành vòng nhẫn, liên
kết chắc chắn với ganglioside GM
1
và liên kết lỏng lẻo với GD1b và vài glycoprotein
ruột (các thụ thể của LT). Hai loại LT-I có liên hệ gần nhau và phản ứng chéo một phần
với nhau là LTp (LTp-I) đầu tiên được phân lập từ heo và LTh (LTh- I) được phân lập
từ người. Gen mã hóa cho LT là elt hay lt-I nằm trên plasmid mà plasmid này có thể
8
chứa cả gen mã hóa ST và / hoặc gen mã hóa những kháng nguyên của yếu tố định vị
(colonization factor antigen – CFA).
Sau khi bám vào màng tế bào niêm mạc ruột của vật chủ, độc tố LT-I thâm nhập
qua màng trong tế bào, kích thích adenylate cyclase hoạt động dẫn đến làm tăng mức
AMP vòng (cAMP) trong tế bào. cAMP hoạt hóa protein kinase (A kinase) từ dạng
không hoạt động thành dạng hoạt động. Điều này dẫn đến sự phosphoryl những kênh
chloride hoạt động trên mức bình thường ở màng tế bào biểu mô. Kết quả là kích thích
những tế bào mào ruột tiết ra Cl
-
một cách tích cực, đồng thời ức chế sự hấp thu NaCl
bởi những tế bào nhung mao (villus). Đây chính là nguyên nhân dẫn đến tiêu chảy dữ
dội (Nataro và Kaper, 1998).
- LT – II: LT-II có cấu trúc giống với LT – I và CT khoảng 55 – 57% ở tiểu đơn
vị A, nhưng không giống với LT-I và CT ở tiểu đơn vị B. LT-II cũng làm gia tăng
cAMP trong tế bào qua cơ chế tương tự như LT-I, nhưng LT-II không liên quan đến
bệnh trên người và thú.

3
-
). STb không làm tăng cAMP hay cGMP nội bào mặc dù nó kích
thích tăng lượng calci nội bào từ ngoại bào. STb còn kích thích phóng thích PGE
2
và
serotonin, từ đó người ta cho rằng hệ thần kinh ruột cũng có thể liên quan đến đáp ứng
tiết dịch gây ra bởi độc tố này (Hitotsubashi và ctv, 1992).
 Yếu tố định vị (colonization factor – CF)
Cơ chế mà ETEC kết dính và cư trú trên lớp màng nhầy ruột đã được nghiên cứu
kỹ. Để gây tiêu chảy, ETEC đầu tiên phải kết dính vào tế bào ruột non nhờ vào lông trên
bề mặt của vi khuẩn, gọi là yếu tố định vị (CF hay CFA - Colonization factor antigens).
CFA có thể được phân loại dựa trên đặc tính hình thái. Có 3 loại chính gồm loại
lông hình que cứng, lông hình que mềm dạng bó, lông có cấu trúc mảnh mềm. Có ít nhất
20 loại CF trong ETEC ở người. Hầu hết, chúng được mã hóa bởi gen nằm trên plasmid,
cũng là nơi mã hóa độc tố ST và/hoặc LT (Gaastra và Svennerholm, 1996). Tiểu đơn vị
cấu trúc lông thường tạo miễn dịch vượt trội do đó tiểu đơn vị có tính kháng nguyên rất
mạnh.
b. Dịch tễ
Dòng ETEC liên quan đến hai hội chứng lâm sàng chủ yếu: tiêu chảy trên trẻ em
thôi bú ở những nước đang phát triển và tiêu chảy ở khách du lịch. Dịch tễ của bệnh do
ETEC được quyết định bởi nhiều yếu tố: (1) miễn dịch tại màng nhầy khác nhau của
từng cá thể đối với sự nhiễm ETEC, (2) những người nhiễm không có biểu hiện triệu
chứng vẫn bài thải một lượng lớn vi khuẩn qua phân, (3) việc nhiễm chỉ đạt được khi
liều gây nhiễm khá cao. Ba đặc tính này tạo nên tình trạng ô nhiễm ETEC trong môi
trường ở những vùng có dịch và hầu hết trẻ em trong vùng này sẽ đương đầu với ETEC
trong thời kì thôi bú. Trẻ em đã ở tuổi đến trường và người lớn có nguy cơ tiêu chảy do
ETEC rất thấp. Dòng ETEC sản sinh ST là nguyên nhân của hầu hết các trường hợp
bệnh.
10

cho phép nhân nhanh một gen mong muốn lên hàng triệu lần trong một thời gian ngắn
(tạo dòng in vitro, không cần sự hiện diện của tế bào).
11
Sự khuếch đại những primer oligonucleotide. Primer là những phân tử DNA đơn,
ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn (trình tự DNA mẫu xét
nghiệm) nhờ DNA polymerase, và dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate) trong điều
kiện phản ứng thích hợp. Các primer này gồm có primer “xuôi” (forward primer) và
primer “ngược” (reverse primer). Kết quả là sẽ có những chuỗi DNA mới bổ sung với
sợi DNA mẫu. Những chuỗi này sẽ tồn tại dưới dạng DNA chuỗi đôi. Sự tổng hợp này
sẽ được lặp lại theo một số chu kỳ nhất định đã được thiết lập.
Multiplex – PCR là một cải tiến của kỹ thuật PCR mà trong đó có thể nhân lên
đồng thời nhiều đoạn DNA mong muốn bằng cách sử dụng nhiều cặp primer trong một
phản ứng. Multiplex – PCR đầu tiên được mô tả bởi Chamberlain năm 1988 và kể từ đó
multiplex – PCR được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực kiểm tra DNA (Protocol
online).
2.2.2. Các giai đoạn của phản ứng PCR
Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm
ba giai đoạn:
 Giai đoạn 1: Giai đoạn biến tính (denaturation)
Hai mạch của phân tử DNA tách rời nhau thành hai mạch đơn. Phân tử DNA được
biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử, thường là ở 94 -95
0
C
trong vòng 30 giây đến 1 phút.
 Giai đoạn 2: Giai đoạn ủ bắt cặp (anealing)
Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các primer) cho phép các primer bắt cặp
với khuôn, trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động khoảng 40 – 60
0
C tuỳ thuộc Tm
của các primer sử dụng và kéo dài từ 30 giây dến 1 phút.

 Phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng.
 Xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế lại phản ứng.
 Các bản sao vừa tổng hợp không kết hợp với primer mà lại bắt cặp
với nhau.
Số chu kỳ của phản ứng tùy thuộc số lượng mẫu ban đầu. DNA mẫu ban đầu là
10
5
thì cần khoảng 25 – 30 chu kỳ, còn DNA mẫu là 10
2
– 10
3
thì số chu kỳ phải là 35 –
40.
Hình 2.1 Nguyên lý của phản ứng PCR
13
Giai đoạn biến tính
(denaturation)
Giai đoạn ủ bắt cặp
(anealing)
Giai đoạn kéo dài
(elongation hay
extension)
Hình 2.2 Chu kỳ nhiệt độ của phản ứng PCR
2.2.3. Các thành phần của một phản ứng PCR
- DNA mẫu: là thành phần cần khuếch đại.
- Primer: Primer là những đoạn oligonucleotide mạch đơn, có trình tự bổ sung
với trình thự base của hai đầu mạch khn để khởi đầu q trình tổng hợp DNA. Việc
chọn primer là giai đoạn quyết định của phản ứng PCR. Các primer được chọn phải đặc
trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, khơng trùng với các trình tự lặp lại trên gen,
khơng có sự bắt cặp bổ sung giữa primer xi và primer ngược và cũng khơng có những

14
- Các nucleotide (dNTP – deoxyribonucleotide triphosphate): là hỗn hợp 4 loại:
dATP, dTTP, dCTP, dGTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp DNA.
- Dung dịch đệm: thành phần dung dịch đệm có thể thay đổi tùy loại enzyme
được sử dụng, quan trọng nhất là ion Mg
2+
. Nó hình thành một phức hợp hòa tan với
dNTP, rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme polymerase, làm
tăng nhiệt độ nóng chảy (Tm) của DNA mạch đôi. Nồng độ Mg
2+
(thường được sử dụng
ở dạng MgCl
2
) là một yếu tố ảnh hưởng mạnh đến hiệu quả và tính đặc hiệu của phản
ứng PCR. Ngoài ra nồng độ MgCl
2
có thể ảnh hưởng đến quá trình bắt cặp của primer,
nhiệt độ để biến tính DNA thành dây đơn, hoạt động của enzyme và sự trung thực của
kết quả. Nồng độ Mg
2+
phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm.
Nồng độ MgCl
2
trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng thường biến thiên từ 0,5 – 5mM (Hồ
Huỳnh Thùy Dương, 1998).
2.2.4. Phân tích kết quả PCR
Sản phẩm của phản ứng PCR (đoạn DNA được khuếch đại) sẽ được phát hiện
bằng phương pháp điện di.
Nguyên tắc của phương pháp điện di là dựa vào đặc tính cấu trúc của các DNA.
DNA là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động

hay được bảo tồn trong các xác ướp.
2.2.5.2. PCR được sử dụng trong chẩn đoán lâm sàng
Phương pháp PCR cho phép các thông tin giải trình tự được thu nhận một cách
nhanh chóng, thông qua việc khuếch đại vùng liên quan trên genome dựa trên các kết
quả phân tích trực tiếp từ các sản phẩm của PCR. Khả năng nhận biết đột biến một cách
nhanh chóng không chỉ quan trọng trong chẩn đoán lâm sàng mà nó cũng làm gia tăng
các nghiên cứu các bệnh di truyền.
PCR cũng được ứng dụng trong chẩn đoán các tác nhân gây bệnh. Ví dụ: Khuếch
đại DNA của các vi khuẩn, virus trong các mẫu bệnh phẩm trước khi các triệu chứng
bệnh bắt đầu xuất hiện nhiều ngày, nhiều tuần, thậm chí nhiều tháng. Từ đó ta có thể đề
ra cách chữa trị thích hợp và ngăn chặn được thiệt hại.
2.2.5.3. PCR được dùng để khuếch đại RNA
PCR không chỉ khuếch đại các khuôn mẫu DNA, các khuôn mẫu RNA cũng
được khuếch đại nếu ban đầu chúng được biến đổi thành DNA tái tổ hợp (cDNA) nhờ
enzyme reverse transcriptase.
Một ứng dụng có ích của RT – PCR là xác định số lượng tương đối của một
mRNA trong các mô khác nhau hay trong cùng một mô nhưng tại các thời điểm khác
nhau. Số lượng của một mRNA trong tế bào chính là sự phản ảnh về khả năng hoạt
16
động của gen cha mẹ. Vì thế, sự xác định số lượng của mRNA tạo ra những thay đổi
trong sự biểu hiện gen để chúng có thể được kiểm soát.
2.2.5.4. PCR được sử dụng để so sánh các genome khác nhau
Sự khuếch đại ngẫu nhiên (random amplification) với các primer ngắn là kỹ thuật
hữu dụng trong phát sinh chủng loại, khu vùng nghiên cứu liên quan đến sự tiến hóa và
suy vong của các loài hay các nhóm sinh vật khác. Hai sinh vật có quan hệ thân tộc sẽ
có nhiều band giống nhau hơn hai sinh vật có quan hệ thân tộc kém (Brown, 1994).
2.2.6. Các hạn chế của phương pháp PCR
Do độ nhạy rất cao của PCR đồng thời với thao tác đơn giản, người ta có khuynh
hướng sử dụng phương pháp này để giải quyết nhiều vấn đề. Tuy nhiên, ta không thể
quên rằng phương pháp có nhiều hạn chế và đòi hỏi sự thận trọng đặc biệt khi tiến hành

-4
, nghĩa là cứ
10000 nucleotide thì enzyme gắn sai 1 nucleotide). Đặc tính này không nghiêm trọng
nếu ta chỉ cần xem xét kích thước hay sự có mặt của một sản phẩm khuếch đại, nhưng
có ý nghĩa lớn nếu cần xác định chính xác trình tự nucleotide của DNA. Ta không thể
loại bỏ hoàn toàn các sai khác này mà chỉ có thể giảm bớt; ví dụ như đảm bảo sự cân
bằng nồng độ các nucleotide trong phản ứng, xác định trình tự của nhiều sản phẩm
khuếch đại từ nhiều thao tác riêng biệt, so sánh trước khi đi đến trình tự chính thức,…
18
Phần 3
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện
3.1.1. Thời gian: Từ tháng: 2/2005 - 7/2005
3.1.2. Địa điểm
- Mẫu phân bò khảo sát được lấy từ hộ hoặc trại chăn nuôi ở Đồng Nai; mẫu
phân heo được lấy ở Tiền Giang; mẫu bề mặt thịt bò được lấy ở lò mổ Dĩ An – Bình
Dương.
- Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn được thực hiện tại phòng thực hành Kiểm nghiệm
Thú sản và Môi trường, khoa Chăn nuôi – Thú y, Trường Đại học Nông Lâm Thành
Phố Hồ Chí Minh.
- Xác định các gen độc lực được thực hiện tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm
Hóa sinh Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM.
3.2. Nội dung
- Thu thập mẫu phân tiêu chảy của bò, bê, heo và mẫu bề mặt thịt bò.
- Nuôi cấy, phân lập E. coli trên môi trường MAC, SMAC, CT-SMAC.
- Chọn khuẩn lạc điển hình của E. coli / nhóm E. coli.
- Giữ gốc khuẩn lạc riêng lẻ trên ống thạch NA
- Ly trích DNA của E. coli phân lập được.
- Thực hiện phản ứng multiplex – PCR để phát hiện gen gây độc của E. coli.
3.3. Phương pháp nghiên cứu

C, cấy sang môi trường
CT-SMAC. Vi khuẩn E. coli nhóm STEC phát triển tạo khuẩn lạc không màu hoặc xám
với tâm đục, E. coli khác cho khuẩn lạc hồng giống như trên môi trường MAC.
(2) Chọn khuẩn lạc điển hình của E. coli
- Quan sát các loại khuẩn lạc hiện diện trên bề mặt thạch MAC, SMAC, CT-
SMAC.
- Mỗi nhóm khuẩn lạc chọn 6 – 10 khuẩn lạc rời rạc đại diện E. coli của mẫu
khảo sát. Các nhóm khuẩn lạc như sau:
STT Đối tượng mẫu Số lượng
1
2
3
Phân tiêu
chảy
Phân bò 8
Phân bê 10
Phân heo 9
4 Thịt Bò 9
Tổng cộng 36
20