TCNCYH 27 (1) - 2004
Định vị miễn dịch hiển vi điện tử các kháng nguyên
mặt ngoài bằng kỹ thuật GINs

Nguyễn Kim Giao
Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng

GINS là kỹ thuật miễn dịch hiển vi điện tử, kết hợp kỹ thuật đánh dấu miễn dịch gián
tiếp với kỹ thuật nhuộm âm để nghiên cứu kháng nguyên mặt ngoài của các mẫu hạt vi
sinh vật nh vi rút, vi khuẩn, các mảnh vỡ tế bào.v.v. Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật này
trên vắc xin viêm não Nhật Bản, vắc xin viêm gan B và vi khuẩn salmonella. Những kết
quả chứng tỏ rằng các mẫu trên không những có cấu trúc hoàn chỉnh mà kháng nguyên
mặt ngoài có tính đặc hiệu cao

I. Đặt vấn đề
Miễn dịch hiển vi điện tử (IEM) là sự kết
hợp kỹ thuật miễn dịch với kỹ thuật hiển vi
điện tử để định vị các thành phần miễn
dịch đặc hiệu, các đại phân tử sinh vật. Khi
mà hoá mô miễn dịch sử dụng hiển vi
quang học để nghiên cứu phản ứng miễn
dịch xẩy ra ở mức mô và tế bào thì hoá
miễn dịch tế bào sử dụng EM để nghiên
cứu phản ứng miễn dịch xẩy ra ở mức các
đại phân tử và siêu cấu trúc tế bào.
Nhờ kỹ thuật miễn dịch hiển vi điện tử
có thể xác định vị trí của các chất nh định
vị các protein đặc hiệu trong hoặc trên mặt
vi khuẩn, tế bào, bào quan; dò tìm các
kháng nguyên mặt ngoài của vi rút; định vị
các chuỗi DNA hoặc RNA đặc hiệu trong

nhập vào mẫu) mẫu cần phải có ít nhất về
nồng độ là 5.0x10
7
hạt/ ml và thể tích là
50àl.
Ba loại mẫu sau dùng trong nghiên
cứu:
- Mẫu vi rút vắc xin viêm não Nhật Bản
loạt số L24/1999 và kháng thể dặc hiệu,
- Mẫu kháng nguyên bề mặt vi rút vắc

17
TCNCYH 27 (1) - 2004
xin viên gan B loạt số L44/2000 và kháng
thể đặc hiệu. Cả hai loại mẫu trên và các
kháng thể đặc hiệu tơng ứng nhận từ
Công ty văc xin và sinh vật phẩm số 1.
- Mẫu vi khuẩn salmonella và kháng thể
đặc hiệu H (nhận từ Khoa vi khuẩn, Viện
Vệ sinh dịch tễ trung ơng).
2. Thiết bị
- Kính hiển vi điện tử truyền qua:
JEM 1010 (JEOL, Japan) với điện áp
gia tốc chùm điện tử 30-100KV, độ phóng
đại 50-600.000x, độ phân giải 3A
0.
Các ảnh đợc chụp trên phim FUJI-FG,
in trên giấy ảnh Sterlin và lu trên đĩa cứng
của hệ Digital camera-Computer đi kèm
với JEM1010.

G đặc hiệu -
Protein A-Au
Hình 1. Kỹ thuật đánh dấu kháng nguyên gián tiếp
3.2. Kỹ thuật nhuộm âm:
Đây là kỹ thuật làm mẫu hiển vi điện tử
đơn giản nhanh và có độ phân giải cao.
Mẫu dạng dịch treo của những hạt nh vi
rút, vi khuẩn đợc đa lên lới và sau đó
trải đều một lớp thuốc nhuộm bao quanh
những hạt mẫu. Thuốc nhuộm cản chùm
tia điện tử còn hạt mẫu cho chùm tia điện
tử đi qua và hoạ lên cấu trúc của hạt mẫu
nghiên cứu trên màn quan sát.
3.3. Kỹ thuật đánh dấu miễn dịch gắn
vàng với nhuộm âm - Kỹ thuật GINS
Kỹ thuật đánh dấu miễn dịch gắn vàng
và nhuộm âm (kỹ thuật GINS) xuất phát từ
kỹ thuật đơn giọt (Hayat và Miller 1990) và
đợc tiến hành nh sau:
1. Các giọt 20àl mẫu vi rút đặt trên bề
mặt một miếng parafilm sạch.
2. Lới có màng collodium phủ các bon
ngậm nớc còn ớt (làm bằng cách ngâm

18
TCNCYH 27 (1) - 2004
trong dung dịch bacitracin 0,01%) đợc đặt
lên giọt mẫu để thu lấy các vi rút trong 5-
10 phút.
3. Rửa lới bằng cách đặt liên tiếp trên


Hình 2: Đánh dấu miễn dịch gắn vàng và nhuộm âm tiêu bản.

III. Kết quả
1. Vi rút vắc xin viêm no Nhật Bản
và kháng nguyên bề mặt HBsAg.
Hình 3 và hình 4 là các ảnh của vi rút
vắc xin viêm não Nhật Bản và HBsAg.
Chúng tôi nhận thấy quanh những hạt vi
rút của cả hai loại đều đợc bám bởi
Vi rút
Lới
BSA
2 % PBS

5-10 phút
Phón
g

PBS
1 % UA
H
2O
Quan sát
trên kính
HVĐTTQ
Rửa 3 lần
5 phút

Rửa 3 lần
5 phút
Rửa 3 lần
5 phút

Cố đ
ị
nh

Nhu
ộ
m 5 phút
Parafilm
Parafilm
TCNCYH 27 (1) - 2004
những hạt vàng (hạt đen tròn với đờng
kính dAu=5nm dùng cho VXVNNB () và
dAu=10nm dùng cho HBsAg (). Những
kết quả thu đợc trên ảnh xác nhận rằng
cả hai loại mẫu không những có cấu trúc

khác đều có thể đánh dấu miễn dịch khi sử
dụng kỹ thuật này.
Về mặt kỹ thuật các kháng nguyên mặt
ngoài của vi sinh vật hay kháng nguyên
nằm mặt ngoài tế bào là các kháng
nguyên có thể quan sát dễ dàng nhất, vì
các kháng thể và các phần tử đánh dấu có
thể đi đến một cách tự do. Trong nghiên
cứu ứng dụng này chúng tôi sử dụng chất
đánh dấu là keo vàng gắn trớc với Protein
A nên tính ổn định của nó rất cao đồng
thời lại có thể lựa chọn Protein A gắn hạt
vàng có các đờng kính khác nhau (5-
10nm) cho phù hợp với từng mẫu nghiên
cứu
Kỹ thuật miễn dịch gắn vàng thực hiện
trên mẫu sinh vật trớc khi cố định hóa học
nên có nhiều lợi thế hơn những kỹ thuật
đánh dấu miễn dịch chuẩn khác. Kỹ thuật
cho thấy đợc siêu cấu trúc của mẫu bao
gồm những chi tiết trên mặt, các thành
phần bên trong, cung cấp những thông tin
trực tiếp và đầy đủ về mặt hình thái và
nguyên tắc cấu tạo của các vi rút và xác
định đợc vị trí các kháng nguyên protein
hoặc đại phân tử nhờ những hạt vàng định
vị.
Thực tế cho thấy những lợng nhỏ các
immunoglobulin không bị phát hiện bằng
các phơng pháp phân tích sinh hoá hoặc

1987. Electron Microscopy and Diagnostic
Virology. Cambridge University Press,
Cambridge. 194 pp.
3. Hayat, M. A. 1989. Principles and
Techniques of Electron Microscopy:
Biological Applications. CRC Press, Boca
Raton, FL 469 pp.
4. Hayat, M. A., and S. E. Miller.
1990. Negative Staining. McGraw Hill,
New York. 345 pp.
5. Miller SE. Diagnostic virology by
electron microscopy. ASM News 1988;
54:475.

Summary
Immunoelectronmicroscopic localization of
surface Antigens by GINS technique

GINS is immunoelectronmicroscopic technique combinated indirect immunolabelling
technique and negative stainning technique in order to investigate surface antigens of
particle specimens, such as virus, bacteria, debris of cell. This applicant investigation
carry out on virus of JEV, HBsAg and salmonella. The results proved that samples not
only have complete structure but also surface antigens with high specifity.22