NGHIÊN CỨU LƯU GIỮ VÀ NHÂN NHANH GIỐNG THUẦN
CÀ CHUA DT28 BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO
Trịnh Thị Thanh Hương
1
, Lê Thanh Nhuận
1
,
Lê Thị Liễu
1
, Nguyễn Ngọc Lan
1
,
Đặng Trọng Lương
1
, Đinh Văn Luyện
1
SUMMARY

Callus induction, micropropagation and in vitro conservation of tomato
Lycopersicon esculentum via cotyledon culture
Different growth regulators combinations were tested on the production of cotyledon callus in
tomato cultivar DT28. Calli were induced on media supplemented with 1.0mgL-α-
naphthaleneacetic acid (NAA), 0.5mgL-1 6-benzylaminopurine (BAP), or with 1.0mgL-1 2,4D plus
1.0mgL-1 NAA. The medium containing 0.5mgL-1 BAP and 1.0mgL-1 NAA produced the highest
calli frequency, and promoted plant regeneration by indirect organogenesis, when calli were
transferred to 1mgL-1 BAP and 1mgL-1 Zeatin. Plants regenerated reaches 3-4 cm in length were
transferred to the rooted medium supplemented with 1mgL-1IBA,, after two weeks in culture, plants
rooted with rate one handred percent. In addition, the The effects of sorbitol and manitol
concentrations and low temperature on in vitro conservation of tomato have been examined.
Sorbitol and manitol concentrations of 20 g 1-l and 20 g 1-l and temperatures of 20°C -23
o

gốc từ lá thật và lá mầm hoặc nuôi cấy lát
mỏng (Compton và Veilleux, 1991;
Vnuchkova, 1977a, b; Hamza và Chupeau,
1993). Sự tái sinh in vitro thông qua phát
sinh các cơ quan và phát sinh phôi vô tính
đã được sử dụng trong nhân nhanh các
dòng, giống cà chua đồng nhất về mặt di
truyền. Sự tái sinh chồi từ rễ gần đây cũng
đã được nghiên cứu (Koornneeff và CS,
1993). Ngoài ra Faria và CS (1996) cũng đã
1
Viện Di truyền Nông nghiệp.
thành công trong việc tạo chồi từ callus có
nguồn gốc từ trụ dưới lá mầm và nuôi cấy
tế bào trần (Morgan và Cocking, 1982).
Bảo quản, lưu giữ in vitro các nguồn gen
đã có những bước tiến đáng kể từ năm 1975,
CIP đã góp phần phát triển kỹ thuật nuôi cấy
mô để bảo quản in vitro tập đoàn khoai tây
(Roca, 1975), khoai lang (Siguenas, 1987) và
cây cà chua (Toledo và cộng sự, 1994). Bảo
quản in vitro là phương pháp hiệu quả và hữu
hiệu nhất để phân loại các vật liệu vô tính.
Phương pháp này giúp các vật liệu trở nên
sẵn có, tránh được sự lây nhiễm các nguồn
bệnh chính và có khả năng loại trừ virus
thông qua nuôi cấy in vitro (Roca và cộng sự,
1979; George, 1993). Ngoài ra, phương pháp
bảo quản in vitro còn tiết kiệm hơn phương
pháp bảo quản lạnh sâu các loài sinh sản vô

Skoog) + 8 g/l agar + 30 g/l đường. Theo dõi
sau 2-3 ngày nuôi cấy.
3.2. Các công thức môi trường nuôi cấy
Ký hiệu công thức
môi trường
BAP (mg/l) 2,4D (mg/l) NAA (mg/l) Số mẫu cấy
C1 0,5 0 1 1000
C2 1 0 1 1000
C3 1,5 0 1 1000
C4 2 0 1 1000
C5 0 1 1 1000
C6 0 1,5 1 1000
C7 0 2 1 1000
Công thức môi trường BAP (mg/l) Zeatin (mg/l) NAA (mg/l) Số mẫu cấy
C8 0,5 0,5 1000
C9 0,5 1 1000
C10 0,5 1,5 1000
C11 0,5
2
1000
C12 0,5 2,5 1000

3.3. Môi trường tạo callus từ lá mầm
cà chua
Cây con sau gieo hạt từ 7-10 ngày tuổi,
tách lá mầm và thân chuyển vào môi trường
tạo callus. Môi trường MS có bổ sung các
thành phần: 8 g/l agar + 30 g/l đường và các
phytohormon 2,4-D, BAP, NAA. Sau khoảng
2-3 tuần thì bắt đầu theo dõi và đánh giá kết

Hạt cà chua được khử trùng bằng
HgCl
2
0,2% và NaOCl 5% trong 3 khoảng
thời gian khác nhau. Sau khi hạt gieo được
3-5 ngày, chúng tôi tiến hành theo dõi và
đánh giá hiệu quả của các chất khử trùng và
ảnh hưởng của chúng đến khả năng nảy
mầm của hạt. Kết quả thể hiện ở bảng 1.
Bảng 1. ghiên cứu ảnh hưởng của các chất khử trùng và thời gian xử lý
đến khả năng nảy mầm của hạt cà chua
HgCl
2
0,2% NaOCl 5%
Thời gian (phút) 10 12 15 15 20 25
Tỷ lệ nhiễm (%) 5 3 0 20 15 5
Tỷ lệ cây sống (%) 42 35 10 78 80 85
Tỷ lệ chết (%) 53 62 90 2 5 10

Qua bảng 1 cho thấy: Khi khử trùng
bằng HgCl
2
0,2% thì tỷ lệ cây sống tỷ lệ
nghịch với thời gian khử trùng, có nghĩa là
thời gian khử trùng tăng thì tỷ lệ cây sống
giảm. Mặc dù tỷ lệ nhiễm không cao nhưng
hạt bị chết nhiều, khả năng nảy mầm kém
nên tỷ lệ sống không cao. Ở nồng độ HgCl
2
0,2%, tỷ lệ cây sống đạt cao nhất là 42% ở

thái ca mu nuôi cy. Kt qu ưc th
hin  bng 2.
Bảng 2. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và AA đến khả năng tạo callus cà chua
Công thức
môi
trường
Mô lá Mô thân
Tỷ lệ tạo
callus (%)
Tỷ lệ tạo
chồi (%)
Tỷ lệ mẫu
chết (%)
Tỷ lệ tạo
callus (%)
Tỷ lệ tạo
chồi (%)
Tỷ lệ mẫu
chết (%)
C1 50 2 48 75 5 20
C2 39 5 56 56 12 32
C3 21 0 79 43 27 30
C4 15 0 85 35 46 19

Theo kt qu ca bng 2, ta thy khi
tăng nng  BAP t 0,5 mg/ml n 2
mg/ml thì t l to callus gim dn. i vi
mu lá, khi cy vào môi trưng to callus
thì mu cht nhiu, t l to callus t cao
nht là 50% (Môi trưng MS b sung 0,5

Tỷ lệ tạo
callus (%)
Tỷ lệ tạo chồi
(%)
Tỷ lệ mẫu
chết (%)
C5 15 0 85 35 0 65
C6 21 0 79 41 0 59
C7 30 0 70 56 0 44

Kt qu thu ưc  bng 3 cho thy: T
l to callus ca mu cy t l thun vi
nng  2,4D. Có nghĩa là khi tăng nng 
2,4D thì các mu có xu hưng to callus
càng cao.  môi trưng có b sung 2 mg/ml
2,4D + 1 mg/l NAA, mẫu tạo callus đạt tỷ lệ
cao nhất là: 30% (đối với mô lá) và 56% (đối
với mô thân). Tuy nhiên, tỷ lệ tạo callus khi
bổ sung 2,4D + NAA lại không cao bằng
môi trường có bổ sung BAP + NAA. Mặt
khác, các callus hình thành trên các môi
trường này không tơi xốp, trắng vàng như
trên môi trường có bổ sung BAP và NAA.
Như vậy, môi trường tốt nhất để tạo callus
cà chua là môi trường có bổ sung 0,5 mg/l
BAP + 1 mg/l NAA (môi trường C1).
3. Ảnh hưởng của các chất kích thích
sinh trưởng đến khả năng tái sinh cây cà
chua từ callus
Đối với thí nghiệm tái sinh cây cà chua,


Ảnh 2. Sự phân hoá và phát sinh chồi trên môi trường tái sinh
Bảng 5. Ảnh hưởng của tổ hợp Zeatin và BAP đến nhân nhanh chồi sau 7 tuần nuôi cấy
CT
Chất ĐTST (mg/l môi
trường)
HSN
(lần)
Chiều cao
chồi (cm)
Số lá/chồi
(lá)
Hình thái chồi
Zeatin BAP
1 (Đ/C) 0 0 1 2,21 1,5 Chồi nhỏ, lá nhỏ, thân lá xanh nhạt
C8 0,5 0,5 1,82 5,16 2,6 Thân nhỏ, lá nhỏ, thân lá xanh nhạt
C9 1 0,5 4,93 3,84 4,3 Thân trung bình, lá nhỏ, xanh nhạt
C10 1,5 0,5 4,29 4,09 3,7 Thân nhỏ, lá trung bình, xanh nhạt
C11 2 0,5 3,46 4,44 3,0 Thân nhỏ, lá trung bình, xanh nhạt
C12 2,5 0,5 2,59 4,97 2,1 Thân nhỏ, lá trung bình, xanh nhạt
LSD (5%) 0,12 0,12 0,15

Các s liu  bng 5 cho thy:
Ngoài công thức đối chứng có số chồi
không tăng, các công thức còn lại đều có số
chồi tăng lên rõ rệt, tuy nhiên mức độ tăng
có khác nhau. Động thái đẻ chồi của công
thức C9 (1 mg/l Zeatin + 0,5 mg/l BAP)
luôn có sự vượt trội ngay từ những tuần đầu.
Ở thời điểm 7 tuần sau nuôi cấy, số chồi ở

khác nhau. Kết quả thu được ở bảng 6 cho
thấy: môi trường có bổ sung IBA cho khả
năng ra rễ tốt hơn NAA. Các mẫu cấy trên
môi trường bổ sung 1 mg/l IBA tỷ lệ ra rễ
100%, trong khi đó môi trường bổ sung
1mg/l và 2mg/ml NAA chỉ ra rễ cao nhất là
19% (đối với mẫu chồi ngọn, chồi tái sinh)
và 9% (đối với mẫu chồi thân).
Bảng 6. Ảnh hưởng AA và IBA đến khả năng ra rễ cây cà chua
Công thức
môi trường

Chồi ngọn, chồi tái sinh Chồi thân
Tỷ lệ

ra rễ (%)

Hình thái
cây
Hình thái
rễ
Tỷ lệ
ra rễ (%)

Hình thái
cây
Hình thái
rễ
C14 13 Không tạo chồi ngọn Có nhiều rễ, rễ ngắn


sung 1,5% và 2% sorbitol và 2% manitol 
nhit  20-23
o
C và cưng  ánh sáng
1000 lux. Phương pháp này giúp kéo dài thi
gian bo qun cà chua 6 tháng-12 tháng mà
không cn cy chuyn (bng 7).

Bảng 7. Tỷ lệ mẫu sống sót sau 12 tháng lưu giữ in vitro
Số tháng 2% sorbitol và 2% manitol 1,5% sorbitol và 2% manitol

2% sorbitol
3 100 100 100
6 90 85 72
8 75 72 62
10 70 65 54
12 68 56 43
18 46 41 34

T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
8
Cà chua là cây trng nhit i nên thưng mt kh năng phát trin trong iu kin nhit
 thp hơn iu kin nhit  cn thit cho s phát trin ngoài ng rung. Tuy nhiên cây
cà chua vn có kh năng sinh trưng  nhit  thp hơn mt vài  C vi iu kin nhit
 thông thưng. Cây cà chua ưc trng  nhit  dưi 15
o
C trong thi gian dài ã cho
thy nhng tác ng bt li như s phenol hoá hay s cht hoi (Desamero, 1990). Nghiên
cứu của các tác giả đã chỉ ra rằng nhiệt độ từ 16-18
o

2. guyễn Văn Thắng, Trần Khắc Thi, 2000. Sổ tay người trồng rau, NXB. Nông nghiệp.
3. Đỗ ăng Vịnh, 2005. Công nghệ thực vật tế bào ứng dụng, NXB. Nông nghiệp, 252
trang.
4. Bhatia B., Ashwath ., Senaratna T. và Midmore D., 2004. “Tissue culture studies of
tomato”, Plant cell, tissue and organ culture, 78.
5. Brasileiro A.C., Willadino L., Carvalheiro G. và Guerra M., 1999. “Callus induction
and plant regeneration of tomato via anther culture”, Ciência Rural, Santa Maria, 29
(4), p919-623.
6. Jozef Gubis Z., Lajchová Z., Faragó J., Zureková Z., 2004. “Effect of growth regulators
on shoot induction and plant regeneration in tomato (Lycopersicon Esculentum Mill)”,
Biologia, Bratislava, p. 405-408.
7. Jose´ M. Seguı´-Simarro* and Fernando uez, 2007. “Embryogenesis induction,
callogenesis, and plant regeneration by in vitro culture of tomato isolatedmicrospores
and whole anthers”, Journal of Experimental Botany, P1-14.
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
9
8. Rhaman M., Asaduzzaman M., ahar . và Bari M A., 2006. “Efficient plant
regeneration from cotyledon and midrib dirived callus in eggplant (Solanum
melongena L.)”, Bio-sci, p31-38.
gười phản biện: Trần Duy Quý