Bộ giáo dục v đo tạo
ĐạI HọC Đ NẵNG

Đỗ Thị Bích Thủy
Nghiên cứu Thu nhận chế phẩm protease
từ một số nguồn khác nhau v ứng dụng
trong công nghệ thực phẩm
Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm đại cơng
Mã số : 2.11.00

Tóm tắt Luận án tiến sĩ kỹ thuật
611-612.
2. Đỗ Thị Bích Thủy, Trần thị Xô (2005), Nghiên cứu ảnh hởng của
một số yếu tố lên khả năng sinh protease của Bacillus subtilis, TC
Nông nghiệp và phát triển nông thôn (2004), 49: tr. 1667-1668.
3. Đỗ Thị Bích Thủy, Trần thị Xô (2005), ảnh hởng sự thay thế
nguồn Cacbon và Nitơ tự nhiên lên quá trình sản xuất chế phẩm
protease từ Bacillus subtilis, TC Nông nghiệp và phát triển nông
thôn (2005), 59: tr. 42-43.
4. Do Thị Bich Thuy, Tran Thi Xo (2005), Production, purification
and application of protease from Bacillus subtilis, Proceedings of
Vietnam-Korea international symposium 2005 on Biotechnology and
Bio-system-engineering, Ho chi Minh city: 47-52.
5. Đỗ Thị Bích Thủy, Trần Thị Xô (2006), Nghiên cứu quy trình thu
nhận và khảo sát một số tính chất của chế phẩm protease Bacillus
subtilis, , TC Nông nghiệp và phát triển nông thôn 87: 41-51.
6. Đỗ Thị Bích Thủy, Trần Thị Luyến (2006), Nghiên cứu nuôi cấy
trực tiếp vi khuẩn Bacillus subtilis để loại bỏ protein ra khỏi phần vỏ
phế liệu tôm, TC Khoa học Công nghệ Thủy sản 2-2006: 47-51.
7. Đỗ Thị Bích Thủy, Phạm Thị Trân Châu (2006), Nghiên cứu một
số tính chất proteinase ngoại bào của Bacillus subtilis bằng phơng
pháp điện di trên gel polyacrylamide, TC Khoa học Đại học Quốc
gia Hà Nội, KHTN & CN T. XXII 3: 1-12.1
Mở đầu
1. Tính cấp thiết của luận án
Protease là một trong các enzyme công nghiệp quan trọng nhất,
đợc ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến thực phẩm. Quá
trình thu nhận các chế phẩm enzyme phụ thuộc rất nhiều yếu tố nh

3. Nội dung nghiên cứu của luận án
- Nghiên cứu thăm dò, tuyển chọn nguồn nguyên liệu thích hợp
để thu nhận proteinase.

2
- Nghiên cứu thiết lập quy trình thu nhận chế phẩm proteinase
từ nguồn nguyên liệu đã đợc tuyển chọn.
- Khảo sát một số đặc tính của các chế phẩm proteinase thu
đợc.
- Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme này để xử lý loại bỏ
protein ra khỏi phần vỏ của phế liệu tôm trong quy trình sản xuất
chitin và cải tiến quy trình sản xuất nớc chấm từ đậu nành truyền
thống.
4. ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án
- Đóng góp dẫn liệu nghiên cứu điều tra nguồn proteinase từ một
số thực vật phổ biến ở Huế và tuyển chọn đợc một chủng vi khuẩn
trong phế liệu tôm có PA trong môi trờng cao, đã đợc định tên là
Bacillus subtilis (tại phòng thí nghiệm vi sinh vật môi trờng và thực
phẩm Universite Catholique de Louvain Bỉ).
- Là một trong số rất ít công trình ở Việt Nam tiến hành nghiên
cứu phát hiện trực tiếp và đầy đủ hơn các proteinase của Bacillus
subtilis từ chế phẩm enzyme thô; sử dụng phơng pháp điện di SDS
PAGE có cơ chất phát hiện đợc ít nhất 6 băng PA có khối lợng
phân tử từ 20 kD đến 67 kD, đồng thời nghiên cứu ảnh hởng của các
chất ức chế, hoạt hoá và các ion kim loại hoá trị hai đến mỗi
proteinase.
- Lựa chọn đợc điều kiện thích hợp để sử dụng proteinase hoặc
nuôi cấy trực tiếp Bacillus subtilis với phế liệu tôm để tách bỏ
protein, tạo nguyên liệu sạch protein nhằm sản xuất chitin đạt tiêu
chuẩn cho sản xuất chitosan.

- Phế liệu của quá trình chế biến tôm (PLT) đợc lấy mẫu ở
công ty chế biến thủy sản xuất khẩu Sông Hơng (Thừa Thiên Huế)
dùng để phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp
proteinase cao và khảo sát quá trình loại bỏ protein.
2.2. Phơng pháp nghiên cứu
* Các phơng pháp vi sinh vật: Phân lập vi khuẩn có khả năng sinh
tổng hợp proteinase ngoại bào cao trên môi trờng thạch gelatin; cấy
tăng sinh và nuôi cấy để thu nhận enzyme trong môi trờng lỏng, xác
định mật độ tế bào sau thời gian nuôi cấy bằng cách đo mật độ hấp
thụ ở bớc sóng 600nm.
* Các phơng pháp phân tích hóa sinh: Xác định hoạt độ
proteinase theo phơng pháp Anson cải tiến, xác định hàm lợng
protein hòa tan theo phơng pháp Lowry, xác định hàm lợng ni tơ
tổng số bằng phơng pháp Kjeldahl, tinh sạch sơ bộ bằng phơng
pháp sắc ký lọc gel, điện di protein trên gel SDS-polyacryamide
(SDS-PAGE) theo Leammli và điện di phát hiện proteinase theo
Heusen và Dowdle.
* Phơng pháp vật lý: Xác định hàm lợng kim loại nặng bằng
phơng pháp quang phổ hấp thụ phân tử.

4
* Các phơng pháp thống kê: Phơng pháp phân tích phơng sai
(Analysis of variance (ANOVA)), phơng pháp tối u hoá theo quy
hoạch thực nghiệm.
Chơng 3: Kết quả nghiên cứu v thảo luận
3.1. thăm dò hoạt độ proteinase (pa) của một số
nguồn khác nhau
3.1.1. Xác định PA của một số nguồn thực vật
Thực hiện khảo sát khả năng thu nhận proteinase . Kết quả
khảo sát xác định pH của dịch đệm dùng để tách chiết proteinase

Đậu
ván
100(*) 42,000

2,482
0,02
5,9
0,04
Su le 100 5,200 9,504
0,27
182,8
5,17
Vả 100 10,200 3,432
0,19
33,6
1,84
((*): Đối với đậu ván đợc tính trên 100g nguyên liệu ớt sau khi ngâm 50 g
nguyên liệu khô trong 6 giờ)
Từ kết quả thăm dò sơ bộ, chúng tôi tiến hành kết tủa bằng
ethanol, đông khô để thu chế phẩm và tính giá thành tơng đối.
Kết quả cho thấy giá thành tính trên 1 đơn vị hoạt độ của chế
phẩm tách từ su le là ít nhất, chỉ bằng khoảng 1/3 của đậu ván và 1/2
của vả và đậu ngự.
Nh vậy, các kết quả thăm dò hoạt độ proteinase từ các đối
tợng thực vật cho thấy su le là nguồn thu nhận có hiệu quả nhất.

5
3.1.2. Thăm dò một số nguồn vi sinh vật để thu proteinase
Từ 50 chủng vi khuẩn phân lập đợc, có 11 chủng có khả năng
sinh tổng hợp proteinase ngoại bào. Trong đó có 1 chủng đợc định
(ĐC: mẫu đối chứng, MTCB; TB: Tinh bột; Mal: Maltose; Dex:
Dextrose; Lac: Lactose; Sac: Saccharose)
Hoạt độ (HP/ml)
Hình 3.7: ảnh hởng của nguồn carbon lên hoạt độ proteinase trong
dịch môi trờng nuôi cấy của chủng B. subtilis
N
g
uồn C (0,5%)
ĐC TB Mal Dex Lac Sac6
Kết quả này cho thấy khi thêm tinh bột hoà tan vào MTCB,
PA đạt đợc cao nhất so với sự bổ sung các nguồn C khác; PA của
dịch môi trờng nghiên cứu lớn hơn so với mẫu đối chứng 1,6 lần
(Hình 3.7).
3.2.1.2. ảnh hởng của nguồn ni tơ
Tiến hành bổ sung vào môi trờng cơ bản (đối chứng) các
hợp chất N vô cơ (NH
4
NO
3
, NH
4
Cl) và N hữu cơ (cao nấm men,
casein), thu dịch môi trờng nghiên cứu và tiến hành xác định PA
(Hình 3.8).
Từ kết quả ở hình 3.8 cho thấy casein là nguồn nitơ có tác

NO
3
Hoạt độ (HP/ml)
Nguồn N (0,5%)
( ĐC: Đối chứng; Cas: Casein; CN: Caonấm)

7
3.2.1.4. Nghiên cứu thăm dò ảnh hởng của sự kết hợp đồng thời
nguồn carbon và ni tơ đến hoạt độ proteinase của dịch môi trờng
nuôi cấy B. subtilis
* ảnh hởng của sự kết hợp một số nguồn dinh dỡng đến hoạt độ
proteinase của dịch môi trờng nuôi cấy B. subtilis:
Thử nghiên cứu kết hợp bổ sung các nguồn dinh dỡng đã khảo
sát ở trên vào MTCB.
Các mẫu thí nghiệm đợc nuôi cấy 24 giờ và xác định PA của
dịch môi trờng nuôi cấy. Quá trình bố trí thí nghiệm và kết quả đợc
thể hiện ở bảng 3.8.

Bảng 3.8: ảnh hởng của sự kết hợp một số nguồn carbon và ni
tơ đến hoạt độ proteinase của dịch môi trờng nuôi cấy B. subtilis

Nguồn C
(%)
Nguồn N
(%)
tn
TB Mal Cas CN
PA
(HP/ml)
1 0,5 0,5 0,5 0,265

g
0,504
a
0,446
bc
0,461
b
0,408
cd
1 0,178
i
0,360
efg
0,341
fg
0,389
de
0,264
h
0,365
efg
1,5 0,034
lmn
0,192
i
0,120
j
0,062
klm
0,120

3 0,000
n
0,010
n
0,019
mn
0,005
n
0,005
n
0,005
n

(Các chữ cái khác nhau biểu thị sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy p<0,05
(Duncan s test))
Khảo sát sơ bộ bằng cách thay đổi đồng thời hàm lợng hai
nguồn này trong khoảng rộng từ 0,5% đến 3% theo các mức: 0,5%;
1,0%; 1,5%; 2,0%; 2,5%; 3% (Bảng 3.9).
Kết trên bảng 3.9 cho thấy ở nồng độ cao nấm 0,5% và tinh bột
1,5%, hoạt độ enzyme thu đợc đạt cực đại (0,504 HP/ml).
Từ kết quả thu đợc ở trên, chúng tôi tiếp tục khảo sát thay đổi
đồng thời hàm lợng tinh bột và cao nấm xung quanh 1,5% (1,25%;
1,5%; 1,75%; 2%; 2,25%) và 0,5% (0,1%; 0,3%; 0,5%; 0,7%; 0,9%)
nhằm tìm đợc hàm lợng thích hợp nhất.
Kết quả cho thấy khi sử
dụng 0,1% cao nấm phối hợp với 1,75% tinh bột PA đạt cao nhất.
Kết quả trên cho phép xác định đợc thành phần môi trờng
thích hợp nhất (MTTƯCB) gồm: 1% Pepton, 0,3% cao thịt, 0,5%
NaCl, 0,1% cao nấm, 1,75% tinh bột hòa tan.
3.2.2. ảnh hởng của pH ban đầu và nhiệt độ lên PA của B.

Kết quả trên hình 3.9 cho thấy sau khi nuôi cấy 16 giờ, PA có
giá trị 0,588 HP/ml và không thay đổi nhiều khi kéo dài thời gian
nuôi cấy đến 40 giờ.
3.2.4. Nghiên cứu quá trình tách và tinh chế sơ bộ proteinase từ
dịch môi trờng nuôi cấy (MTNC) của B. subtilis
3.2.4.1. ảnh hởng của nồng độ ethanol và pH dịch môi trờng nuôi cấy
đến khả năng thu nhận chế phẩm proteinase kết tủa (Hình 3.10)
120.78
118.18
120.78
112.99
23.38
0
20
40
60
80
100
120
140
678910
48%
64%
72%Hoạt độ (HP/ml)

Hoạt lực enzyme thu đợc khi dùng ethanol kết tủa cao hơn
1,12 lần so với trờng hợp dùng (NH
4
)
2
SO
4
. Trong các thí nghiệm tiếp
theo, chúng tôi chọn ethanol làm tác nhân để thu nhận chế phẩm
enzyme.
3.2.4.3. Tinh sạch sơ bộ chế phẩm enzyme thu đợc sau khi kết tủa
bằng ethanol (ETC) qua cột Sephadex G-100 (đã đợc cân bằng với
dung dịch đệm Tris HCl 0,05M, pH 7,6, kích thớc cột 80x15cm,
tốc độ chảy 17ml/giờ, thể tích mỗi phân đoạn là 2ml)
Kết quả cho thấy rằng, sau khi sắc ký qua Sephadex G 100,
ETC đợc tách thành 2 đỉnh protein nhng chỉ một đỉnh có PA, đỉnh
I (từ phân đoạn 15 đến phân đoạn 33) (hình 3.12).
Thu các phân đoạn có PA (chế phẩm enzyme thu đợc sau sắc

0
20
40
60
80
100
120
678910
30% bh
50% bh
70% bh

11

Bảng 3.13: Bảng tổng kết các bớc thu nhận chế phẩm enzyme

0,05
0,1
0,15
0,2

Hình 3.12: Sắc ký đồ của chế phẩm ETC qua cột Sephadex G-100

0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38
Phân đoạn
Hoạt độ protease (HP/ml)
Mật độ quang
: Hoạt độ protease (HP/ml)
: Hàm lợng protein đợc biểu diễn bằng mật độ quang

12
Bảng 3.14: Kết quả phân tích một số chỉ tiêu của chế phẩm ETC
Chỉ tiêu phân tích Kết quả Tiêu chuẩn về độ tinh
khiết của enzyme
(luật 05/09/1989)
Cadimi 0,35 <0,5
Arsen 0,55 <3
Chì 1,13 <10
Hóa học

2500

3.3. Khảo sát một số tính chất của các chế phẩm
proteinase của B. subtilis:
3.3.1. ảnh hởng của nhiệt độ đối với hoạt độ của dịch MTNC,
các chế phẩm ETC, ESG (Hình 3.15)
Kết quả cho thấy rằng cả 3 chế phẩm enzyme đạt đợc hoạt độ
cực đại trong khoảng nhiệt độ 50-60
0
C

13

0
20
40
60
80
100
120
30 40 50 60 70 80
MTNC
ETC
ESG
3.3.2. ảnh hởng của pH đến PA của các chế phẩm
(Hình 3.16 và Hình 3.17)
0

Hình 3.16:. ảnh hởng của pH đến PA của các chế
phẩm enzyme
p
H
Hoạt độ tơng đối
(% so với cực đại)

14

0
20
40
60
80
100
120
6.5 7 7.5 8 8.5 9 9.5
MTNC
ETC
ESG
* Kết quả khảo sát ảnh hởng đồng thời pH (6-10) và nhiệt độ
(30-60
0
C) đến phản ứng của các chế phẩm enzyme cho thấy các dạng
chế phẩm có PA cao nhất ở các giá trị nhiệt độ và pH nh sau: Dịch
MTNC : nhiệt độ 50-60
0

cũng đợc
thấy rõ hơn.

Hình 3.17: ảnh hởng của pH (6,5-9,5) đến PA của các chế
phẩm enzyme
pH
Hoạt độ tơng đối
(% so với cực đại)

15

0
20
40
60
80
100
120
ĐC 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

* Độ bền của cả hai chế phẩm enzyme không khác nhau ở pH 7
và pH 8.

0
20
40
60

p
hút)
Hình 3.21 : Độ bền nhiệt của dịch môi trờng nuôi cấy
Hoạt độ còn lại (% so với ĐC)
50
o
C (Không có Ca
2+
)
60
o
C (Không có Ca
2+
)
50
o
C ( Có Ca
2+
)
60
o
C (Có Ca
2+
)
Thời
g
ian (
p
hút)
Hình 3.22 : Độ bền nhiệt của chế phẩm ETC

phẩm ESG
(a. Các băng protein chuẩn;
b. Các băng PA của ESG)
94 kD
67 kD
43 kD
30 kD
20,1 kD
14,4 kD
1
2
3
4
5
a b
b
6
7
a b c

17

xử lý từ 4 đến 6 giờ nồng độ của tyrosine tăng mạnh. Khi xử lý đợc
Nồng độ tyrosin(mol/ml)
Nhiệt độ(
0
C)
Hình 3.32: ảnh hởng của nhiệt độ xử lý đến khả năng loại bỏ
protein từ phế liệu tôm
Thời gian
(phút)
Hình 3.31: ảnh hởng của các ion
kim loại đến hoạt độ của enzyme (nồng độ
ion kim loại trong dung dịch là 10
-3

(a. Đối chứng; b. Ca
2+
; c. Cu
2+
; d. Zn
2+
)
a b c d
Hình 3.30: ảnh hởng của các chất kìm hãm
đến hoạt độ của các băng PA trên SDS-PAGE
(a. EDTA; b. STI đậu nành; c. Đối chứng pH 7,6;
d. PCMB; e.1,10-Phenanthronine)
5
a b c d e
khuẩn B. subtilis để loại protein ra khỏi phần vỏ của phế liệu
tôm (PLT)
Chúng tôi tiến hành thử nghiệm nghiên cứu loại bỏ protein ra
khỏi PLT bởi vi khuẩn trong sản xuất chitin qua hai giai đoạn:
- Giai đoạn nuôi cấy nhân giống sản xuất tạo canh trờng thích
hợp.
- Giai đoạn loại bỏ protein bởi vi khuẩn bằng cách nuôi cấy
hỗn hợp gồm canh trờng thu đợc với PLT.
3.4.2.1. Nghiên cứu quá trình nhân giống sản xuất:
*Nghiên cứu xác định các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho
quá trình nhân giống sản xuất:
+ Nghiên cứu tìm thành phần môi trờng với mục đích giúp vi
khuẩn thích nghi dần với môi trờng thử nghiệm sản xuất và tạo PA
cao trong canh trờng.
- Từ MTTƯCB, nguồn tinh bột và một phần protein đợc thay
thế bởi các nguồn dinh dỡng tự nhiên. Trong đó, bột sắn và bột PLT
là nguồn tự nhiên đợc chọn để thay thế vừa có ý nghĩa kinh tế và ý
nghĩa khoa học. Môi trờng mới đợc chọn gọi là môi trờng tự

19
nhiên (MTTN) có thành phần nh sau: 0,5% pepton; 0,15% cao thịt;
0,1% cao nấm; 0,5% NaCl; 5,5% bột sắn và 1,3% bột PLT.
+ Khảo sát tìm điều kiện nhiệt độ và pH ban đầu của môi
trờng nuôi cấy thích hợp
- Vi khuẩn B. subtilis đợc nuôi cấy trong MTTN tạo PA cao
nhất ở pH 10 và nhiệt độ 35
0
C .
* Xác định thời gian nhân giống sản xuất:
Quá trình nhân giống sản xuất kết thúc khi canh trờng thu


Phần trăm protein còn lại so
với ban đầu (%)
Thời
g
ian xử l
ý
(
g
iờ)
Hình 3.40: Kết quả khảo sát quá trình loại bỏ protein từ phế liệu
tôm bởi vi khuẩn B. subtilis 20
Kết quả cho thấy rằng, sau khi xử lý 24 giờ, phần trăm protein
còn lại trong PLT so với mẫu cha xử lý giảm hẳn.
Nh vậy, quá trình xử lý PLT để loại bỏ protein ra khỏi phần chitin
có thể kết thúc sau 24 giờ
3.4.2.3. Thử nghiệm sản xuất chitin từ phế liệu tôm bằng sử dụng
vi khuẩn B. subtilis ở công đoạn loại bỏ protein ra khỏi phần vỏ:
Từ các kết quả khảo sát điều kiện môi trờng, pH ban đầu,
nhiệt độ nuôi cấy và thời gian loại bỏ protein của vi khuẩn, chúng tôi
đã thử nghiệm sản xuất chitin bằng cách nuôi cấy trực tiếp B. subtilis
theo các thông số đã khảo sát ở trên. Sản phẩm chitin đợc phân tích
các chỉ tiêu chất lợng thể hiện trên bảng 3.22. Theo kết quả phân
tích (Bảng 3.22) cho thấy rằng, các mẫu chitin đợc sản xuất có xử lý
bằng phơng pháp sinh học có chỉ tiêu cảm quan giống nh trờng
hợp xử lý hóa học. Các chỉ tiêu hóa học của các mẫu xử lý sinh học
có cao hơn chút ít. Theo nhận xét của trờng Đại học thuỷ sản Nha

Đợc xử lý bởi
ETC
1,20 1,10 12,5 Sáng
bóng
Dạng vẩy,
độ dai cao
14775
Đợc xử lý bởi
B.subtilis
1,05 0,92 12,5 Sáng
bóng
Dạng vẩy,
độ dai cao
6500
3.4.3. ứng dụng chế phẩm ETC vào việc sản xuất nớc chấm từ
đậu nành theo phơng pháp truyền thống:
Quá trình nghiên cứu thủy phân protein đậu nành trong quy
trình sản xuất nớc chấm theo phơng pháp truyền thống đợc tiến
hành theo hai giai đoạn (thủy phân bằng enzyme và thủy phân bằng
acid) nh sau: Sử dụng chế phẩm ETC để thủy phân sơ bộ protein
trong bột đậu nành theo tỉ lệ enzyme : bột đậu nành : nớc =
365 HP : 1 kg : 12 lít, giữ 50
0
C trong 6 giờ. Ly tâm tách dịch,

21
bã tiếp tục đợc ngâm trong dung dịch HCl 15% theo tỉ lệ 1 :
1(w : v) trong 2 giờ, thủy phân tiếp 6 giờ ở 90
0
C. Nớc chấm

Hàm lợng kim loại nặng

TCVN:867-1998 của Bộ Y tế
Hàm lợng Cd (mg/l) 13,5.10
-3
Không
phát hiện
1
Hàm lợng Pb (mg/l) 9,79.10
-3
14,19.10
-3
2
Giá thành (đồng/l) 2500
*
6000
M1: Mẫu nớc chấm sản xuất bằng phơng pháp kết hợp enzyme - acid,
M2: Mẫu nớc chấm sản xuất bằng phơng pháp acid đợc bán trên
thị trờng
*: Giá thành của mẫu M1 chỉ đợc tính trên chi phí nguyên liệu,
enzyme và acid.

22
Kết luận v kiến nghị

1. Kết luận:
Từ các kết quả nghiên cứu ở trên cho phép rút ra một số kết
luận nh sau:
1) Phân lập và tuyển chọn đợc một chủng vi khuẩn có PA
trong môi trờng nuôi cao hơn hẳn PA của 4 đối tợng thực vật đã

t
1/2
tăng lên rõ rệt 40,65 phút
(MTNC) và 28,31 phút (ETC).
6) Sử dụng điện di trên SDS - PAGE có cơ chất casein đã phát
hiện đợc ít nhất 6 băng PA (PA-1, PA-2, PA-3, PA-4, PA-5 và PA-
6) có khối lợng phân tử tơng ứng là: 20 kD (PA-1) , 30kD (PA- 2),
~ 43 kD (PA-3 và PA-4), ~ 67 kD (PA-5 và PA-6) và một vùng sáng
PA có khối lợng phân tử lớn hơn 67 kD.