BỘ GI
Á
O DỤC V
À
Đ
À
O TẠO
ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

************************** BÙI THỊ HẢI HÒA NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH CỦA
β-GALACTOSIDAZA TỪ MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC
ASPERGILLUS SP. VÀ ỨNG DỤNG ĐỂ SẢN XUẤT
GALACTOOLIGOSACCARIT Chuyên ngành : Công nghệ sinh học thực phẩm
Mã số: 62 54 02 05 Phản biện 1: GS. TS. Nguyễn Đình Quyến
Phản biện 2: PGS. TS. Nguyễn Thị Hoài Trâm
Phản biện 3: GS. TS. Nguyễn Thành Đạt Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng cấp nhà n
ước chấm luận án tiến
sĩ họp tại trường Đại học Bách Khoa vào hồi… , ngày… tháng… năm
2009 Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc Gia Việt Nam
- Thư viện Đại học Bách Khoa Hà Nội Người hướng dẫn khoa học:

GS. TS. ĐẶNG THỊ THU
1
MỞ ĐẦU
Đường chức năng là một bộ phận quan trọng trong nhóm thực phẩm
chức năng, được tập trung nghiên cứu nhiều trong những năm gần đây do
có nhiều đặc tính có lợi cho sức khỏe như chống sâu răng, chống bệnh tiểu
đường, không gây béo phì, có khả năng kích thích hoạt động của hệ tiêu
hóa
Galactooligosaccarit (GOS) là sản phẩm của phản ứng transgalatozyl
lactoza dưới sự xúc tác của
β-galactosidaza và thuộc nhóm đường chức
năng. GOS có tác dụng tốt cho sự phát triển của hệ vi sinh vật có lợi trong
đường ruột như Bifidobacterium, Lactobacillus và ức chế các vi sinh vật
gây bệnh. Vì vậy, nhu cầu về các loại đường chức năng có tác dụng tốt đối
với sức khỏe con người như GOS để ứng dụng trong công nghiệp thực
phẩm là rất lớn
β-galactosidaza là một tác nhân sinh học có tác dụng polyme hoá
lactoza tạo ra GOS. Trong tự nhiên β-galactosidaza được phân bố khá rộng
rãi trong các vi sinh vật, thực vật (lá bina, cà chua ) và các cơ thể động vật.
Đặc biệt β-galactosidaza được tìm thấy với hàm lượng và hoạt lực cao ở các
loài vi khuẩn như Bacillus cicurlans, nấm men Kluyveromyces fragilis, K.
lactis và các chủng nấm mốc A. oryzae, A. niger với ưu điểm β-
galactosidaza từ nấm mốc là enzym chịu nhiệt, hoạt động tối ưu ở pH th
ấp
và hoạt tính chuyển galactozyl cao nên rất phù hợp để sản xuất GOS từ
lactoza, chế biến sữa và các sản phẩm thực phẩm khác. Với những ưu điểm
đó β-galactosidaza là một trong những mối quan tâm lớn của các nhà khoa
học trên thế giới
Tại Việt Nam, mặc dù đã có một số nghiên cứu về β-galactosidaza và

ứng dụng của enzym này.
2. Đã thành công trong việc tách dòng và giải trình tự gen lacA mã hóa
cho β-galactosidaza của chủng A. oryzae 3, các phân tích về tương quan
phát sinh chủng loại cho thấy gen lacA của chủng A. oryzae 3 thuộc
nhóm gen mã hóa β-galactosidaza từ các chủng A. oryzae RIB 40 và A.
candidus.
3. Đã đề xuất đượ
c quy trình sản xuất Galactooligosaccarit (GOS) ở qui
mô phòng thí nghiệm sử dụng chế phẩm enzym β-galactosidaza từ A.
oryzae 3. Chế phẩm đạt chất lượng trên 50% GOS.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. β-GALACTOSIDAZA
β-D-galactosit galactohydrolaza (E.C. 3.2.1.23) còn gọi là lactaza
hay β- galactosidaza. β-galactosidaza thường được thu nhận từ nguồn tế
bào động vật, thực vật hoặc vi sinh vật, nhưng nguồn thu chủ yếu và kinh
tế vẫn là từ nguồn vi sinh vật như nấ
m men, nấm mốc, vi khuẩn. β-
galactosidaza thu được từ các nguồn khác nhau có đặc tính khác nhau.
β-galactosidaza được xác định là enzym thuộc nhóm glycosidaza,
xúc tác cho phản ứng thủy phân lactoza thành β-D-galactoza và α-D-
glucoza và phản ứng galactozyl chuyển hóa các gốc β-D-galactosit của
lactoza tạo ra galacto-oligosaccarit (GOS).
Mặc dù có tác dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau như di truyền
học, y học nhưng hiện nay β-galactosidaza được ứng dụng chủ yếu vào
lĩnh vực công nghiệp thực ph
ẩm, đặc biệt là sản xuất đường chức năng
GOS.
1.2. GALACTOOLIGOSACCARIT (GOS)

Các hoá chất tinh khiết (oNPG, β-Mertacapton ethanol, EDTA, Tris-
HCl, Acrylamide, Bromophenol blue, methanol, đường chuẩn glucoza,
galactoza, lactoza, galactotetraoza), hóa chất thông dụng dùng trong
nghiên cứu sinh học phân tử (Tris-base, EDTA.Na
2
, agaroza, SDS, CTAB,
NaCl ) có nguồn gốc từ Sigma (Mỹ), Merk (Đức), Pharmacia và một số
hoá chất thông dụng khác của Trung Quốc.

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp vi sinh
- Tuyển chọn chủng nấm mốc trên đĩa thạch theo phương pháp thủy phân
X-gal
- Phương pháp lên men dịch thể
- Xác định vi sinh vật tổng số theo TCVN 4882:2001; E. coli theo
TCVN 6846:2001; Cl. pefrigens theo TCVN 4991:2001; S. aureus theo
TCVN 4830:1989; Salmonella theo TCVN 4829:2001
2.2.2. Phương pháp hóa sinh
- Xác định hoạt độ β-galactosidaza dự
a trên sự thuỷ phân oNPG của β-
galactosidaza để sinh ra oNP. Một đơn vị hoạt độ β-galactosidaza được
xác định là lượng enzym xúc tác thuỷ phân 1 μmol oNPG trong 1 phút ở
55
o
C.
- Thu enzym β-galactosidaza bằng phương pháp kết tủa phân đoạn
(NH
4
)
2
Hình 3.1. Khả năng thủy phân chỉ thị X-gal của nấm mốc A. oryzae
Chú thích:
- 1: Mẫu đối chứng, 2: A. oryzae 1, 3: A. oryzae 3, 4: A. oryzae 2

4
3
2
1

5
3.2. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp β-galactosidaza của các chủng
nấm mốc Aspergillus oryzae bằng phương pháp xác định hoạt độ với
cơ chất oNPG
Ba chủng A. oryzae 1, 2 và 3 được nuôi cấy trên môi trường lactoza
cơ bản với tốc độ lắc 200 vòng/phút, 30
o
C, pH 7, 48 giờ. Sau đó thu và xác
định thu enzym nội bào, ngoại bào. So sánh kết quả chúng tôi thấy chủng
A. oryzae 3 có hoạt tính β-galactosidaza nội bào cao nhất , do vậy chủng
A. oryzae 3 được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
Bảng 3.1.Hoạt độ β-galactosidaza của 3 chủng A. oryzae
sau 48 giờ nuôi cấy
Hoạt độ tổng của β-galactosidaza
(MU)
Chủng VSV
Ngoại bào Nội bào
A. oryzae 1 788,48 1272,43
A. oryzae 2 865,92 1481,84

cacbon khác nhau: lactoza, saccaroza, maltoza, glucoza, galactoza với tốc
độ lắc 200 v/phút, 30
o
C, pH 7 và chọn được nguồn cacbon phù hợp là
lactoza .
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ lactoza
đến khả năng sinh tổng hợp β-galactosidaza của A. oryzae 3

Hoạt độ β-galactosidaza (MU/g)
T(giờ) (h)
Nồng độ
lactoza (g/l)
24 36 48 60 72
0-1
,
06 9
,
45 15
,
17 25
,
80
527
,
32 108
,
64 189
,
96 223
,

,
24 558
,
41 797
,
07
25 96
,
14 293
,
19 411
,
39 686
,
04 829
,
43
30 89
,
71 354
,
89 517
,
13 691
,
05 976
,
74
35 77
,

tôi nhận thấy hoạt tính enzym cao nhất trên môi trường có nồng độ 1g
pepton và 0.5g NH
4
NO
3
(1311.8 MU/g sau 72 giờ nuôi cấy). Vì vậy, nồng
độ nitơ thích hợp để A. oryzae 3 lên men sinh tổng hợp β-galactosidaza
được đề xuất áp dụng trong nội dung tiếp theo là pepton 1g/l, NH
4
NO
3
0.5
g/l.

7
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ nitơ đến khả năng sinh tổng hợp
β-galactosidaza của A. oryzae 3

Hoạt độ β-galactosidaza (MU/g)
Thời gian lên men (giờ)

Nồng độ nitơ (g/l)
24 36

48 60 72
0,5g Pepton + 0g NH
4
NO
3
67,02 136,73 332,01 451,74 674,61

73,90 129,12 262,58 462,74 597,00

3.3.4. Khảo sát ảnh hưởng của pH
Chủng nấm mốc A. oryzae 3 được lên men trên môi trường có nguồn
dinh dưỡng đã được chọn với các pH đầu: 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5 và 8,0.
Kết quả thí nghiệm trên đã cho thấy pH đầu của môi trường có ảnh hưởng
đáng kể tới hoạt độ enzym. Với pH đầu bằng 7,0 và 7,5 thì hoạt độ enzym
cao, đạt tối đa ở giờ thứ 72, cao nhất là 1237,40 MU/g với pH đầu là 7 và
1325,16 MU/g với pH
đầu bằng 7,5. Từ kết quả này đã cho phép lựa chọn
pH đầu là 7,5 làm pH thích hợp cho quá trình lên men sinh tổng hợp β-
galactosidaza từ nấm mốc A. oryzae 3 trên môi trường MT4.
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của pH môi trường lên men đến khả năng sinh tổng
hợp β-galactosidaza của A. oryzae 3

Hoạt độ β-galactosidaza (MU/g)
Th
ờ
i gian lên men
(giờ)
pH
24 36 48 60 72
5
,
0
42,26 138,75 424,38 381,84 254,48
5
,
5
68,86 131,49 252,58 450,88 538,53
Hình 3.3. Động thái quá trình sinh tổng hợp β-galactosidaza
từ chủng nấm mốc A. oryzae 3
Hoạt độ β-galactosidaza tăng mạnh từ 24 đến 72 giờ (pha tăng
trưởng), duy trì ổn định từ giờ 72 đến giờ 96 và bắt đầu giảm dần từ
khoả
ng sau 108 giờ lên men. Như vậy chúng tôi cho rằng ở giai đoạn này
lượng chất cảm ứng là lactoza đã không đủ cho nhu cầu của tế bào, bên
cạnh đó ở thời điểm này sự sinh trưởng của tế bào bắt đầu chậm lại nên
làm giảm hoạt độ β-galactosidaza. Trong kết quả khảo sát còn xuất hiện
một khoảng tăng nhẹ hoạt tính enzym trong khoảng từ 156 -168 giờ lên
men. Tuy nhiên vẫ
n chưa thể khẳng định được nguyên nhân và vấn đề trên
cần phải được khảo nghiệm thêm. Như vậy, năng lực tổng hợp và tích tụ
enzym tăng cùng với động thái phát triển của chủng A. orzyae 3 và thời
điểm thu enzym thích hợp nhất là từ 72-96 giờ.
3.4. Nghiên cứu tách tinh chế β-galactosidaza từ A. oryzae 3
3.4.1. Khảo sát các tác nhân kết tủa β-galactosidaza từ A. oryzae 3
Sau khi khảo sát thu ch
ế phẩm β-galactosidaza kỹ thuật trên các hệ
dung môi là axeton và (NH
4
)

Hoạt độ β-
galactosidaza
(MU/g)
Hiệu suất
tương đối
(%)
0 1257,11 100
30 645,27 51,33
40 725,60 54,35
50 904,24 71,93
60 863,24 57,72

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ sunfat amôn bão hoà
đến hiệu suất thu nhận β-galactosidaza

3.4.2. Tinh chế β-galactosidaza bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion
DEAE – Sepharose fast flow trên hệ thống FPLC
Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn phương pháp làm sạch β-
galactosidaza bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion trên cột DEAE-
sepharose fast flow trên hệ thống FPLC.
Dịch enzym thu được sau 72 giờ lên men chủng A. oryzae 3 được
kết tủa bằng axeton ở nhiệt độ 0°C với nồ
ng độ là 50% (v/v), sau đó ly tâm
ở 4
o
C, tốc độ 10000 v/p, thu kết tủa và hòa tan trong đệm.
Tiến hành chạy sắc ký trao đổi ion DEAE – Sepharose fast flow trên
hệ thống FPLC. Cột được cân bằng với đệm Tris – HCl 20 mM pH 7,6, tốc
độ 0,5ml/phút, dung dịch đệm đẩy là gradient NaCl 0 – 500mM, tốc độ
đẩy enzym là 0,3ml/ phút, thu 2 ml/ phân đoạn

Hình 3.4. Kết quả tinh sạch β-galactosidaza bằng phương pháp FPLC

Sản phẩm protein enzym thu được thể hiện ở 5 đỉnh (ký hiệu từ 1 –
5) trên sắc ký đồ, nhưng chỉ duy nhất sản ph
ẩm protein enzym thu tại đỉnh
số 2 (vị trí F2) có hoạt tính β-galactosidaza với hoạt độ là 5800 MU/ml.
Chúng tôi tiến hành chạy điện di trên gel polyacrylamit SDS – PAGE để
kiểm tra độ tinh sạch của protein enzym.
Xác định khối lượng phân tử và mức độ tinh sạch của protein β-

45
35
25
18,4
14,4
109 kDa
kDa
116116
66,266,2
4545
3535
18,418,4
14,414,4
109
kDa
116116
66,266,2
4545
3535
2525
18,418,4
14,414,4
109 kDa
kDa
116116
66,266,2
4545
3535
18,418,4
14,414,4

tinh sạch
Hoạt độ
tổng
(MU)
Hàm
lượng
protein
tổng số
(mg)
Hoạt độ
riêng
(MU/mg
protein)
Hiệu suất
thu hồi
(%)
Mức độ
tinh s
ạch
(lần )
1
Tách chiết
enzym thô
363 600 24 270 14,98 100,00 1,00
2
Kết tủa enzym
bằng axeton
155 310 1 280 121,33 42,71 8,10
3
Sắc ký trao đổi

trong các ống ở bước sóng 620 nm. pI của enzym có giá trị bằng pH của
dịch trong ố
ng nghiệm cho độ đục cao nhất. Độ đục của dịch lớn nhất ở pH
5,5. Như vậy cũng như các protein β-galactosidaza vi sinh vật khác, β-
galactosidaza A. oryzae 3 có pI mang tính axit với giá trị là 5,5.

Bảng 3.11. Khảo sát điểm đẳng điện của β-galactosidaza
từ A. oryzae 3

pH OD
620

4 0,257
4,5 0,318
5 0,363
5,5 0,471
6 0,289
6,5 0,234
7 0,183

3.5.2. Ảnh hưởng của pH tới hoạt tính của β-galactosidaza pH tối ưu của β-galactosidaza được xác định bằng phản ứng với cơ
chất oNPG nồng độ 20μM ở các ngưỡng pH khác nhau từ 2 - 9 tại nhiệt độ
55°C, đo OD ở bước sóng 420nm. Kết quả thu được ở vùng pH từ 5,0 đến
7,0 hoạt tính enzym khá cao, cao nhất là ở pH 5 hoạt tính enym là 1562,40
MU/g. Như vậy, pH tối ưu cho β-galactosidaza của A. oryzae 3 là 5.

Tương tự, dịch enzym được giữ ở các pH khác nhau tại nhiệt độ là

o
C, 50
o
C,
60
o
C, 70
o
C ở pH 5 trong khoảng thời gian là 4 giờ, sau 30 phút lại lấy mẫu
xác định hoạt độ và xác định được hoạt tính β-galactosidaza cao ở dải nhiệt
độ từ 40 – 60
o
C, cao nhất là tại nhiệt độ 55
o
C (1596,40 MU/g).
Hình 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới độ bền
của β-galactosidaza từ A. oryzae 3
Tuy nhiên, nhiệt độ càng cao enzym càng nhanh giảm hoạt độ. Ở
nhiệt độ 30°C, sau 4 giờ enzym chỉ còn giữ khoảng 40% hoạt độ. Ở 40-
60°C, sau 4 giờ, hoạt độ enzym chỉ còn khoảng 28-36%. Riêng ở 70°C chỉ
sau 2,5 giờ hoạt độ là 0%. Như vậy enzym này hoạt động tối ưu ở 55

Bảng 3.12. Kết quả xác định ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính
β-galactosidaza từ A. oryzae 3

Ion kim loại
(2.10
-3
M)
Hoạt độ β-galactosidaza
tương đối (%)
Đối chứng 100,00
Zn
2+
68,80
Fe
2+
72,68
Mg
2+
124,24
Ca
2+
127,59
Ba
2+
132,07
Mn
2+
139,40

Chúng tôi xác định hoạt tính β-galactosidaza bằng cách cho phản ứng

-3
M ion kim loại, hoạt tính β-
galactosidaza chỉ còn khoảng 70%
3.5.5. Khảo sát động học β-galactosidaza từ A. oryzae 3 ( K
m
, V
max
)
Chúng tôi tiến hành khảo sát với các nồng độ oNPG khác nhau: 1mM,
2mM, 3mM, 4mM và 5mM và thu được vận tốc phản ứng ở bảng 3.13.
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất oNPG
đến vận tốc phản ứng β-galactosidaza

Nồng độ cơ chất
oNPG (mM/ml)
Vận tốc phản ứng
( μmol/phút )
1 0,0192
2 0,0408
3 0,0616
4 0,0814
5 0,083 15
Lập hệ phương trình theo phương trình Michaelis – Menten tính K
m

và V
max

Bromophenol bromit - kìm hãm nhóm -COOH (Asp). Dùng các chất kìm
hãm EDTA, DFP, β –mercaptoethanol với nồng độ 10
-2
M ủ với enzym
trong 30 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó xác định hoạt tính của enzym. Kết
quả cho thấy với DFP, hoạt độ enzym giảm mạnh chỉ còn 23,5%, như vậy
có thể nhận thấy trong trung tâm hoạt động của β-galactosidaza có thể
chứa nhóm -OH.
Qua các kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi kết luận đã xác định
được một số đặc tính quan trọng của β-galactosidaza từ A. oryzae 3 như
ảnh hưở
ng nhiệt độ, pH, pI, các chất ức chế và hoạt hóa… và đánh giá đó
là những đặc tính rất cần thiết khi ứng dụng β-galactosidaza trong lĩnh vực
công nghiệp thực phẩm, nhất là công nghệ chế biến các sản phẩm từ sữa.
Để có thể lưu giữ dòng gen mã hóa β-galactosidaza từ A. oryzae 3 và xác
định một số tính chất của β-galactosidaza từ A. oryzae 3 bằng phương pháp
tin sinh học, chúng tôi tiến hành nghiên cứ
u tách dòng và xác định trình tự
gen lacA mã hóa sinh tổng hợp β-galactosidaza từ nấm mốc A. oryzae 3 Bảng 3.14. Khảo sát tác nhân kìm hãm
đ
ặc hi
ệ
u
trung tâm hoạt động β-galactosidaza

Tác nhân
kìm hãm (10
3.7.2. Phân tích trình tự gen lacA A. oryzae 3
Gen lacA sau khi đã tách dòng thành công vào vec tơ pGEMT-Easy
được tiến hành xác định trình tự trên máy giải trình tự ABI 3100. Trình tự
sau khi xác định được xử lý với phần mềm Vector NTI Advance 10.3. Sau
khi bỏ đi các trình tự đã biết trên vertor pGEM T-Easy, chúng tôi thu được
Tách chiết ARN tổng số từ A. oryzae 3
Thiết kế các mồi đặc hiệu để nhân đoạn cDNA
mã hóa β-galactosidaza từ A. oryzae 3
Khuếch đại cDNA mã hóa
β
-gal
bằng kỹ thuật RT-PCR
Gắn sản phẩm PCR đặc hiệu vào

1
2
3
45 6
3 kb
4 kb
3 kb
1
2
3
45 6
4 kb4 kb
3 kb3 kb
1
2
3
45 6
Hình 3.14. Sản phẩm
PCR từ các plasmid
1,2,5,7,8
Chú thích:
- 1: Thang ADN chuẩn
Abgen 1kb
- 2, 3, 4, 5, 6: sản phẩm
PCR từ các plasmit
1,2,5,7,8

17
trình tự đoạn gen lacA mã hoá β-galactosidaza có chiều dài 3015 bp, có độ
tương đồng cao nhất với gen mã hóa sinh tổng hợp β-galactosidaza có ký

(a) (b)
Hình 3.19. Cấu trúc không gian dự đoán của
β-galactosidaza A. oryzae 3
a. Cấu trúc dạng dải băng b. Cấu trúc dạng bề mặt phân tử.

18
Kết quả xác định này phản ánh những đặc điểm cấu trúc của enzym
tốt hơn và giúp cho việc tìm hiểu những mối quan hệ tiến hóa giữa β-
galactosidaza A. oryzae 3 với các β-galactosidaza vi sinh vật khác.
3.8. Khảo sát các điều kiện thích hợp cho phản ứng transgalactozyl
lactoza tạo galactooligosaccarit (GOS)
3.8.1. Ảnh hưởng của nồng độ β-galactosidaza A. oryzae 3 đến khả
năng transgalactozyl lactoza tạo GOS
Sau khi tiến hành phản ứng transgalactozyl lactoza sử dụng β-
galactosidaza A. oryzae 3 với các nồng độ khác nhau, tiến hành sắc ký và
thu được kết quả tại hình 3.20. Căn cứ vào kết quả định tính, chúng tôi
nhận thấy ở nồng độ enzym là 7U/ ml cơ chất, sản phẩm GOS thu được
khá đậm màu và sản phẩm đường đơn không nhiều so với các sản phẩm
của nồng độ enzym cao hơn, do vậy nồng độ enzym là 7U/ml c
ơ chất được
lựa chọn trong các nghiên cứu tiếp theo. 3.8.2. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lactoza đến khả năng thực hiện
phản ứng transgalactozyl của β-galactosidaza A. oryzae 3
Chúng tôi tiến hành phản ứng transgalactozyl lactoza ở các nồng độ
lactoza khác nhau là 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%. Dịch được bổ
sung β-galactosidaza với nồng độ là 7U/ml cơ chất, quá trình phản ứng
được thực hiện ở đ
iều kiện 55

ở những
băng màu đậm dần. Khi nồng độ cơ chất nằm trong khoàng từ 60 – 80 %,
các sản phẩm GOS thu được cho dải phân tích định tính đậm màu hơn hẳn
và hầu như không khác nhau nhiều, như vậy, nồng độ lactoza được chọn là
60% (w/v).
3.8.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH tới khả năng transgalactozyl lactoza
tạo GOS của β-galactosidaza A. oryzae 3
Để đảm bảo hiệu suất transgalactozyl lactoza tạo GOS, chúng tôi
khả
o sát ảnh hưởng pH của dịch cơ chất đến khả năng transgalactozyl
lactoza của β-galactosidaza. Kết quả cho thấy tại pH từ 5-6, quá trình
transgalactozyl lactoza cho sản phẩm GOS khá đậm nét, tuy nhiên tốt nhất
tại pH là 5,5 (Hình 3.22). Chúng tôi quyết định chọn pH 5,5 là pH thích
hợp cho quá trình transgalactozyl lactoza tạo GOS.

Hình 3.22. Ảnh hưởng của pH
môi trường đến phản ứng
transgalactozyl tạo GOS
Chú thích:
- M: là các chất chuẩn theo thứ
tự lần lượt glucoza, galactoza,
lactoza, galactotetraoza
- 4,5 ; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,5: pH
môi trường

Lac
Glu
Gal
G4
GOS

đậm nét hơn hẳn và thể hiện rõ nhất ở nhiệt độ 55
o
C. Như vậy, nhiệt độ
thích hợp cho phản ứng transgalactozyl lactoza thu GOS là 55
o
C.
3.8.5. Khảo sát thời gian transgalactozyl lactoza tạo GOS của β-
galactosidaza từ A. oryzae 3
Để xác định thời gian tối ưu cho quá trình transgalactozyl lactoza thu
GOS, chúng tôi tiến hành khảo sát phản ứng với các thời gian khác nhau:
3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 giờ. Kết quả cho thấy ở khoảng thời gian từ 3 – 5 giờ, sản
phẩm GOS tạo thành không nhiều so với khoảng thời gian từ 6 – 9 giờ, ở
thời điểm 8 giờ sản phẩm GOS thu được những bă
ng màu đậm và rõ nét
nhất (hình3.24), như vậy thời gian thích hợp cho phản ứng transgalactozyl
lactoza tạo GOS là 8 giờ.
Hình 3.24. Ảnh hưởng của thời gian
đến phản ứng transgalactozyl tạo GOS
Chú thích:
- M: là các chất chuẩn theo thứ
tự lần lượt glucoza, galactoza,
lactoza, galactotetraoza
- 9; 8; 7; 6; 5; 4; 3: thời gian
phản ứng (giờ)

GOSGOS
GOS
G4
GOS
G4


Sơ đ
ồ
2. Qui trình thu nhận Galactooligosaccari
t
t
ừ lactoza b
ằ
ng phương
pháp transgalactozyl lactoza nhờ β-galactosidaza từ A. oryzae 3.

Mi nut es
0 10 20 30 40 50 60
V
o
lt
s
0
5
10
galactose + glucose 5.675
lactose 9.592
12.250
17.400

Đơn vị
tính
Kết
quả
Phương pháp xác
định
1 Hàm lượng lactoza % 20,12 HPLC
2 Hàm lượng galactoza % 8,50 HPLC
3
Hàm lượng
galactotetraoza
%
1,20 HPLC
Thí nghiệm phân tích định lượng bằng HPLC cho thành phần của các
loại đường trong sản phẩm GOS như sau: lactoza 20,12%; galactoza 8,5
%; galactotetraoza 1,20 %. Với hàm lượng cơ chất lactoza ban đầu của
phản ứng là 60%, sau phản ứng, hàm lượng lactoza còn lại được định
lượng là 20,12 % (bảng 3.17), như vậy, chúng tôi đánh giá hiệu suất
chuyển hóa của lactoza thành các đường đơn và oligosaccarit là hơn 70%.
Galactoza được định lượng là 8,5%, do trên cột NH
2
glucoza và galactoza
không phân tách nên chúng tôi dự kiến hàm lượng glucoza là xấp xỉ
galactoza, tổng sản phẩm glucoza, galactoza và lactoza sẽ chiếm 35 – 40%
trong chế phẩm GOS, còn lại khoảng 60% là các sản phẩm mới tạo thành
là galactobioza, galactotrioza, galactotetraoza, galactopentanoza và
galactohexanoza Như vậy, chế phẩm thu được có hàm lượng
oligosaccarit đạt trên 50%.
* Đánh giá độ an toàn vệ sinh thực phẩm của sản phẩm GOS
a) Kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh